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Chemistry

एकल अणु प्रोटीन अध्ययन के लिए सतह passivation

Published: April 24, 2014 doi: 10.3791/50549
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 1
1Kavli Institute of NanoScience, Department of BioNanoScience, Delft University of Technology, 2Department of Chemistry, Seoul National University

Summary

हम polyethylene glycol (खूंटी) का उपयोग कर एक गिलास सतह passivating के लिए एक विधि का वर्णन. इस प्रोटोकॉल सतह की सफाई, सतह functionalization, और खूंटी कोटिंग को शामिल किया गया. हम मौजूदा तरीकों की तुलना में passivation की बेहतर गुणवत्ता की पैदावार है, जो दो से अधिक दौर खूंटी अणुओं के साथ सतह के इलाज के लिए एक नई रणनीति का परिचय.

Abstract

एकल अणु प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी nanoscale पर जैविक घटना की एक विस्तृत श्रृंखला को समझने में सहायक सिद्ध हो गया है. इस तकनीक को जैविक विज्ञान के लिए उपज सकता है की महत्वपूर्ण उदाहरण प्रोटीन, प्रोटीन और प्रोटीन न्यूक्लिक एसिड बातचीत पर यंत्रवत अंतर्दृष्टि हैं. प्रोटीन की बातचीत एकल अणु के स्तर पर जांच कर रहे हैं, प्रोटीन या उनके substrates अक्सर एक लंबी अवधि के अवलोकन के लिए अनुमति देता है एक कांच की सतह पर स्थिर रहे हैं. इस स्थिरीकरण योजना अवांछित सतह कलाकृतियों को पेश हो सकता है. इसलिए, यह इसे निष्क्रिय करने के लिए कांच की सतह passivate करने के लिए आवश्यक है. Polyethylene glycol (खूंटी) का उपयोग कर सतह कोटिंग गैर विशेष रूप से एक कांच की सतह के साथ बातचीत से प्रोटीन को रोकने में अपने उच्च प्रदर्शन के लिए बाहर खड़ा है. हालांकि, बहुलक कोटिंग प्रक्रिया की वजह से एक सतह की जरूरत है कि सतह के उपचार की एक श्रृंखला और सख्त आवश्यकता से उत्पन्न होने वाली जटिलता को, मुश्किल हैप्रक्रिया के अंत में किसी भी फ्लोरोसेंट अणु से मुक्त हो. यहाँ, हम कदम दर कदम निर्देश के साथ एक मजबूत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. यह पिरान्हा नक़्क़ाशी, amine समूहों के साथ सतह functionalization, और अंत में खूंटी कोटिंग सहित सतह की सफाई को शामिल किया गया. एक खूंटी परत के एक उच्च घनत्व प्राप्त करने के लिए, हम उल्लेखनीय passivation की गुणवत्ता में सुधार है जो दो दौर खत्म हो गया, खूंटी अणुओं के साथ सतह के उपचार के लिए एक नई रणनीति का परिचय. किसी को उच्च गुणवत्ता की सतह passivation को प्राप्त कर सकते हैं ताकि हम प्रतिनिधि परिणाम के साथ ही एक महत्वपूर्ण कदम के लिए व्यावहारिक सलाह प्रदान करते हैं.

Introduction

एक एकल अणु प्रोटीन अध्ययन करते समय यह प्रयोग किसी भी सतह प्रेरित प्रोटीन की खराबी या विकृतीकरण 1,2 से मुक्त है कि इतने सतह passivation की एक उच्च गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. ऐसे गोजातीय सीरम albumin के रूप में surfactants, के साथ इलाज के लिए एक कांच की सतह, सामान्यतः एकल अणु न्यूक्लिक एसिड पढ़ाई 3 के लिए प्रयोग किया जाता है, इसके passivation की डिग्री प्रोटीन के अध्ययन के लिए काफी अधिक नहीं है. बहुलक (पॉलीथीन ग्लाइकोल, खूंटी) के साथ लेपित एक गिलास सतह passivation प्रदर्शन 4-6 में बेहतर है. इस प्रकार, यह एक एकल अणु प्रतिदीप्ति अध्ययन 7-10 के लिए पेश किया गया था जब से एकल अणु प्रोटीन के अध्ययन के लिए सार्वभौमिक खेतों में बन गया है. बहुलक कोटिंग प्रक्रिया कई सतह उपचार 7,11,12 की आवश्यकता है. इसलिए, यह विस्तृत निर्देश के बिना पूरी प्रक्रिया का पालन करने के लिए मुश्किल है. अक्सर सतह passivation की डिग्री है, जो प्रोटोकॉल मैं पर निर्भर करता हैएस पीछा किया. यहाँ हम एक अणु प्रोटीन के अध्ययन के प्रमुख बाधाओं में से एक को हटा देगा जो कदम दर कदम निर्देश के साथ एक मजबूत प्रोटोकॉल उपस्थित थे. अवलोकन के लिए चित्रा 1 देखें.

