Summary
Vi beskriver ett förfarande för passivering av en glasyta med användning av polyetylenglykol (PEG). Detta protokoll omfattar ytrengöring, ytfunktionalisering, och PEG beläggning. Vi introducerar en ny strategi för att behandla ytan med PEG-molekyler över två omgångar, som ger överlägsen kvalitet på passivering jämfört med befintliga metoder.
Abstract
Single-molekyl fluorescens spektroskopi har visat sig vara avgörande för att förstå ett brett spektrum av biologiska fenomen på nanonivå. Viktiga exempel på vad denna teknik kan ge biologiska vetenskaperna är de mekanistiska insikter om protein-protein och protein-nukleinsyra interaktioner. När interaktioner mellan proteiner sonderades vid enda molekyl nivå, proteinerna eller deras substrat ofta är immobiliserad på en glasyta, som möjliggör en långsiktig observation. Denna immobilisering system kan införa oönskade ytan artefakter. Därför är det väsentligt att passivera glasytan för att göra det inerta. Ytbeläggning med användning av polyetylenglykol (PEG) utmärker sig för sin höga prestanda i att förhindra proteiner från icke-specifikt interagerar med en glasyta. Det är emellertid svårt polymerbeläggningsproceduren, på grund av komplikationer som uppstår från en serie av ytbehandlingar och stringenta krav på att en yta behövervara fri från andra fluorescerande molekyler vid slutet av förfarandet. Här ger vi en robust protokoll med steg-för-steg-instruktioner. Den täcker ytan städning inklusive piraya etsning, ytfunktionalisering med amingrupper, och slutligen PEG beläggning. För att erhålla en hög densitet av en PEG-skikt, introducerar vi en ny strategi för behandling av ytan med PEG-molekyler över två rundor, vilket anmärkningsvärt förbättrar kvaliteten av passivering. Vi erbjuder representativa resultat samt praktiska råd för varje kritiskt steg så att alla kan uppnå kvalitets ytpassivering hög.
Introduction
När du gör en enda molekyl proteinstudie är det viktigt att uppnå en hög kvalitet på ytan passivering så att experimentet är fri från alla ytor-inducerad protein fel eller denaturering 1,2. Medan en glasyta som behandlats med ytaktiva medel, såsom bovint serumalbumin, är vanligen används för enda molekyl nukleinsyra studier 3, är graden av dess passivering inte är tillräckligt hög för proteinstudier. En glasyta belagd med polymer (polyetylenglykol, PEG) är överlägsen i den passive prestanda 4-6. Därmed har det blivit allmänt används för enda molekyl proteinstudier ända sedan det infördes till en enda molekyl fluorescens studie 7-10. Den polymerbeläggning proceduren kräver flera ytbehandlingar 7,11,12. Därför är det svårt att följa hela förfarandet utan detaljerade instruktioner. Ofta graden ytpassivering varierar beroende på vilket protokoll is följde. Här presenterar vi en robust protokoll med steg-för-steg-instruktioner, vilket kommer att ta bort en av de största flaskhalsarna i enda molekyl proteinstudier. Se figur 1 för översikt.
Protocol
1. Skjut Förberedelse och rengöring
Ett mikroflödeskammaren är sammansatt av ett kvartsglas och ett täckglas. I prisma-typ total intern reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi, är ytan av kvarts slide avbildas. Därför är det viktigt att rengöra en quartz slide noggrant med H2O, aceton, KOH, och Piranha lösningar. Th är flerstegsrengöring eliminerar fluorescerande organiska molekyler på en yta, som interfererar med enda molekyl fluorescensmätningar. Dessutom gör den Piranha etsning kvarts yta hydrofil genom att generera hydroxylgrupper. De fria hydroxylgrupperna är väsentliga för amino-silanisering reaktionen i steg 3.
- Borrning kvartsglas. Borra ett par hål i en kvartsglas med en 3/4 mm diamantborr (Figur 2a). Om flera kanaler önskas, borra mer pairs hål (figur 2b). Dessa hål används för injicering av lösningar in i en mikroflödeskammare i Steg 7.
- Håll borren våt i H2O under borrningen. H 2 O fungerar som ett smörjmedel, vilket ökar livslängden för borrskäret.
