Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

Summary

Biocompatibili pH reattivo nanosensori sol-gel possono essere incorporati in poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) ponteggi elettrofilate. Le impalcature self-reporting prodotti possono essere utilizzati per il monitoraggio in situ delle condizioni microambientali mentre coltura di cellule sul patibolo. Questo è vantaggioso in quanto il costrutto cellulare 3D può essere monitorato in tempo reale senza disturbare l'esperimento.

Abstract

Celle di coltura in 3D su ponteggi adeguati è pensato per imitare al meglio il microambiente in vivo e aumentare le interazioni cellula-cellula. La risultante costrutto cellulare 3D può essere spesso più rilevante per studiare gli eventi molecolari e le interazioni cellula-cellula di esperimenti simili studiati in 2D. Per creare culture efficaci 3D con la vitalità delle cellule elevata in tutto il patibolo le condizioni di coltura come ossigeno e pH bisogno di essere attentamente controllata come gradienti di concentrazione di analiti possono esistere in tutto il costrutto 3D. Qui si descrivono i metodi di preparazione biocompatibili pH reattivo nanosensori sol-gel e la loro incorporazione in poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) ponteggi elettrofilate insieme a loro successiva preparazione per la coltura di cellule di mammifero. I ponteggi reattivo pH possono essere utilizzati come strumenti per determinare microambientali pH all'interno di un costrutto cellulare 3D. Inoltre, tendiamo particolare la consegna di pH nanose reattivansors per l'ambiente intracellulare di cellule di mammifero la cui crescita è stata sostenuta da elettrofilate scaffold PLGA. La posizione citoplasmatica dei nanosensori reattive pH può essere utilizzato per monitorare pH intracellulare (PHI) durante la sperimentazione in corso.

Introduction

Una strategia chiave nell'ingegneria dei tessuti è l'uso di materiali biocompatibili per fabbricare scaffold cui morfologia assomiglia al tessuto che sta per sostituire ed è anche in grado di sostenere la crescita e la funzione delle cellule ^1,2. L'impalcatura fornisce supporto meccanico consentendo attaccamento cellulare e la proliferazione tuttavia permette la migrazione cellulare durante gli interstizi di un costrutto cellulare 3D. Il ponteggio deve permettere il trasporto di massa di nutrienti cellulari e non inibire la rimozione dei rifiuti metabolici ^3.

Electrospinning è emerso come un metodo promettente per la realizzazione di supporti polimerici in grado di supportare la crescita cellulare ^4-6. Le fibre elettrofilate non tessuti prodotti sono adatti per la crescita cellulare in quanto sono spesso porosi e permettono l'interazione cellula-cellula e migrazione cellulare durante gli interstizi di un costrutto cellulare 3D ^7. E 'importante monitorare la vitalità cellulare durante tl periodo di coltura e per garantire che la vitalità cellulare è mantenuta per tutto l'arco del costrutto 3D. Ad esempio, condizioni di coltura come l'ossigeno e pH richiedono un attento controllo, come gradienti di concentrazione di analiti possono esistere all'interno del costrutto 3D. Bioreattori o sistemi di perfusione possono essere impiegati per simulare le condizioni in vivo di flusso interstiziale e come risultato un trasferimento incremento dei nutrienti e la rimozione metabolica rifiuti ^8. La questione se tali sistemi sono garantire condizioni microambientali costanti può essere affrontato valutando il microambiente cellulare in tempo reale.

Metriche chiave microambiente che possono essere monitorati in tempo reale le seguenti: temperatura, composizione chimica di supporti cellulari, concentrazione di ossigeno disciolto e anidride carbonica, pH e umidità. Di questi parametri, la temperatura può essere più facilmente monitorata utilizzando sonde in situ. Metodi per monitorare i restanti parametri di cui comunemente inrimozione volve di una aliquota di campionamento e quindi disturbare la coltura cellulare e aumentano il rischio di contaminazione. Si cercano continui, metodi in tempo reale. Metodi di controllo attuali di solito contare su strumenti che analizzano fisicamente il costrutto cellulare come un monitor pH o sonda ossigeno. Tuttavia, questi metodi intrusivi possono danneggiare il costrutto cellulare e disturbare l'esperimento in corso. Monitoraggio non invasivo di concentrazioni dell'analita all'interno del costrutto 3D potrebbe consentire il monitoraggio in tempo reale di vari aspetti ambientali quali la riduzione dei nutrienti ^9. Ciò consentirebbe di valutare apporto di sostanze nutritive alle regioni più profonde all'interno della struttura e determinare se scorie metaboliche veniva eliminato in modo efficace ^10,11. Sistemi che tentano di risolvere il problema di invasività genere comportano l'uso di una camera di perfusione che passa mezzo di coltura sia attraverso il recipiente di coltura e ai sensori esterni per monitorare pH, ossigeno e glucosio ^12. Ilre è crescente interesse nello sviluppo di sensori che possono essere integrati direttamente nel recipiente di coltura che non richiede la rimozione di una aliquota di campionamento e come tale sarebbe fornire monitoraggio in situ.