Protocol

1. तैयारी और सफाई स्लाइड

एक microfluidic चैम्बर एक क्वार्ट्ज स्लाइड और एक coverslip से बना है. चश्मे प्रकार कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी में, क्वार्ट्ज स्लाइड की सतह imaged है. इसलिए, यह अच्छी तरह से एच 2 ओ, एसीटोन, KOH, और पिरान्हा समाधान का उपयोग कर एक क्वार्ट्ज स्लाइड साफ करने के लिए महत्वपूर्ण है. गु बहु कदम सफाई एकल अणु प्रतिदीप्ति माप के साथ हस्तक्षेप जो एक सतह पर फ्लोरोसेंट कार्बनिक अणुओं समाप्त है. इसके अतिरिक्त, पिरान्हा नक़्क़ाशी हाइड्रॉक्सिल समूहों द्वारा पैदा क्वार्ट्ज सतह हाइड्रोफिलिक बनाता है. मुक्त हाइड्रॉक्सिल समूहों के चरण 3 में एमिनो silanization प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक हैं.

  1. ड्रिलिंग क्वार्ट्ज स्लाइड. एक 3/4 मिमी हीरे की ड्रिल बिट (चित्रा 2A) के साथ एक क्वार्ट्ज स्लाइड में छेद की एक जोड़ी ड्रिल. कई चैनलों वांछित है, तो और देहात ड्रिलआईआरएस छेद में से (चित्रा 2 बी). ये छेद चरण 7 में एक microfluidic चेंबर में समाधान इंजेक्शन लगाने के लिए उपयोग किया जाता है.
    1. ड्रिलिंग के दौरान एच 2 ओ में गीला ड्रिल बिट रखें. ड्रिल बिट का जीवनकाल बढ़ जाती है, जो एक स्नेहक के रूप में एच 2 ओ कार्य करता है.
    2. समसामयिक ड्रिल बिट की नोक पोंछते ड्रिलिंग छेद में मदद करता है.
    3. ड्रिलिंग छेद के बाद, PEGylation प्रक्रिया के दौरान आसान पहचान के लिए स्लाइड के एक तरफ निशान. मार्करों पर बाद में भ्रम की स्थिति से बचने के लिए संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. अंकन के लिए, एक हीरे की ड्रिल बिट का उपयोग किया जा सकता है. स्याही सतह पर मिल सकता है के बाद से किसी भी पेन का उपयोग न करें.
  2. एच 2 ओ के साथ सफाई एक गिलास धुंधला जार में स्लाइड रखें. आमतौर पर 5 से 15 स्लाइड एक जार में रखा जा सकता है. MilliQ एच 2 ओ के साथ स्लाइड्स कुल्ला यह 3 बार दोहराएँ और गंदगी को दूर करने के लिए 5 मिनट के लिए MilliQ एच 2 ओ के साथ स्लाइड्स sonicate. पानी निपटाने और साथ फिर से 3 बार स्लाइड्स कुल्ला130 डब्ल्यू इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया sonication शक्ति है कि MilliQ एच 2 ओ नोट. हायर sonication बिजली क्वार्ट्ज स्लाइड का जीवनकाल कम हो सकता है.
  3. एसीटोन के साथ सफाई. एसीटोन के साथ MilliQ एच 2 ओ बदलें. 20 मिनट या उससे अधिक समय के लिए एसीटोन के साथ स्लाइड्स Sonicate.
  4. एच 2 ओ के साथ rinsing एसीटोन त्यागें और MilliQ एच 2 ओ के साथ स्लाइड्स कुल्ला किसी भी एसीटोन अवशेषों को हटाने के क्रम में 3 बार के लिए यह दोहराएँ.
  5. KOH के साथ सफाई. 1 एम KOH के साथ पानी की जगह और 20 मिनट या उससे अधिक समय के लिए स्लाइड sonicate. अत्यधिक नक़्क़ाशी (जैसे रातोंरात KOH उपचार) सतह की गुणवत्ता में वृद्धि होगी, लेकिन प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकता है जो खरोंच, परिचय देंगे.
  6. एच 2 ओ के साथ rinsing KOH के निशान को दूर करने के लिए 3 बार के लिए MilliQ एच 2 ओ के साथ स्लाइड्स कुल्ला.
  7. पिरान्हा नक़्क़ाशी.
    1. एक डुरान स्लाइड धारक या एक कस्टम बनाया Teflon धारक को और पीएल स्लाइड्स स्थानांतरणएक रासायनिक हुड में स्थित है जो एक बीकर (1 एल) में उन्हें इक्का.
    2. एच 2 की 450 मिलीलीटर 4 अतः साथ बीकर भरें.
    3. अतः 4 एच 2 के बीच 3:1 के अनुपात और एच 2 ओ 2 के लिए एच 2 ओ 2 की 150 मिलीलीटर जोड़ें. समाधान अनायास फोड़ा करने के लिए शुरू होने के बाद तापमान ° पर 90 सी. बढ़ जाती है यकीन है कि एच 2 2 हे समाधान प्रतिक्रिया शुरू करने से पहले कमरे के तापमान पर है कि बनाओ. अन्यथा, उबलते समाधान का तापमान कम से कम 90 डिग्री सेल्सियस हो सकता है
    4. उचित मिश्रण के लिए समाधान हलचल और बीकर 20 मिनट तक अछूता करते हैं.
    5. एक साथ स्लाइड धारक के साथ पिरान्हा समाधान के बाहर स्लाइड ले लो, और MilliQ एच 2 ओ युक्त एक स्लाइड धारक में डाल यह कमरे के तापमान तक पहुँच जाता है एक बार इस बीच, एक नामित अपशिष्ट बोतल में पिरान्हा समाधान त्यागें.
    6. MilliQ एच 2 ओ के साथ स्लाइड्स 3 बार कुल्ला अतिरिक्त देखभाल आगे काएं में लिया जाना चाहिएस्लाइड्स के किसी भी संभावित संक्रमण से बचने के पी एस. चरण 3 में जारी. यह तुरंत निम्न चरणों के साथ आगे बढ़ने की सलाह दी है.
      * सावधानी: पिरान्हा समाधान अत्यंत प्रतिक्रियाशील है. इस समाधान से निपटने जब अतिरिक्त सावधानी से लिया जाना चाहिए. इसके अलावा, जब इस तरह के एसीटोन के रूप में कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ मिश्रित गलती से, यह एक विस्फोट का कारण हो सकता है.