- Enstaka torka av spetsen på borren hjälper borra hål.
- Efter att borra hål, markera en sida av bilden för enkel identifiering under PEGylation processen. Markörerna kan användas som referens för att undvika förvirring senare. För märkning, kan en diamant borr användas. Använd inte pennan eftersom bläcket kan få på ytan.
- Rengöring med H2O Placera glasen i ett glas färgning burk. Typiskt 5 till 15 objektglas kan placeras i en enda burk. Skölj objektglasen med MilliQ H2O Upprepa det tre gånger och sonikera glasen med MilliQ H2O under 5 minuter för att avlägsna smuts. Släng vattnet och skölj glasen igen 3 gånger medMilliQ H2O Observera att 130 W är ultraljudseffekten som används för detta protokoll. Högre ultraljudsbehandling makt kan minska livslängden på kvartsglas.
- Rengöring med aceton. Byt MilliQ H2O med aceton. Sonikera slides med aceton under 20 min eller längre.
- Sköljning med H2O Kasta aceton och skölj glasen med MilliQ H2O Upprepa det för 3 gånger för att avlägsna eventuella acetonrester.
- Rengöring med KOH. Byt ut vatten med 1 M KOH och låt ligga bilderna för 20 min eller längre. Överdriven etsning (t.ex. över natten KOH behandling) kommer att förbättra kvaliteten på ytan, men kommer att införa repor, som kan påverka fluorescens avbildning.
- Sköljning med H2O Skölj objektglasen med MilliQ H2O under tre gånger för att avlägsna spår av KOH.
- Piranha etsning.
- Överför bilderna till en Duran glashållare eller en skräddarsydd teflonhållare och place dem i en bägare (1 liter) som är beläget i ett dragskåp.
- Fyll bägaren med 450 ml H 2 SO 4.
- Tillsätt 150 ml H 2 O 2 för 03:01-förhållande mellan H 2 SO 4 och H 2 O 2. När lösningen börjar koka spontant ökar temperaturen över 90 ° C. Kontrollera att H2O 2-lösning är vid rumstemperatur innan reaktionen. I annat fall kan temperaturen hos den kokande lösningen vara lägre än 90 ° C.
- Rör om lösningen för ordentlig blandning och låt bägarens ostörd under 20 min.
- Ta bilderna ur piraya lösning tillsammans med diapositivhållaren, och lägg dem i en glashållare innehållande MilliQ H2O Samtidigt kassera piraya lösningen i en utsedd avfallsflaskan när den når rumstemperatur.
- Skölj objektglasen 3 gånger med MilliQ H2O Extra försiktighet bör iakttas i ytterligare steps för att undvika eventuell kontaminering av bilder. Fortsätt till steg 3. Det rekommenderas att omedelbart gå vidare med följande steg.
* Varning: piraya lösning är extremt reaktivt. Vid hantering av denna lösning extra försiktighet bör vidtas. Dessutom, när av misstag blandas med organiska lösningsmedel, såsom aceton, kan det orsaka en explosion.
2. Cover Rengöring
Ett mikroflödeskammare består av en kvartsglas och ett täck s läpp. När ett prisma-typ TIRF mikroskop användes, är ytan av ett täckglas inte avbildas. Därför är det tillräckligt för att rengöra ett täckglas endast med H2O och KOH. Om den behöver en täckglas som skall avbildas (t.ex. via mål-typ TIRF mikroskopi), rekommenderas att behandla täckglas med piraya-lösning (steg 1,7). Observera att om PEGylering av täckytan är inte av hög kvalitet, kan det fungera som en sänka för proteiner end ge upphov till variationer i proteinkoncentration.
- Sköljning med H2O Placera täckglas (24 x 30, 24 x 40 eller 24 x 50 mm 2) i en glas färgning burk. Typiskt 5-15 täckglas kan placeras i en enda burk. Skölj täckglas 3 gånger med MilliQ H2O
- Rengöring med KOH. Byt ut vatten med 1 M KOH och låt ligga täckglas för 20 min eller längre.
- Sköljning med H2O Skölj täckglasen tre gånger med MilliQ H2O för att avlägsna spår av KOH. Fortsätt till steg 3.