Per affrontare tali carenze per in situ e monitoraggio non invasivo delle condizioni microambientali abbiamo incorporato analiti nanosensori reattivo in scaffolds elettrofilate per la produzione di ponteggi auto-segnalazione ^13. Ponteggi che agiscono come dispositivi di rilevamento per il monitoraggio dell'attività di fluorescenza sono stati preparati in precedenza, in cui il dispositivo di rilevamento era o scaffold polimerico effettivo creato da elettrospinning o attraverso l'uso di un colorante reattivo analita che è incorporato nel polimero prima della formazione del ponteggio ^14,15 . Tuttavia, questi dispositivi di rilevamento hanno il potenziale per dare uscite ottiche erronee causate da possibili interferenze di altri analiti. L'uso di un dispositivo di rilevamento su raziometricoch come quelli preparati nel protocollo descritto ha il potenziale per eliminare questi possibili effetti negativi e fornire una risposta specifica per l'analita in questione.

I ponteggi elettrofilate qui presentati sono stati preparati dal sintetico co-polimero di poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA), selezionato a causa di avere Food and Drug Administration (FDA), grazie alle sue proprietà biodegradabili e biocompatibili ed una pista record di sostenere la crescita e la funzione dei vari tipi di cellule ^16-18. Gli analiti raziometrico nanosensori reattivo pronti sono sensibili al pH. I nanosensori incorporano due coloranti fluorescenti in una matrice sol-gel biocompatibile in cui un colorante, FAM è sensibile al pH e l'altra, TAMRA agisce come standard interno in quanto non è sensibile al pH. Inoltre la fluorescenza sia FAM e TAMRA può essere analizzata separatamente in quanto non si sovrappongono in modo significativo. Determinare il rapporto tra la emi fluorescenzaSsion di entrambi i coloranti a specifiche lunghezze d'onda dà una risposta pH indipendente da altre condizioni ambientali. Le impalcature self-reporting potrebbero consentire la valutazione ripetizione del pH in situ e in tempo reale senza interrompere il modello 3D sviluppato. Abbiamo dimostrato che questi scaffold sono in grado di supportare attaccamento e la proliferazione cellulare e rimangono reattivo al analita in questione. La cinetica di acidi sottoprodotti di costrutti ingegnerizzati rimane poco studiato e come tale utilizzando i ponteggi reattive pH possono notevolmente facilitare tali studi ^19. Inoltre, l'uso dei ponteggi auto-segnalazione per applicazioni di ingegneria tissutale presenta l'opportunità di comprendere appieno, monitorare e ottimizzare la crescita del modello 3d costrutti di tessuti in vitro, non invasivo e in tempo reale.

I nanosensori reattiva di pH sono stati consegnati per l'ambiente intracellulare di fibroblasti in coltura su electrospun PLGA ponteggiods. Il rapporto tra l'emissione di fluorescenza dei coloranti sono stati utilizzati per monitorare pHi e rispetto ad un auto-segnalazione ponteggio Incorporando nanosensori pH. La consegna di nanosensori a cellule coltivate in un ambiente 3D potrebbe consentire il monitoraggio della concentrazione di analita in profondità all'interno del costrutto in modo non distruttivo. Pertanto nanosensori possono essere uno strumento di imaging valida per valutare in modo non distruttivo il comportamento delle cellule in tutto 3D costruisce consentendo analisi a lungo termine. Screening della concentrazione dell'analita di singole celle all'interno di un costrutto 3D potrebbe assicurare che stanno ricevendo concentrazioni di nutrienti e di ossigeno sufficienti. Parametri di processo di monitoraggio potrebbe contribuire allo sviluppo di tecniche standardizzate per il trasporto di massa effettiva di ossigeno e nutrienti. La consegna dei nanosensori per l'ambiente intracellulare e l'incorporazione di nanosensori in scaffold polimerici potrebbe essere combinati per consentire la valutazione della vitalità cellulare così come la prestazione impalcatura all'interno const 3Dructs durante il processo di crescita dei tessuti. Questo può portare ad un aumento della conoscenza di questi costrutti e progredire la realizzazione di sostituti del tessuto biologico pertinenti.