2. Coverslip सफाई

एक microfluidic चैम्बर एक क्वार्ट्ज स्लाइड और एक कवर के होंठ से बना है. एक चश्मे प्रकार TIRF माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया गया है, जब एक coverslip की सतह imaged नहीं है. इसलिए, यह केवल एच 2 हे और कोह साथ एक coverslip साफ करने के लिए पर्याप्त है. मामले में एक coverslip (वस्तुनिष्ठ प्रकार TIRF माइक्रोस्कोपी के माध्यम से उदाहरण के लिए) imaged होने की जरूरत है, यह पिरान्हा समाधान (1.7 कदम) के साथ coverslips के इलाज के लिए सिफारिश की है. Coverslip सतह के PEGylation उच्च गुणवत्ता की नहीं है, यह प्रोटीन के लिए एक सिंक के रूप में कार्य हो सकता है ध्यान दें कि एकप्रोटीन एकाग्रता में बदलाव को जन्म दे चाहते हैं.

  1. एच 2 ओ के साथ rinsing प्लेस coverslips एक गिलास धुंधला जार में (24 x 30, 24 x 40, या 24 x 50 मिमी 2). आमतौर पर 5 से 15 coverslips एक जार में रखा जा सकता है. MilliQ एच 2 ओ के साथ coverslips 3 बार कुल्ला
  2. KOH के साथ सफाई. 1M KOH के साथ पानी की जगह और 20 मिनट या उससे अधिक समय के लिए coverslips sonicate.
  3. एच 2 ओ के साथ rinsing KOH के निशान को दूर करने के लिए MilliQ एच 2 हे के साथ coverslips 3 बार कुल्ला. चरण 3 में जारी.

स्लाइड्स और coverslips के 3. एमिनो silanization

एमिनो silanization रसायन शास्त्र के माध्यम से क्वार्ट्ज स्लाइड और amine समूह के साथ coverslips की सतह functionalizing. मेथनॉल एमिनो silanization प्रतिक्रिया के लिए एक उत्प्रेरक के रूप में एक विलायक और एसिटिक एसिड के रूप में प्रयोग किया जाता है.

  1. मेथनॉल के साथ rinsing. एस से धुंधला बर्तन में MilliQ एच 2 ओ (बदलेंteps 1 और 2) मेथनॉल के साथ. 3.3 कदम जब तक मेथनॉल में स्लाइड और coverslips रखें. मेथनॉल में दोष के बाद से समय की एक अनावश्यक रूप से लंबी अवधि (जैसे कई घंटे) के लिए मेथनॉल में स्लाइड और coverslips दुकान मत करो सतह को सोखना जाएगा.
  2. एमिनो silanization समाधान की तैयारी.
    1. मेथनॉल के साथ एक Pyrex कुप्पी कई बार कुल्ला. 5 मिनट या उससे अधिक समय के लिए मेथनॉल के साथ कुप्पी Sonicate. यह स्वच्छ बनाए रखा है कि एक समर्पित कुप्पी है की सलाह दी है.
    2. फ्लास्क में मेथनॉल के 100 मिलीलीटर डालो.
    3. एसिटिक एसिड के 5 मिलीलीटर जोड़ें.
    4. APTES के 3 मिलीलीटर (3 aminopropyl trimethoxysilane) जोड़ें और धीरे यह झटकों से मिश्रण.
  3. एमिनो silanization. Aminosilanization प्रतिक्रिया मिश्रण के साथ स्लाइड और coverslips होते हैं कि धुंधला बर्तन में मेथनॉल बदलें.
    1. 20-30 मिनट के लिए सेते हैं. ऊष्मायन के दौरान, एक बार 1 मिनट के लिए sonicate.
  4. मेथनॉल के साथ rinsing. एक बदलेंमेथनॉल के साथ minosilanization प्रतिक्रिया. मेथनॉल त्यागें और एक ताजा मेथनॉल समाधान जोड़ने. इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराएँ.