3. Amino-silanisering av diabilder och Täck
Funktionalisering av ytan av kvartsglas och täckglas med amingruppen via amino-silanisering kemi. Metanol används som lösningsmedel och ättiksyra som katalysator för den amino-silanisering reaktion.
- Sköljning med metanol. Byt MilliQ H2O i färgnings rätter (från Spakterna 1 och 2) med metanol. Håll glasen och täckglasen i metanol till steg 3.3. Förvara inte diabilder och täckglasen i metanol under en onödigt lång tidsperiod (t.ex. flera timmar), eftersom föroreningar i metanol adsorberar till ytan.
- Förberedelse amino-silanisering lösning.
- Skölj en Pyrex-kolv flera gånger med metanol. Sonikera kolven med metanol i 5 minuter eller längre. Det rekommenderas att ha en dedikerad kolv som hålls rena.
- Häll 100 ml metanol i kolven.
- Tillsätt 5 ml ättiksyra.
- Tillsätt 3 ml APTES (3-aminopropyltrimetoxisilan) och blanda försiktigt genom att skaka den.
- Amino-silanisering. Byt ut metanol i färgnings rätter som innehåller bilder och täckglasen med aminosilanization reaktionsblandningen.
- Inkubera under 20-30 min. Under inkubation, låt ligga en gång i 1 min.
- Sköljning med metanol. Byt ut enminosilanization reaktion med metanol. Kassera metanolen och tillsätt en färsk metanol-lösning. Upprepa detta tre gånger.
4. Ytpassivering Använda Polymer (första rundan)
Passiveaminbelagda ytan av kvartsglas och täckglas genom konjugering av NHS-estern polyetylenglykol (PEG). Denna reaktion utföres med mättande koncentration av PEG-lösning vid pH 8,5 över natten.
- Torkning diabilder och täckglas. Torka diabilder och täck använder N 2 gas och placera dem i ren pipett rutor så att den sida som måste vara PEGylerad är vänd uppåt. Pipetten boxen är delvis fylld med MilliQ H2O Denna fuktig miljö förhindrar PEGylering lösning torkar ut under natten inkubation.
- Förbered reaktionsbuffert. Bered 0,1 M färsk natriumbikarbonat-buffert (pH 8,5) genom upplösning av 84 mg natriumbikarbonat i 10 ml avMilliQ H2O Det finns inget behov av att justera pH. Denna lösning kan förvaras frysta för nästa användning (t.ex. Steg 6.1).
- Förberedelse PEGylering lösning.
- Bered en PEG-blandningen av 0,2 mg biotinylerade NHS-ester PEG (5000 Da) 13 och 8 mg NHS-ester mPEG (5000 Da) i ett 1,5 ml rör. Vid framställning av N antal bilder, förbereda N gånger större mängd av PEG-blandningen i ett enda rör.
- Lägg 64 pl (eller N gånger 64 ul för N antal diabilder) i nygjord buffert (steg 4,2). Pipettera upp och ner för att lösa dem helt.
- Centrifugera med 16100 x g under 1 min för att avlägsna luftbubblor. Inte pipet efteråt. I annat fall kommer luftbubblor bildas som stör PEGylering i steg 4.4.
- PEGylering.
- Drop 70 pl av PEGylering blandningen till en torkad kvarts glida från steg 4.1. Använd 90 l vid 24 x 50 mm 2 coverslip.
- Placera försiktigt en torkad täck från steg 4.1 över lösningen.
- För att få en jämn och hög kvalitet på PEGylering, se till att inte införa luftbubblor. På grund av ytspänning, de flesta av de luftbubblor kan spontant lämnar reaktionsvolym inom fem minuter på grund av ytspänning.
- Inkubera glasen i en mörk och fuktig miljö. Halveringstiden av NHS-estern PEG som vi använder vid pH 8 är ungefär en timme. På ett minimum, inkubera dem under 2 timmar. Inkubation över natten leder till högre kvalitet på PEGylering (data visas ej).
5. Långsiktig lagring
Lagra pegylerat diabilder och täckglas i N2 vid -20 º C.
- Torkning diabilder och täckglas. Försiktigt isär bilden och täckglas genom att skjuta täckglas till en sida, skölj dem med MilliQ H2O, och torka dem med N2.