Protocol

Panoramica

Sezione 1 descrive la preparazione di pH nanosensori reattivo e la caratterizzazione della risposta nanosensori a pH utilizzando la spettrometria di fluorescenza e la loro dimensione al SEM.

Sezione 2 descrive la preparazione di elettrofilate scaffold polimerici e caratterizzazione della loro morfologia e dimensioni utilizzando SEM. Sezione 2 descrive anche la preparazione di scaffolds self-reporting, che sono ponteggi elettrofilate con l'inclusione dei nanosensori reattive pH. I risultanti ponteggi self-report sono caratterizzati da SEM per valutare se si è verificato eventuali modifiche morfologiche delle fibre elettrofilate. La fluorescenza dalle impalcature auto-segnalazione risultanti dai nanosensori incorporati è valutata mediante microscopia confocale.

Sezione 3 descrive la coltura di cellule sul patibolo electrospun e il self-report patibolo. I ponteggi vengono prima sterilizzati in preparatione per la coltura cellulare a seguito della quale i ponteggi sono valutati per determinare se la sterilizzazione e la cultura di cellule influenzano la capacità di fluorescenza dei ponteggi auto-segnalazione. Il protocollo descrive inoltre la consegna di nanosensori alle cellule che vengono coltivate su scaffold elettrofilate. Lysotracker colorante viene utilizzato per garantire che nanosensori non sono state prese in compartimenti cellulari acide.

1. Preparazione e analisi di pH Responsive nanosensori sol-gel

1.1 Preparazione del pH Responsive nanosensori sol-gel

Nota: Questa preparazione deve essere eseguita in una cappa aspirante.

1. Preparare i fluorofori per l'uso entro il nanosensori pH sciogliendo 5 - (e-6)-carbossifluoresceina, estere succinimidyl (FAM-SE) (1,5 mg) in dimetilformammide (DMF) (1 ml) in un pallone a fondo rotondo e 6-carboxytetramethylrhodamine , estere succinimidyl (TAMRA-SE) (1,5 mg) in DMF (1 ml) in un altro round pallone a fondo.Aggiungere 3-amminopropiltrietossisilano (APTES) (1,5 mL) per ogni beuta e agitare sotto atmosfera di azoto secco (21 ° C) per 24 ore al buio cioè avvolgere i campioni in stagnola.
2. Aggiungere entrambi i coloranti di cui sopra (250 mL) ad una miscela di etanolo (6 ml) e idrossido di ammonio (30% in peso, 4 ml) contenuta in un pallone a fondo tondo e agitare per 1 ora (21 ° C).
3. Aggiungere lentamente tetraetilortosilicato (TEOS) (0,5 ml) alla miscela, continuare a mescolare per altri 2 hr. La miscela si accende nuvoloso. I nanosensori possono essere raccolti mediante evaporazione rotante. Nanosensori possono essere memorizzati in una fiala di vetro a ^{4 °} C per un uso futuro.
   
   ATTENZIONE: ulteriore manipolazione di nanosensori nella loro forma secca deve essere eseguita in una cappa aspirante o in caso di pesatura loro l'equilibrio dovrebbe essere chiuso, ad esempio in un Weighsafe.

1.2 nanosensori risposta a pH

1. Preparare soluzioni tampone fosfato di Sorensen che vanno dal pH 5,5-8,0 per Mixing rapporti specifici di sodio fosfato monobasico (0,2 M) e sodio fosfato bibasico (0,2 M) soluzioni stock. Controllare il pH finale utilizzando un pHmetro. Apportare le modifiche minori al pH con idrossido di sodio (NaOH) (4 M) o acido cloridrico (HCl) (2 M).
2. Sospendere i nanosensori pH nei tamponi di pH (5 mg / ml) da un lato tenendo il recipiente contenente la soluzione di nanosensori in un vortice per 3 minuti poi immergere il vaso in un ultrasonicatore fino a quando la soluzione diventa torbida (circa 5 min). Ripetere la procedura per sospendere pienamente i nanosensori in soluzione.
3. Posizionare la prima soluzione in una cuvetta ottica e utilizzare lunghezze d'onda di eccitazione di 488 nm per 5 - (e-6)-carbossifluoresceina (FAM) e 568 nm per 6-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA). Raccogliere le lunghezze d'onda di emissione a 500-530 nm per FAM e 558-580 nm per TAMRA con uno spettrometro a fluorescenza.
4. Modificare le soluzioni nella cuvetta ottico in modo che il pH può essere osservata a diversi pH e continuare collecting spettri di emissione.
5. Calcolare il rapporto dei valori massimi di emissione prodotta a ciascun valore di pH per produrre una curva di calibrazione.