पॉलिमर (पहले दौर) का उपयोग 4. सतह passivation

एनएचएस एस्टर polyethylene glycol (खूंटी) conjugating द्वारा क्वार्ट्ज स्लाइड और coverslips के amine लेपित सतह passivating. यह प्रतिक्रिया रातोंरात पीएच 8.5 पर खूंटी समाधान के saturating एकाग्रता के साथ किया जाता है.

  1. स्लाइड और coverslips सुखाने. एन 2 गैस का उपयोग कर स्लाइड और coverslips सूखी और पक्ष PEGylated सामना करना पड़ रहा है हो गया है जो कि इस तरह से साफ पिपेट बक्से में उन्हें जगह है. पिपेट बॉक्स आंशिक रूप से MilliQ एच 2 ओ से भर जाता है यह नम वातावरण रात ऊष्मायन के दौरान बाहर सुखाने से PEGylation समाधान रोकता है.
  2. प्रतिक्रिया बफर तैयारी. के 10 एमएल में सोडियम बाइकार्बोनेट के 84 मिलीग्राम भंग करके नए सिरे से सोडियम बाइकार्बोनेट बफर (8.5 पीएच) के 0.1 एम तैयार करेंMilliQ एच 2 ओ पीएच को एडजस्ट करने की कोई जरूरत नहीं है. यह समाधान अगले उपयोग (जैसे कदम 6.1) के लिए जमे हुए संग्रहीत किया जा सकता है.
  3. PEGylation समाधान की तैयारी.
    1. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में एनएचएस एस्टर खूंटी एनएचएस एस्टर एमपीईजी (5,000 दा) के (5000 दा) 13 और 8 मिलीग्राम biotinylated 0.2 मिलीग्राम की एक खूंटी मिश्रण तैयार करें. स्लाइड्स के एन संख्या तैयारी, एक ट्यूब में खूंटी मिश्रण के एन बार बड़ी राशि तैयार करते हैं.
    2. 64 μl (या एन बार स्लाइड्स के एन संख्या के लिए 64 μl) हौसले से तैयार बफर (4.2 कदम) के जोड़ें. उन्हें पूरी तरह से भंग करने के क्रम में यह ऊपर और नीचे पिपेट.
    3. हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए 1 मिनट के लिए 16,100 XG साथ अपकेंद्रित्र. बाद में पिपेट मत करो. अन्यथा, हवाई बुलबुले चरण 4.4 पर PEGylation के साथ हस्तक्षेप जो बनेगी.
  4. PEGylation.
    1. 4.1 कदम से एक सूखे क्वार्ट्ज स्लाइड पर PEGylation मिश्रण के 70 μl गिरा. 24 x 50 मिमी 2 cov के मामले में 90 μl का प्रयोग करेंerslip.
    2. धीरे समाधान पर 4.1 कदम से एक सूखे coverslip जगह.
    3. , PEGylation के एक समान और उच्च गुणवत्ता के लिए हवाई बुलबुले परिचय नहीं ख्याल रखना. कारण सतह तनाव के लिए, हवा के बुलबुले के सबसे अनायास तनाव के कारण सतह पांच मिनट के भीतर प्रतिक्रिया मात्रा छोड़ सकते हैं.
    4. एक अंधेरे और उमस भरे वातावरण में स्लाइड्स सेते हैं. हम पीएच 8 में उपयोग कि एनएचएस एस्टर खूंटी के आधे जीवन के बारे में एक घंटे की है. कम से कम, 2 घंटे के लिए उन्हें सेते हैं. रात ऊष्मायन PEGylation (नहीं दिखाया डेटा) की उच्च गुणवत्ता की ओर जाता है.

5. लंबी अवधि के भंडारण

-20 डिग्री सेल्सियस पर PEGylated स्लाइड और एन 2 में coverslips के संचय

  1. स्लाइड और coverslips सुखाने. ध्यान से, एक तरफ करने के लिए coverslip फिसलने से स्लाइड और coverslip जुदा MilliQ एच 2 ओ के साथ उन्हें कुल्ला, और एन 2 के साथ उन्हें सूखी.
  2. स्लाइड और coverslips भंडारण. एफओआर तत्काल उपयोग, PEGylation (6) के दूसरे दौर के लिए प्रक्रिया का पालन करें. समय की एक लंबी अवधि के लिए स्टोर करने के लिए, अगले चरणों का पालन करें.
    1. PEGylated सतहों एक दूसरे से दूर सामना कर रहे हैं कि इस तरह के एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्लाइड और coverslip की एक जोड़ी रखें.
    2. आंशिक रूप से, ट्यूब बंद ट्यूब निर्वात, और फिर 2 एन के साथ भरें. ये कदम समय की एक लंबी अवधि के लिए PEGylated सतह के संरक्षण में मदद. कसकर ट्यूब भाड़ और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान स्लाइड्स की गुणवत्ता (सही, चित्रा 3 ए) के लिए 3 महीने के लिए अच्छा रहता है.