- Lagra bilder och täckglas. For omedelbar användning, följ proceduren för den andra omgången av PEGylering (steg 6). För att lagra en längre tid följer du nästa steg.
- Placera ett par av sliden och täckglaset i ett 50 ml rör, så att de PEGylerade ytor är vända bort från varandra.
- Delvis förslut röret, dammsuga röret, och sedan fylla den med N2. Dessa steg hjälpa bevara PEGylerat yta under en lång tidsperiod. Skruva fast slangen ordentligt och förvara den vid -20 ° C. Kvaliteten av bilderna fortfarande är bra för upp till 3 månader (figur 3A, höger).
6. Ytpassivering Använda Polymer (andra omgången)
Ytterligare omgången av PEGylering att göra PEG-skiktet tätare och även för att släcka eventuella kvarvarande amingrupper på ytan. Användningen av korta NHS-ester PEG-molekyler (333 Da) kan vara effektiva för att tränga in i en befintlig PEG skiktet. Det är reckommenderar att göra denna andra omgång av PEGylering precis innan du använder en bild.
- Förbered reaktionsbuffert. Bered 0,1 M färsk natriumbikarbonat-buffert (pH 8,5). Den frysta lösningen från steg 4,2 kan också användas.
- Förberedelse PEGylering lösning. Lös upp 7 | il 250 mM MS4-PEG i 63 ul av natriumbikarbonat buffert.
- PEGylering. Gör på samma sätt som i steg 4.4. Inkubera under 30 min upp till över natten.
- Torkning diabilder och täckglas. Demon paret av bilden och täckglas, skölj dem med MilliQ H2O, torka dem med N2, och hålla dem i en ren pipett låda. Proceed för montering av en mikroflödeskammaren i steg 7.
7. Montering en mikroflödessystem kammare
Sätta ihop en mikroflödeskammare med hjälp av ett par av en PEGylerad kvartsglas och ett täckglas. Dubbelhäftande tejp används som ett distanselement. Kammaren försluts med epoxi lim och sålösningar införs genom hålen i kvartsglas.
- Placera en kvarts glida på en plan yta med PEGylerat sidan uppåt.
- Gör en kanal (bredd 5-7 mm) diagonalt på PEGylerad ytan genom att dubbelsidiga självhäftande band över bilden. Se till att hålen är placerade i centrum av kanalen. Se till att inte förstöra PEGylerad ytan under processen att göra en kammare. Det är möjligt att göra en flerkanals glida genom att placera och hålla fast den dubbelsidiga självhäftande band på olika sätt (se figur 2).
- Placera försiktigt en PEGylerad täckglas ovanpå för att slutföra kammaren. Den PEGylerad sidan ska vara vänd nedåt.
- Täta kammaren genom att trycka på täckglas över det område där dubbelsidiga tejper är placerade. Gör det försiktigt men grundligt, så att kammaren blir vatten-tätt tillsluten.
- Nära kanterna av kammaren med epoxi lim.
- Immobilisera streptavidin eller neutravidin påbiotinylerad PEG skiktet genom tillsats av 50 ul av 0,1 mg / ml av streptavidin eller neutravidin lösning i T50 (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 50 mM NaCl-buffert) med användning av en P200 pipett. Efter 1 min av inkubation, spola med 100 pl T50 buffert.
- Lägg biotinylerade biologiska molekyler för din enda molekyl avbildning.
8. Skjut Återvinning
Återvinning kvartsglas. Begagnade diabilder återvinns genom att ta bort täckglasen och de dubbelsidiga självhäftande band.
- Efter användning, förvara kamrarna i kranvatten. Långsiktig inkubation i vatten underlättar demontering av kamrarna.
- Koka kamrarna i kranvatten med hjälp av en mikrovågsugn. Använd en Pyrex-bägare. Koka under 10 minuter eller längre.
- Ta av täckglasen och de dubbelsidiga självhäftande band med hjälp av ett rakblad. Tryck inte på en kvarts glida vinkelrätt mot dess plan. Annars bryts. Håll rakbladet bort från kanalen. Otherwise införs repor på kanalen.
- Skölj objektglasen med hjälp av ett rengöringsmedel genom att gnugga dem med fingrarna.