1.3 SEM di nanosensori

1. Porre un campione dei nanosensori su un carbonio rivestito microscopio elettronico stub e farfugliare mantello d'oro per 5 min in atmosfera di argon.
2. Osservare da microscopia elettronica a scansione (SEM). Durante l'imaging regolare la distanza di lavoro, tensione e ingrandimento di minimizzare elettrone di carica (Figura 1).

2. Preparazione e analisi di PLGA Ponteggi

2.1 Electrospinning PLGA Ponteggi

1. In una cappa aspirante sciogliere acido poli (lattico-co-glicolico) (PLGA) in diclorometano (DCM) (20% (w / w)) con piridinio formiato (PF) (1% (w / w)). Porre la soluzione in una siringa da 10 ml con un ago smussato riempimento 18 G e sicuro idonei a una pompa a siringa.
2. Dist. la punta dell'ago 20 centimetri di distanza da un 20cm x 15 cm piano di raccolta alluminio.
3. Fissare l'elettrodo di un alimentatore ad alta tensione alla punta della siringa e la terra alla piastra di raccolta alluminio.
   
   ATTENZIONE: Si deve prestare attenzione in quanto l'alta tensione è usato cioè di spegnere sempre l'alimentazione elettrica prima di gestire qualsiasi apparecchiatura elettrofilatura.
4. Consegnare la soluzione con un flusso costante di 3,5 m / ora a 12 kV per 2 ore. Elettrospinning utilizzando queste condizioni darà una profondità un'impalcatura di circa 60 micron.
5. Lasciare il patibolo in una cappa per 24 ore per consentire i residui di solvente di evaporare.

2.2 Electrospinning pH Responsive PLGA Ponteggi

1. Preparare ponteggi incorporano pH nanosensori reattivi come descritto nella sezione 2.1, ma con la modifica di aggiungere nanosensori per la soluzione di polimero (5 mg / ml). Sospendere il nanosensori nella soluzione PLGA con l'assistenza di ultrasuoni (circa 5 min) prima per la messa in una siringa da 10 ml.

2.3 SEM di PLGA impalcatura e pH Impalcatura Responsive

1. Porre un campione del patibolo PLGA o pH patibolo reattivo su un microscopio elettronico rivestito stub carbonio e procedere come descritto per SEM di nanosensori (Figura 1).

2.4 Calibrazione del pH impalcatura Responsive

1. Porre un campione di pH scaffold reattivo in una piastra di coltura a 35 mm e immergersi in apposite soluzioni tampone.
2. In un microscopio confocale utilizzare un laser argon 488 nm per eccitare la FAM e un laser krypton 568 nm per eccitare il TAMRA entro i nanosensori. Osservare l'emissione di fluorescenza di pH ponteggi rispondenti a 500-530 nm per FAM e 558-580 nm per TAMRA. (Figura 2). Utilizzare la scansione sequenziale per evitare la raccolta di lunghezze d'onda di eccitazione.

3. Coltura cellulare su PLGA Ponteggi e pH Responsive PLGA Ponteggi

S copi "> Nota: Le seguenti deve essere eseguita in un armadio coltura cellulare.

3.1 Preparazione di PLGA Ponteggi per coltura cellulare

1. Tagliare le PLGA o pH reattivo ponteggi PLGA in due centimetri ² pezzi.
2. Sterilizzare scaffold mediante irradiazione con raggi ultravioletti (UV) ad una distanza di 8 cm per 15 min per lato.
3. Trasferire i ponteggi ad una piastra di coltura 12 pozzetti e mettere un anello in acciaio sulla parte superiore. Aggiungere una soluzione di penicillina / streptomicina (5% v / v) in tampone fosfato salino (PBS) all'interno e all'esterno dell'anello dell'acciaio, incubare una notte (37 ° C, 5% CO _2). Nota: l'anello di acciaio è stato realizzato presso l'Università di Nottingham e ha le seguenti dimensioni: diametro esterno 2 cm, 1 cm di diametro interno, 1 cm di profondità.
4. Rimuovere la soluzione sterilizzante e lavare con PBS.
5. Aggiungere cella di coltura verso l'interno (500 microlitri) e all'esterno (500 microlitri) dell'anello acciaio, posto in un incubatore (37 ° C, 5% CO ₂
6. Preparare una sospensione cellulare ed eseguire una conta cellulare utilizzando un saggio di esclusione Trypan Blue.
7. Creare una sospensione di cellule per ottenere un numero di cellule di 1 x 10 ⁶ cellule / ml.
8. Rimuovere i supporti da dentro e fuori dal ring in acciaio.
9. Sostituire con preriscaldata mezzi di coltura delle cellule sulla parte esterna dell'anello dell'acciaio (1 m).
10. Aggiungere 300 microlitri della sospensione cellulare all'interno dell'anello acciaio - piastra roccia avanti e indietro delicatamente per distribuire le cellule.
11. Posizionare la piastra di coltura cellulare in un incubatore (37 ° C, 5% CO ₂₎ - l'adesione cellulare avrebbe dovuto aver luogo entro 24 ore, ma continuare cultura per tutto il tempo dell'esperimento richiede - rinfrescante media ogni 2-3 giorni.