पॉलिमर (दूसरे दौर) का उपयोग करना 6. सतह passivation

खूंटी परत सघन बनाने के लिए और भी सतह पर किसी भी शेष amine समूहों बुझाने के PEGylation के अतिरिक्त दौर. कम एनएचएस एस्टर खूंटी अणुओं (333 दा) का उपयोग एक मौजूदा खूंटी परत में प्रवेश करने में प्रभावी हो सकता है. यह आरईसी हैसही एक स्लाइड उपयोग करने से पहले PEGylation के इस दूसरे दौर ऐसा करने के लिए ommended.

  1. प्रतिक्रिया बफर तैयारी. ताजा सोडियम बाइकार्बोनेट बफर (8.5 पीएच) के 0.1 एम तैयार करें. 4.2 कदम से जमे हुए समाधान का भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. PEGylation समाधान की तैयारी. सोडियम बाइकार्बोनेट बफर के 63 μl में 250 मिमी MS4 खूंटी के 7 μl भंग.
  3. PEGylation. चरण 4.4 में के रूप में एक ही प्रक्रिया का पालन करें. रात भर के लिए 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  4. स्लाइड और coverslips सुखाने. स्लाइड की जोड़ी और coverslip जुदा, MilliQ एच 2 ओ के साथ उन्हें कुल्ला एन 2 के साथ उन्हें सूखी, और एक स्वच्छ पिपेट बॉक्स में रख. चरण 7 में एक microfluidic चैम्बर कोडांतरण के लिए आगे बढ़ें.

7. एक microfluidic चैंबर कोडांतरण

एक PEGylated क्वार्ट्ज स्लाइड की एक जोड़ी और एक coverslip का उपयोग कर एक microfluidic चैम्बर कोडांतरण. दो तरफा चिपचिपा टेप एक स्पेसर के रूप में प्रयोग किया जाता है. चैम्बर तो, epoxy गोंद के साथ बंद और हैlutions क्वार्ट्ज स्लाइड में छेद के माध्यम से पेश कर रहे हैं.

  1. PEGylated पक्ष का सामना करना पड़ के साथ एक फ्लैट सतह पर एक क्वार्ट्ज स्लाइड रखें.
  2. स्लाइड पर दो तरफा चिपचिपा टेप डाल द्वारा तिरछे PEGylated सतह पर एक चैनल (7 मिमी चौड़ाई 5) बनाते हैं. छेद चैनल के केंद्र में तैनात कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें. एक कक्ष बनाने की प्रक्रिया के दौरान PEGylated सतह को खराब करने के लिए नहीं ख्याल रखना. यह (देखें चित्र 2) रखने और अलग ढंग से दो तरफा चिपचिपा टेप चिपका कर एक मल्टी चैनल स्लाइड बनाने के लिए संभव है.
  3. धीरे चैम्बर को पूरा करने के लिए शीर्ष पर एक PEGylated coverslip जगह. PEGylated नीचे की ओर का सामना करना पड़ जाना चाहिए.
  4. दो तरफा टेप रखा जाता है जहां क्षेत्र पर coverslip दबाकर चैम्बर सील. चैम्बर पानी कसकर बंद हो जाता है तो धीरे लेकिन यह अच्छी तरह से करते हैं.
  5. Epoxy गोंद के साथ कक्ष के किनारों को बंद करें.
  6. पर Streptavidin या Neutravidin स्थिरएक P200 पिपेट का उपयोग T50 में Streptavidin या Neutravidin समाधान (10 मिमी Tris-एचसीएल [pH8.0], 50 मिमी NaCl बफर) के 0.1 मिलीग्राम / एमएल के 50 μl जोड़कर biotinylated खूंटी परत. बाद T50 बफर के 100 μl के साथ फ्लश ऊष्मायन के 1 मिनट,.
  7. अपने एकल अणु इमेजिंग के लिए biotinylated जैविक अणुओं जोड़ें.

8. पुनर्चक्रण स्लाइड

क्वार्ट्ज स्लाइड पुनर्चक्रण. खेतों में स्लाइड्स coverslips और दो ​​तरफा चिपचिपा टेप बंद लेने से साफ कर रहे हैं.

  1. प्रयोग करने के बाद, पानी के नल में कक्षों की दुकान. पानी में लंबे समय तक ऊष्मायन कक्षों के disassembly आसान बनाता है.
  2. एक माइक्रोवेव का उपयोग पानी के नल में कक्षों उबाल लें. एक Pyrex बीकर का प्रयोग करें. 10 मिनट या उससे अधिक समय के लिए उबाल लें.
  3. एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर coverslips और दो तरफा चिपचिपा टेप उतारो. अपने विमान को सीधा एक क्वार्ट्ज स्लाइड प्रेस न करें. अन्यथा, यह टूट जाता है. दूर चैनल से धार रखें. ओ.टी.herwise, यह चैनल पर खरोंच का परिचय.
  4. उंगलियों के साथ उन्हें रगड़ से एक घरेलू डिटर्जेंट का उपयोग कर स्लाइड कुल्ला.
  5. एक गिलास धुंधला जार में स्लाइड रखें. आमतौर पर 5 से 15 स्लाइड एक जार में रखा जा सकता है. 10% घरेलू डिटर्जेंट जोड़ें और 20 मिनट या उससे अधिक समय के लिए स्लाइड sonicate. टैब पानी की एक बड़ी मात्रा के साथ स्लाइड्स कुल्ला.
  6. 1.2 चरण पर जाएँ.