- Placera glasen i ett glas färgning burk. Typiskt 5 till 15 objektglas kan placeras i en enda burk. Lägg 10% rengöringsmedel och låt ligga bilderna för 20 min eller längre. Skölj objektglasen med en stor kvantitet av fliken vatten.
- Gå till steg 1.2.
Representative Results
Efter mikroflödeskammarenheten (steg från 7,1 till 7,6) och innan man utför steg 7,7, är det tillrådligt att utföra kvalitetskontroll av PEGylerat ytan.
Om ytan passivering har utförts framgångsrikt, det finns mindre än 10 adsorberas icke-specifikt protein per avbildningsområdet (25 mm x 25 mm) som observerades när 1 till 10 nM fluorescerande protein sättes in i kammaren (figur 3a, till vänster).
När något av de rengöringsmedel eller reaktionssteg inte har genomförts korrekt, antalet icke-specifikt adsorberade proteiner avsevärt ökar, och CCD-skärmen kan vara mättad av fluorescens signaler. Till exempel, om den Piranha etsning hoppas över, finns det 100 gånger större mängd av icke-specifik adsorption observeras (figur 3a; jämför vänster med mitt). När den andra PEGyleringen steget hoppas över, fanns det cirka 3 tidSA större mängd icke-specifik adsorption observeras (Figur 3b). En låg grad av PEGylering observeras när löpt kemikalier (t.ex. APTES förvaras vid rumstemperatur under flera månader) används (data ej visade). Kvaliteten på ytan sjunker också ner när en stor del av tiden har gått sedan det var PEGylerad (figur 3a, jämföra vänster med höger).
För vi vet, är det första gången som de två omgångar av PEGylering införs för enda molekyl studier. De två omgångar av PEGylering garantera högsta kvalitet på PEG lager bildning (Figur 3b). Den överlägsna natur dubbel PEGyleringen är tydligt visas i filmerna (Jämför Movie 1a med film 1b). I dessa filmer, är bakgrundssignalerna från fluorescerande molekyler i lösning observerades vara mycket svagare när den dubbla PEGyleringen var används, vilket tyder på att proteiner stöts bort mer effektivt av dubbelt PEGylerat lagret. Även om detta tvåstegsprocess rekommenderas starkt, kan det andra PEGyleringen steget hoppas över om experimentet är acceptabel för icke-optimal passivering.
Figur 1:. Schematisk bild av de ytbehandlingar som (a) ett objektglas rengörs med aceton, KOH, och Piranha lösningar. Den är funktionaliserad med APTES och PEGylerat med NHS-ester PEG. (B) ett täckglas rengörs med KOH, liksom med Piranha-lösning vid behov. Den är funktionaliserad med APTES och PEGylerat med NHS-ester PEG.
fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2:. Mikroflödes kammare (a) En enkanalig kammare. Den objektglas har två hål borrade. Den är monterad med ett täckglas med användning av två skivor av en dubbelsidig tejp. (B) En tre-kanals kammaren. Den objektglas har sex hål borrade. Den är monterad med ett täckglas med användning av fyra skivor av en dubbelsidig tejp.
Figur 3: CCD-bilder som tagits med färgämnesmärkta proteinerna i lösning. (A) CCD-bilder togs av prisma-typ total inre reflektion fluorescensmikroskopi med hjälp av en 60X objektiv med 10 nM Cy3-labeld Rep i lösning. (Vänster) En yta framställdes enligt protokollet i den här artikeln. (Middle) En yta var förbererött efter protokollet i den här artikeln, men piraya etsning hoppades över. (Höger) En yta framställdes enligt protokollet i denna artikel och förvaras i 3 månader vid -20 ° C under kväve. (B) CCD-bilder tagna med 10 nM Cy3-labeld Rep i lösning. (Vänster) En yta framställdes enligt protokollet i den här artikeln. (Höger) En yta framställdes enligt protokollet i denna artikel, men den andra omgången av PEGylering hoppades över. Scale bar = 5 | im.