3.2 nanosensori Consegna in cellule coltivate su PLGA impalcatura

1. Cellule Seed Onto PLGA patibolo come descritto nella sezione 3.1. Per questo studio un vuoto PLGA patibolo (non contenanosensori Ning) è stato utilizzato a causa della sovrapposizione di emissione di fluorescenza durante l'imaging.
2. Posizionare la cella scaffold seminato in un incubatore (37 ° C, 5% CO ₂₎ per 72 ore per permettere alle cellule di crescere e migrano in tutto il ponteggio prima nanosensori consegna.
3. Prima di nanosensori consegna lavare le cellule con PBS e cambiare il supporto da terreni di coltura standard per i media liberi antibiotici e siero, incubare (37 ° C, 5% CO ₂₎ per 1 ora. Nota: mezzi di coltura standard per 3T3 compone di mezzo di Eagle modificato da Dulbecco supplementato con siero fetale di vitello, soluzione ((v / v) 10%) L-glutammina (2 mM), penicillina / streptomicina (1% (v / v)) .
4. Durante il periodo di incubazione preparare il complesso nanosensori-liposomi da sonicating brevemente nanosensori (5 mg) con OptiMEM (50 pl) per creare una soluzione A.
5. Crea soluzione B aggiungendo Lipofectamine 2000 (5 ml) a OptiMEM (45 microlitri), incubare a temperatura ambiente per 5 min.
6. Aggiungere la soluzioneA alla soluzione B, incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per formare la soluzione C, che è il complesso nanosensori-liposoma.
7. Aggiungere la soluzione C (100 microlitri) di cellule e incubare (37 ° C, 5% CO ₂₎ per 3 ore.
8. Rimuovere le cellule scaffold seminati dal termostato, supporto Aspirare e lavare due volte con PBS prima di aggiungere PBS (1 ml) per consentire la visualizzazione di cellule in vivo mediante microscopia confocale. Nota: PBS è stato utilizzato in questo protocollo in modo che l'indicatore rosso fenolo presente nella cella di coltura non ha causato autofluorescenza e anche perché veniva eseguita una calibrazione a differenti pH. Tuttavia fenolo media liberi rosse potrebbero essere utilizzati per l'analisi a lungo termine delle colture cellulari.
9. Immergere la cella scaffold seminato nei buffer di diverso pH e monitorare la risposta dei nanosensori associati con le cellule.
10. Monitorare Phi determinando il rapporto tra le intensità di fluorescenza da FAM e TAMRA osservando fluorescenza utilizzando la microscopia confocale (Figure 3).

3.3 nanosensori posizione all'interno di cellule di mammifero

1. Incubare le cellule con nanosensors contenenti solo il colorante FAM come descritto nella sezione 3.2 (questo perché l'emissione di fluorescenza di TAMRA è nella stessa regione spettrale come LysoTracker Rosso). Preparare questi nanosensori come descritto nella sezione 1.1, ma con l'omissione di preparazione e aggiungendo TAMRA.
2. Dopo il periodo di consegna nanosensori diluire la soluzione LysoTracker Rosso a 50 nm.
3. Aggiungere una aliquota della soluzione diluita (2 ml) per cellule in coltura su scaffold PLGA.
4. Incubare le cellule con LysoTracker rosso per 1 ora (37 ° C, 5% CO _2).
5. Dopo il periodo di incubazione rimuovere il supporto e lavare le cellule due volte con PBS (pH 7,4) prima di cambiare il supporto di PBS (pH 7,4) (2 ml) in preparazione per la visualizzazione mediante microscopia confocale. Nota: fenolo media liberi rosse potrebbero essere utilizzati al posto di PBS.
6. Aggiungere la macchia nucleare DraQ5 al PBS così una concentrazione finale di 5 mM e incubare le cellule per 3 min (37 ° C 5% CO _2). Non è necessario cambiare il supporto successivo al periodo di incubazione con DRAQ5.
7. Utilizzare un laser a 488 nm argon per eccitare il FAM solo nanosensori, una krypton laser 568 nm per eccitare il LysoTracker Rossa e 633 nm elio / neon laser per eccitare il cromoforo DRAQ5 e osservare la fluorescenza a 500-530 nm, 580-600 nm, 650 -750 nm rispettivamente (Figura 3). Utilizzare la scansione sequenziale per evitare la raccolta di lunghezze d'onda di eccitazione.