Representative Results

Microfluidic कक्ष विधानसभा के बाद (7.1 कदम - 7.6) और चरण 7.7 बाहर ले जाने से पहले, यह PEGylated सतह की गुणवत्ता नियंत्रण से बाहर ले जाने की सलाह दी है.

सतह passivation सफलतापूर्वक किया गया है, तो कम से कम 10 गैर विशेष रूप से 1-10 एनएम fluorescently लेबल प्रोटीन चेंबर में (बाएं चित्रा 3 ए) जोड़ा जाता है जब मनाया इमेजिंग क्षेत्र (x 25 मिमी 25 मिमी) प्रति प्रोटीन adsorbed रहे हैं.

सफाई या प्रतिक्रिया के किसी भी कदम ठीक से बाहर नहीं किया गया है, जब गैर विशेष रूप से की संख्या काफी बढ़ जाती है प्रोटीन adsorbed, और सीसीडी स्क्रीन प्रतिदीप्ति संकेतों से संतृप्त किया जा सकता है. पिरान्हा नक़्क़ाशी को छोड़ दिया जाता है, तो उदाहरण के लिए, मनाया गैर विशिष्ट सोखना का 100 बार एक बड़ी राशि है (चित्रा 3A, मध्यम के साथ छोड़ दिया तुलना). दूसरी PEGylation कदम को छोड़ दिया जाता है, लगभग 3 समय थाSA गैर विशिष्ट सोखना मनाया की बड़ी राशि (चित्रा 3 बी). समय सीमा समाप्त हो रसायनों (जैसे APTES कई महीनों के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित) (नहीं दिखाया डेटा) का उपयोग किया जाता है जब PEGylation के एक डिग्री कम मनाया जाता है. समय का एक महत्वपूर्ण राशि यह PEGylated था के बाद से पारित कर दिया गया जब सतह की गुणवत्ता भी नीचे चला जाता है (चित्रा 3 ए, अधिकार के साथ छोड़ दिया तुलना).

हमारे सबसे अच्छा ज्ञान करने के लिए, यह PEGylation के दो दौर एकल अणु के अध्ययन के लिए पेश कर रहे हैं कि पहली बार है. PEGylation के दो दौर खूंटी परत गठन (चित्रा 3 बी) के उच्चतम गुणवत्ता की गारंटी. डबल PEGylation की बेहतर प्रकृति प्रमुखता (मूवी 1 बी के साथ फिल्म 1 ए) की तुलना फिल्मों में दिखाया जाता है. इन फिल्मों में, समाधान में फ्लोरोसेंट अणु से पृष्ठभूमि संकेतों डबल PEGylation था जब काफी कमजोर होने के लिए मनाया जाता है प्रोटीन दोगुना pegylated परत से अधिक प्रभावी ढंग से repelled हैं कि जो इंगित करता है, का इस्तेमाल किया. इस दो कदम प्रक्रिया दृढ़ता से सलाह दी है हालांकि अपने प्रयोग गैर इष्टतम passivation करने के लिए संतोषजनक है, तो दूसरी PEGylation कदम को छोड़ दिया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1:. सतह उपचार के योजनाबद्ध (एक) एक खुर्दबीन स्लाइड एसीटोन, KOH, और पिरान्हा समाधान के साथ साफ किया जाता है. यह एनएचएस एस्टर खूंटी के साथ APTES और PEGylated साथ क्रियाशील है. यदि आवश्यक हो, (ख) एक coverslip पिरान्हा समाधान के साथ KOH, साथ ही साथ साफ किया जाता है. यह एनएचएस एस्टर खूंटी के साथ APTES और PEGylated साथ क्रियाशील है.

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चित्रा 2:. Microfluidic कक्ष (क) एक एकल चैनल चैंबर. खुर्दबीन स्लाइड drilled दो छेद है. यह एक दो तरफा चिपचिपा टेप के दो स्लाइस का उपयोग कर एक coverslip साथ इकट्ठा किया है. (ख) एक तीन चैनल चैंबर. खुर्दबीन स्लाइड drilled छह छेद है. यह एक दो तरफा चिपचिपा टेप के चार स्लाइस का उपयोग कर एक coverslip साथ इकट्ठा किया है.

चित्रा 3
चित्रा 3: समाधान में डाई लेबल प्रोटीन के साथ लिया सीसीडी छवियों. (क) सीसीडी छवियों समाधान में 10 एनएम Cy3-labeld प्रतिनिधि के साथ एक 60x उद्देश्य लेंस का उपयोग चश्मे प्रकार कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा उठाए गए थे. (बाएं) सतह के इस लेख में प्रोटोकॉल के बाद तैयार किया गया था. (मध्य) एक सतह prepa थाइस लेख में प्रोटोकॉल के बाद लाल, लेकिन पिरान्हा नक़्क़ाशी को छोड़ दिया गया था. (दाएं) सतह के इस लेख में प्रोटोकॉल के बाद तैयार किया है और नाइट्रोजन के तहत -20 डिग्री सेल्सियस पर 3 महीने के लिए जमा हो गया था. (ख) के घोल में 10 एनएम Cy3-labeld प्रतिनिधि के साथ लिया सीसीडी छवियों. (बाएं) सतह के इस लेख में प्रोटोकॉल के बाद तैयार किया गया था. (दाएं) सतह के इस लेख में प्रोटोकॉल के बाद तैयार किया गया था, लेकिन PEGylation के दूसरे दौर को छोड़ दिया गया था. स्केल बार = 5 माइक्रोन.