Film 1: CCD-filmer tagna med färgämnesmärkta proteiner i lösning. CCD-filmer togs av prisma-typ total inre reflektion fluorescensmikroskopi med hjälp av en 60X objektiv med 10 nM Cy3-labeld Rep i lösning. Tidsupplösningen är 100 msek. (A) En yta framställdes enligt protokollet i den här artikeln. (B) En yta framställdes enligt protokollet i denna artikel, men den andra omgången av PEGylation hoppades över. Klicka här för att se film 1a och klicka här för att se film 1b.
Discussion
Kritiska steg i detta protokoll
Det är viktigt att göra ytan hydrofil innan amino-silaniseringen reaktion. Detta uppnåddes genom piraya etsning som genererar de fria hydroxylgrupper på ett glas / kvarts yta. Det rekommenderas inte att hålla piraya etsade ytan utsätts för antingen H2O eller luft under en längre tid eftersom hydrofiliteten av ytan går ner gradvis.
NHS-ester-PEG-molekyler är reaktiva. Det rekommenderas att göra alikvoter och förvara dem under kväve i -20 º C. Hållbarheten för APTES kemiska vid rumstemperatur är kort. Det rekommenderas att ersätta den med en ny varje månad.
Modifikationer av detta protokoll
När du inte kan använda piraya etsning av någon praktisk anledning, kan du etsa använda KOH under en längre tid (t.ex. overnight), vilket också kommer att göra hydroxylgrupperna exponeras. Den fallgrop med denna alternativa metod är att sliden blir oanvändbar efter några återvinner grund av allvarliga repor.
Det är ofta praktiseras för att bränna ett glas / kvarts yta med hjälp av gasolbrännare, som är effektiva för att eliminera fluorescerande organiska material 7. Detta förfarande var inte med i detta protokoll för att det är överflödigt med piraya etsning. Observera att förfarandet eventuellt kommer att leda till oxidation av hydroxylgrupper. Därför bör detta förfarande inte utföras när en yta etsades använda KOH eller piraya lösning.
När en buffert med pH-värde lägre än 7 används för en enda molekyl avbildning, konformationen av PEG ändras från "svamp" till "borste", vilket minskar graden av passivering. Därför, när pH-värdet är lägre än 7,0 används, är det rekommenderat att ytterligare passivera ytan med disuccinimidyltartrat <sup> 7.
Perspektiv
Detta arbete har gett en robust protokoll för att uppnå hög kvalitet ytpassivering. Protokollet kommer att vara användbart för enda molekyl fluorescens studier som är involverade med proteiner 14 samt proteinkomplex i cellextrakt och immunoprecipitaten 15. Den kommer att i stor utsträckning för andra enda molekyl tekniker såsom kraft spektroskopi och vridmoment spektroskopi 16. Det kommer också att vara användbar för att förhindra celler från att adsorbera till en yta 17.
Protokollet i detta arbete är krävande för sina flerstegsförfaranden. Ytpassivering hjälp av lipid-PEG 8 och poly-lysin PEG 9 finns tillgängliga som ett alternativ. Eftersom de inte kräver några kemiska reaktioner är det lätt att genomföra. Emellertid är graden av passivering inte lika hög som den som uppnås genom kemisk modifblue av en yta.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
SDC, ACH, och CJ stöddes av Starting Grants (ERC-StG-2012 till 309.509) genom Europeiska forskningsrådet. J.-MN stöddes av National Research Foundation (NRF) (2011 till 0.018.198) i Korea; och Pioneer Research Center Program (2012-009586) genom NRF Korea finansieras av ministeriet för vetenskap, IKT, och framtida planering (MSIP). Detta arbete stöddes också av Centrum för BioNano Hälso-Guard finansieras av MSIP Korea som Global Frontier Project (H-GUARD_2013-M3A6B2078947). YKL och J.-HH stöddes av Seoul Science Fellowship Program i Seoul City, Sydkorea. Det märkta Rep-protein var en generös gåva från Dr Sua Myong.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Slide preparation and cleaning | |||
| Acetone | Sigma | 32201 | 1 L |
| Coverslips | VWR | 631-0136 631-0144 631-0147 | 24 x 32 mm2, 22 x 40 mm2, 24 x 50 mm2 (No.1½, Rectangular) |
| Diamond drill bits | MTN-Giethoorn, The Netherlands | LA-0564-00DB | 3/4 mm |
| Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
| Glass staining dishes | Fisher Scientific | 300101 | |
| H2O2 | Boom | 6233905 | 1 L, hydrogen peroxide 30%. Opened bottles should be stored at 4 °C. |