Representative Results

La distribuzione dimensionale delle pH nanosensori reattivi preparati è stata caratterizzata mediante SEM, dove la popolazione di nanosensori impressionate stati misurati e risultano avere dimensioni nanometriche nell'intervallo 240-470 nm (Figura 1A). Il raggiungimento di un diametro ridotto e ragionevolmente piccolo è coerente con l'utilizzo del metodo Stöber per preparare nanoparticelle. È stato trovato che utilizzando un ambiente basico pH durante la sintesi di nanoparticelle IE nanoparticelle preparato usando il metodo Stöber, consente un buon controllo della dimensione, mentre la preparazione usando condizioni acide produce un'ampia dispersione della dimensione delle particelle. Rappresentativi micrografie SEM delle fibre elettrofilate PLGA fabbricati utilizzando i metodi descritti sono illustrati nella Figura 1B dimostrare che l'impalcatura PLGA prodotta è costituita da fibre non tessute visualizzazione bordare minimo o rottura dove le fibre hanno dimensioni nanometriche. Figura 1C Figura 1B, Le micrografie SEM forniscono evidenza di associazione nanosensori sulla superficie delle fibre tuttavia essi possono anche essere incorporate nelle fibre patibolo, studi di degradazione di queste impalcature scaffold / nanosensori potrebbero essere effettuati in collaborazione con SEM e / o microscopia confocale per determinare se questo influisce sulle prestazioni nanosensori.

La capacità dei nanosensori per mantenere la loro attività ottica a seguito incorporazione nelle fibre PLGA è stata verificata mediante l'esame dei ponteggi self-report usando la microscopia confocale. Ritenzione della capacità di rimanere otticamente e chimicamente attiva quando incluso nelle fibre scaffold potrebbe consentire concentrazioni di analiti da monitorare. La fluorescenza emessa dai nanosensori dimostrato che i nanosensori retained loro attività ottica e sono associati con le fibre ponteggio. Fluorescenza emessa dal FAM coloranti (verde) e TAMRA (rosso) incorporato nei nanosensors reattive pH è mostrato rispettivamente nelle figure 2A e 2B. Questo è un risultato positivo che rende possibile per concentrazioni di analiti da monitorare in situ. E 'anche la prima volta che nanosensori raziometriche otticamente attive sono state incorporate nelle fibre scaffold PLGA utilizzando il processo di electrospinning. Dopo aver confermato che i nanosensori possono essere visualizzati utilizzando la microscopia a fluorescenza a seguito incorporazione in fibre PLGA, la risposta nanosensori alle variazioni di concentrazione di analiti è stata verificata. Immergendo il ponteggio nei buffer di diversa pH comportato una variazione di intensità di fluorescenza dal colorante FAM mentre la fluorescenza emessa dal colorante di riferimento TAMRA non modificare sensibilmente. Il rapporto di intensità di fluorescenza di entrambi i coloranti possono essere utilizzati per produce una curva di taratura come mostrato nella Figura 2C. La curva di calibrazione per nanosensori valutato solo e quando incorporati in elettrofilate scaffold PLGA è paragonabile e dimostra che i nanosensori conservano la loro attività ottica a seguito incorporazione in scaffold self-reporting. La capacità del self-report scaffold per rispondere reversibilmente a diversi valori di pH è stata valutata alternativamente immergendo il ponteggio nei buffer con pH di 5,5 e 7,5. La reversibilità è risultato essere molto buona come mostrato nella Figura 2D dove il self-report impalcatura può rispondere a numerosi cambiamenti ciclici di pH. Studi a lungo termine non sono stati condotti per valutare l'effetto di PLGA degrado sulla costituzione nanosensori, si ritiene che, poiché i nanosensori fornire una risposta raziometrica la quantità di nanosensori presenti non influirà sul risultato.