मूवी 1: समाधान में डाई लेबल प्रोटीन के साथ लिया सीसीडी फिल्में. सीसीडी फिल्में समाधान में 10 एनएम Cy3-labeld प्रतिनिधि के साथ एक 60x उद्देश्य लेंस का उपयोग चश्मे प्रकार कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा उठाए गए थे. समय संकल्प 100 मिसे है. (क) एक सतह के इस लेख में प्रोटोकॉल के बाद तैयार किया गया था. (ख) एक सतह के इस लेख में प्रोटोकॉल के बाद तैयार किया गया था, लेकिन PEGyl के दूसरे दौर मेंसमझना छोड़ दिया गया था. यहां क्लिक मूवी 1A देखने और करने के लिए यहाँ क्लिक मूवी 1B देखने के लिए.

Discussion

इस प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम

यह एमिनो silanization प्रतिक्रिया से पहले सतह हाइड्रोफिलिक बनाने के लिए आवश्यक है. यह एक गिलास / क्वार्ट्ज सतह पर मुक्त हाइड्रॉक्सिल समूहों उत्पन्न करता है जो पिरान्हा नक़्क़ाशी के माध्यम से हासिल की थी. यह धीरे - धीरे नीचे चला जाता है सतह के hydrophilicity के बाद से समय की एक लंबी अवधि के लिए एच 2 हे या हवा या तो उजागर करने के लिए पिरान्हा etched सतह रखने के लिए नहीं की सिफारिश की है.

एनएचएस एस्टर खूंटी अणुओं प्रतिक्रियाशील रहे हैं. यह -20 डिग्री सेल्सियस में aliquots बनाने और नाइट्रोजन के तहत उन्हें स्टोर करने की सलाह दी है कमरे के तापमान पर APTES रसायन के शेल्फ जीवन छोटा है. यह हर महीने एक नया एक से बदलने की सलाह दी है.

इस प्रोटोकॉल का संशोधन

आप किसी भी व्यावहारिक कारण के लिए पिरान्हा नक़्क़ाशी उपयोग नहीं कर सकते हैं, तो आप समय की एक लंबी अवधि के लिए KOH का उपयोग खोदना सकता है (जैसे हेvernight), जो भी हाइड्रॉक्सिल समूहों उजागर कर देगा. इस वैकल्पिक दृष्टिकोण का ख़तरा स्लाइड गंभीर खरोंच के कारण कुछ recycles के बाद बेकार हो जाता है.

यह अक्सर फ्लोरोसेंट कार्बनिक पदार्थों 7 को नष्ट करने में प्रभावी है जो प्रोपेन मशाल का उपयोग कर एक गिलास / क्वार्ट्ज सतह को जलाने के लिए अभ्यास किया है. यह पिरान्हा नक़्क़ाशी के लिए बेमानी है क्योंकि यह प्रक्रिया इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं किया गया. इस प्रक्रिया के संभावित हाइड्रॉक्सिल समूहों के ऑक्सीकरण को बढ़ावा मिलेगा ध्यान दें. एक सतह KOH या पिरान्हा समाधान का उपयोग etched गया था इसलिए, एक बार इस प्रक्रिया से बाहर किया जा नहीं करना चाहिए.

7 से कम पीएच के साथ एक बफर एकल अणु इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है, खूंटी की रचना passivation की डिग्री कम कर देता है जो "ब्रश," को "मशरूम" से बदल जाता है. 7.0 से कम पीएच प्रयोग किया जाता है इसलिए, जब यह आगे disuccinimidyl tartarate <उपयोग कर सतह passivate करने की सिफारिश की हैसमर्थन> 7.

परिप्रेक्ष्य

इस काम के लिए उच्च गुणवत्ता की सतह passivation को प्राप्त करने के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल प्रदान की गई है. इस प्रोटोकॉल प्रोटीन 14 के साथ ही सेल के अर्क के भीतर प्रोटीन परिसरों के साथ शामिल है और 15 immunoprecipitates रहे हैं कि एकल अणु प्रतिदीप्ति अध्ययन के लिए उपयोगी हो जाएगा. यह व्यापक रूप से इस तरह के बल स्पेक्ट्रोस्कोपी और टोक़ स्पेक्ट्रोस्कोपी के रूप में 16 अन्य एकल अणु तकनीक के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. यह भी एक सतह से 17 adsorbing से कोशिकाओं को रोकने के लिए उपयोगी हो जाएगा.