| H2SO4 | Boom | 80900627.9010 | Sulfuric acid 95-98% |
| KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
| Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| Quartz slides | Finkenbeiner | 1” x 3”, 1 mm thick | |
| 2. Coverslip cleaning | |||
| Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
| KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| 3. Amino-silanization of slides and coverslips | |||
| Acetic acid | Sigma | 320099-500ML | Acetic acid, glacial |
| APTES | Sigma-Aldrich | 281778-100ML | 3-aminopropyl trimethoxysilane. Store at the room temperature under N2. Replace once in a month. |
| Flask (200 ml) | VWR | Flask (200 ml) | Pyrex flask. Have one flask dedicated for aminosilanization. |
| Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| 4. Surface passivation using polymer (the first round) | |||
| Biotin-mPEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 Da. Store aliquots of 1-2 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. |
| mPEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000-1g | mPEG-succinimidyl valerate (SVA), MW 5,000 Da. Store aliquots of 80 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
| 5. Surface passivation (the second round) | |||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Dimethyl sulfoxide BioReagent, for molecular biology, ≥99.9% |
| DST | Pierce | 20589 | Disuccinimidyl tartarate |
| MS4-PEG | Pierce | 22341 | Short NHS-ester PEG, MW 333 Da. Dissolve 100 mg MS4-PEG in 1.1 ml DMSO. Store 20 µl aliquots at -20 °C. |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
| 6. Assembling a microfluidic chamber | |||
| Double sticky tape | Scotch | 10 mm wide | |
| Epoxy | Thorlabs | G14250 | Devcon 5 minute epoxy |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-1 KG | Sodium chloride |
| Neutravidin | Pierce | 31000 | ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein. Stock in 5 mg/ml in H2O at 4 °C. |
| Streptavidin | Invitrogen | S-888 | Stock 5 mg/ml in H2O or T50 at 4 °C. |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1 KG | Tris |
References
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Surfaces and orientations: much to FRET about. Acc Chem Res. 38 (7), 542-548 (2005).
- Lamichhane, R., Solem, A., Black, W., Rueda, D. Single-molecule FRET of protein-nucleic acid and protein-protein complexes: surface passivation and immobilization. Methods. 52 (2), 192-200 (2010).
- Di Fiori, N., Meller, A. Automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules. J Vis Exp. (33), 1542-1510 (2009).
- Kingshott, P., Griesser, H. J.
- Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu Rev Mater Sci. 26, 365-394 (1996).
- Zalipsky, S., Preface Harris, J. M. Poly(theylene glycol). , 11-12 (1997).
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2007).
- Finkelstein, I. J., Greene, E. C. Supported lipid bilayers and DNA curtains for high-throughput single-molecule studies. Methods Mol Biol. 745, 447-461 (2011).
- Kenausis, G. L., et al. Poly(L-lysine)-g-Poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: attachment mechanism and effects of polymer architecture on resistance to protein adsorption. J Phys Chem B. 104 (14), 3298-3309 (2000).
- Groll, J., Star Moeller, M. polymer surface passivation for single-molecule detection. Method Enzymol. 472, 1-18 (2010).
- Bahmani, B., Gupta, S., Upadhyayula, S., Vullev, V. I., Anvari, B. Effect of polyethylene glycol coatings of uptake of indocyanine green loaded nanocapsules by human spleen macrophages in vitro. J Biomed Opt. 16 (5), (2011).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay. J Vis Exp. (37), e1689 (2010).
- Upadhyayula, S., et al. Coatings of polyethylene glycol for suppressing adhesion between solid microspheres and flat surfaces. Langmuir. 28 (11), 5059-5069 (2012).
- Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications. Nat Rev Genet. 14, 9-22 (2012).
- Joo, C., Fareh, M., Narry Kim, V. Bringing single-molecule spectroscopy to macromolecular protein complexes. Trends Biochem Sci. 38 (1), 30-37 (2012).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5, 491-505 (2008).
- Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318, 426-430 (2007).