Analiti nanosensori reattivi sono stati consegnati con un Liposomagente di trasfezione al all'ambiente intracellulare di fibroblasti 3T3 la cui crescita è stata sostenuta dal bianco impalcature PLGA. Microscopia confocale di fibroblasti 3T3 coltivate su bianco scaffold PLGA dimostrano che nanosensori sono associati con le cellule di fibroblasti con fluorescenza osservati rispettivamente da FAM e TAMRA mostrato nelle figure 3A e B. Sovrapponendo la fluorescenza da questi canali mostra che la fluorescenza dei due coloranti è co-localizzato, suggerendo che i coloranti sono rimaste intrappolate all'interno matrice biocompatibile nanosensori '(come descritto da fluorescenza gialla in Figura 3C). I nanosensori si pensa di essere all'interno del citoplasma dei fibroblasti 3T3 e non contenuti in compartimenti acidi come dimostra l'assenza di fluorescenza co-localizzati da FAM solo nanosensori e Lysotracker Red colorante rappresentato nella figura 3D. L'intensità di fluorescenza di pH nanosensori reattivo consegnareEd a fibroblasti 3T3 è stata monitorata mentre le cellule sono state sottoposte a variazioni di pH i cui risultati sono mostrati in Figura 3E. Il grafico prodotto dimostra che le cellule coltivate sul electrospun PLGA scaffold hanno mantenuto un pHi nell'intervallo 6,8-7,0.

Figura 1. Micrografie SEM di nanosensori, fibre PLGA e ponteggi auto-segnalazione. (A) pH reattivi nanosensori sol-gel che mostrano le particelle di dimensioni nanometriche sferica (B) PLGA elettrofilate fibre di tessuto non tessuto in fibra di cui morfologia è regolare con bordare minimo e rotture (C) pH reattivo ponteggi self-report in cui si possono osservare i nanosensori per essere sporgente da la morfologia della fibra PLGA rimane ancora confrontabile con fibre PLGA controllo che non contengono nanoensors. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 2. Immagini di microscopia confocale di pH reattivo ponteggi self-report in cui fluorescenza si può osservare dai nanosensori associati alle fibre scaffold PLGA. (A), FAM (verde), il pH colorante reattivo e (B) TAMRA (rosso), il colorante di riferimento. (C) i grafici di calibrazione del pH reattivo nanosensori sol-gel e pH ponteggi reattivi demonsttasso che la risposta ottica e chimica dei nanosensori non è stato toccato quando vengono incorporati nelle fibre scaffold PLGA. (D) Reversibilità del self-report patibolo eseguita immergendo il patibolo in soluzioni tampone alternate di pH 5.5 e pH 7.5. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 3. Immagini di microscopia confocale di cellule nanosensori interiorizzate e grafici del pH e della risposta pHi. Fluorescenza dai nanosensori internalizzati (A), FAM (verde) (B) TAMRA (red) (C), co-localizzazione di fluorescenza dal FAM e TAMRA (giallo) ( D) FAM solo nanosensori (verde) consegnato alla cultura fibroblasti 3T3d su PLGA patibolo con DRAQ5 (magenta) etichettatura del nucleo e LysoTracker Red (rosso) etichettatura dei lisosomi. La fluoresence di FAM e Lysotracker rosso non sono co-localizzati, pertanto dimostrando che è improbabile che nanosensori sono stati interiorizzati in compartimenti cellulari acide misure (E) PHI prese da nanosensori consegnati 3T3 fibroblasti in coltura su un bianco PLGA ponteggio rispetto alla calibrazione del pH di un ponteggio rilevamento pH senza la coltura di cellule. Questo dimostra anche che le misure di pH effettuata utilizzando il nanosensori internalizzati non sono acide come le cellule coltivate sul electrospun PLGA patibolo hanno mantenuto un pHi nell'intervallo 6,8-7,0. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Discussion

L'ingegneria tissutale aspira a creare sostituti biologici che può essere utilizzato sia come in vivo come modelli in vitro e in tessuto in terapia sostitutiva tessuto di riparare, sostituire, mantenere o migliorare la funzione di un particolare tessuto o organo. Sostituti sintetici sono stati utilizzati per molti anni a sostituire o riparare ausilio di tessuti, ma questi spesso falliscono a causa della scarsa integrazione con il tessuto ospite e / o infezione, che alla fine porta al rifiuto o un ulteriore intervento di revisione. Generazione di tessuti viventi in laboratorio prima dell'impianto può affrontare il problema di raggiungere la piena integrazione e ridurre la necessità di un intervento di revisione. Tuttavia, per questo obiettivo da realizzare appropriato propagazione e manipolazione di cellule all'interno costrutti 3D in vitro dovrebbero essere accompagnate appropriato condizionamento fisico del tessuto in vitro. Ciò può essere ottenuto in vari modi uno è di continuare la ricerca nella biologia fondamentalecoinvolti ma anche per ricercare i problemi di progettazione e produzione legati alla produzione di sostituti sintetici. E 'quest'ultimo aspetto che il protocollo descritto intende contribuire.