इस काम में प्रदान प्रोटोकॉल अपनी बहु कदम प्रक्रियाओं के लिए मांग की है. लिपिड खूंटी 8 और पाली lysine खूंटी 9 का उपयोग कर सतह passivation एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में उपलब्ध हैं. चूंकि, वे इसे लागू करने के लिए आसान है किसी भी रासायनिक प्रतिक्रियाओं की आवश्यकता नहीं है. हालांकि, passivation की डिग्री रासायनिक modif के माध्यम से हासिल की है कि उच्च के रूप में नहीं हैएक सतह के ication.

Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

एसडीसी, ACH, और मुख्य न्यायाधीश यूरोपीय अनुसंधान परिषद के माध्यम से अनुदान (ईआरसी STG-2012-309509) शुरू द्वारा समर्थित थे. जे-एम.एन. कोरिया की नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) (2011-0018198) द्वारा समर्थित किया गया था; और कोरिया के एनआरएफ के माध्यम से अग्रणी अनुसंधान केंद्र कार्यक्रम (2012-009586) विज्ञान, सूचना एवं संचार प्रौद्योगिकी मंत्रालय, और भविष्य की योजना (MSIP) द्वारा वित्त पोषित. यह काम भी ग्लोबल फ्रंटियर परियोजना (एच GUARD_2013-M3A6B2078947) के रूप में कोरिया की MSIP द्वारा वित्त पोषित BioNano स्वास्थ्य रक्षक के लिए केंद्र द्वारा समर्थित किया गया. YKL और जे-एचएच सियोल शहर, कोरिया के सियोल विज्ञान फैलोशिप प्रोग्राम द्वारा समर्थित थे. लेबल प्रतिनिधि प्रोटीन डा. Sua म्योंग से एक उदार उपहार था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Slide preparation and cleaning
Acetone Sigma 32201 1 L
Coverslips VWR 631-0136 631-0144 631-0147 24 x 32 mm2, 22 x 40 mm2, 24 x 50 mm2  (No.1½, Rectangular)
Diamond drill bits MTN-Giethoorn, The Netherlands LA-0564-00DB 3/4 mm
Duran slide holder LGS, The Netherlands 213170003
Glass staining dishes Fisher Scientific 300101
H2O2 Boom 6233905 1 L, hydrogen peroxide 30%.
Opened bottles should be stored at 4 °C.
H2SO4 Boom 80900627.9010 Sulfuric acid 95-98%
KOH Sigma 30603 Potassium hydroxide
Methanol Sigma 32213 1 L
Sonicator Branson Tabletop ultrasonic cleaner, 3510
Quartz slides Finkenbeiner 1” x 3”, 1 mm thick
2. Coverslip cleaning
Duran slide holder LGS, The Netherlands 213170003
KOH Sigma 30603 Potassium hydroxide
Sonicator Branson Tabletop ultrasonic cleaner, 3510
3. Amino-silanization of slides and coverslips
Acetic acid Sigma 320099-500ML Acetic acid, glacial
APTES Sigma-Aldrich 281778-100ML 3-aminopropyl trimethoxysilane.
Store at the room temperature under N2. Replace once in a month.
Flask (200 ml) VWR Flask (200 ml) Pyrex flask.
Have one flask dedicated for aminosilanization.
Methanol Sigma 32213 1 L
Sonicator Branson Tabletop ultrasonic cleaner, 3510
4. Surface passivation using polymer (the first round)
Biotin-mPEG Laysan Bio Biotin-PEG-SVA-5000-100mg Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 Da.
Store aliquots of 1-2 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2.
mPEG Laysan Bio MPEG-SVA-5000-1g mPEG-succinimidyl valerate (SVA), MW 5,000 Da.
Store aliquots of 80 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2.
Sodium bicarbonate Sigma S6014-500G
5. Surface passivation (the second round)
DMSO Sigma-Aldrich D8418-100ML Dimethyl sulfoxide BioReagent, for molecular biology, ≥99.9%
DST Pierce 20589 Disuccinimidyl tartarate
MS4-PEG Pierce 22341 Short NHS-ester PEG, MW 333 Da.
Dissolve 100 mg MS4-PEG in 1.1 ml DMSO. Store 20 µl aliquots at -20 °C.
Sodium bicarbonate Sigma S6014-500G
6. Assembling a microfluidic chamber
Double sticky tape Scotch 10 mm wide
Epoxy Thorlabs G14250 Devcon 5 minute epoxy
NaCl Sigma-Aldrich S9888-1 KG Sodium chloride
Neutravidin Pierce 31000 ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein.
Stock in 5 mg/ml in H2O at 4 °C.
Streptavidin Invitrogen S-888 Stock 5 mg/ml in H2O or T50 at 4 °C.
Trizma base Sigma-Aldrich T1503-1 KG Tris

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References

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रसायन विज्ञान अंक 86 एकल अणु स्पेक्ट्रोस्कोपी बहुलक polyethylene glycol (खूंटी) पिरान्हा नक़्क़ाशी एमिनो silanization सतह passivation प्रतिदीप्ति कांच की सतह कोटिंग.
एकल अणु प्रोटीन अध्ययन के लिए सतह passivation
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Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. J. Vis. Exp. (86), e50549, doi:10.3791/50549 (2014).

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