La destinazione d'uso degli scaffold PLGA descritte è quello di fornire un sostegno temporaneo per le cellule di mammifero per aiutare la loro crescita in una struttura biologicamente rilevanti. Incorporazione di analiti nanosensori reattivo nelle scaffold PLGA potrebbe consentire concentrazioni di analiti locali di essere monitorati nel corso di un costrutto 3D durante il processo di crescita dei tessuti. L'uso di pH ponteggi reattivo potrebbe consentire di determinare se acidi sottoprodotti ottenuti come le degrada patibolo e le cellule crescono vengono efficacemente rimossi all'interno di un costrutto 3D. Questo è un passo verso affrontare l'attuale mancanza di monitoraggio e controllo dei processi di rigenerazione tissutale in vitro processo. L'utilizzo di ponteggi che sono essi stessi dispositivi di rilevamento può consentire insitu, la valutazione microambientali in tempo reale. Monitoraggio del microambiente costrutto senza danneggiare il tessuto è essenziale e consentirà il monitoraggio dei processi in tutte le fasi della produzione dei tessuti.

La capacità del pH scaffold reattiva prodotta per segnalare la concentrazione dell'analita locale è stata valutata monitorando la fluorescenza uscita dai nanosensori utilizzando la microscopia confocale. Un esperimento di calibrazione è stata eseguita per il rilevamento pH ponteggio e dimostrato paragonabile a quella delle pH nanosensori reattivo non incorporati in fibre PLGA. La capacità di produrre una curva di taratura dimostra che i nanosensori rimangono sensibili alle variazioni di pH quando incluso nelle scaffold polimerico e inoltre che il processo di sterilizzazione dei ponteggi non ha causato effetti nocivi alla capacità di rilevamento di nanosensori pH. Inoltre, nanosensori sono stati consegnati per l'ambiente intracellulare di cellule in coltura su scaffold PLGA where risposta cellulare ai cambiamenti di Phi può essere monitorato. Il rapporto tra le intensità di fluorescenza dal FAM e TAMRA sono stati usati per monitorare la pHi e confrontato con un pH ponteggio reattivo, suggerendo che le cellule di fibroblasti 3T3 hanno mantenuto un pHi nell'intervallo pH 6,8-7. Covare fibroblasti 3T3 trasfettate con nanosensori con la macchia nucleare DRAQ5 indicato che la maggior parte dei cellulari nanosensori associati non sono stati trova nella regione nucleare. Posizione nanosensori non sembra essere all'interno compartimenti acidi come endosomi o lisosomi come determinato incubando la nanosensori fibroblasti 3T3 trasfettate con LysoTracker Rosso, dove co-localizzazione di FAM e LysoTracker Red verrebbe rappresentato da giallo pixel in immagini confocali. Ulteriori studi come l'analisi da microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e identificazione di marcatori biologici per le vie di internalizzazione potrebbero verificare ulteriormente. Inoltre, studi a lungo termine, come la microscopia confocale risolta in tempopotrebbe determinare il destino a lungo termine dei nanosensori all'interno delle cellule coltivate su scaffold self-reporting. Se nanosensori dovevano essere consegnate ad altri tipi di cellule allora la loro posizione deve essere identificato come il risultato può non essere la stessa di quella mostrata qui.

L'uso di ponteggi self-report hanno il potenziale di monitorare in modo non invasivo condizioni microambientali all'interno di ingegneria tessutale costrutti. Avere la possibilità di effettuare misure in situ può consentire ottimizzare la crescita di tessuto costrutti 3D in vitro non invasivo e in tempo reale. La posizione citoplasmatica dei nanosensori reattive pH può essere utilizzato per monitorare pHi durante la sperimentazione in corso. I nanosensori consegnati al l'ambiente interno delle cellule o ponteggi self-reporting possono entrambi essere utilizzati in sistemi di coltura di tessuti statici o dinamici e possono portare a determinare le condizioni di coltura necessarie per la crescita ottimale di ingegneria tessutale costrutti invitro. Ulteriore sviluppo può portare ad un sistema on-line che agiscono sulla riduzione di nutrienti garantire una costante fornitura di sostanze nutritive e ossigeno attraverso il costrutto, infine dando un metodo altamente riproducibile per la cultura di costrutti tissutali.

I protocolli descritti hanno preparato ponteggi di dimensioni adeguate per consentire l'imaging mediante microscopia confocale tuttavia, per consentire maggiore 3D costruisce per essere ripreso multi-fotone di eccitazione può essere richiesto per consentire l'imaging all'interno di costrutti più profondi. L'apparecchiatura ottica utilizzata come lente microscopio dovrebbe essere selezionato per determinare la distanza di lavoro ottimale per la lente e le dimensioni dei costrutti.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	Fisher	32221
Anhydrous dimethylformamide (DMF)	Sigma	270547
Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution	Alfa Aesar	35574	diluted to 30% (v/v) with pure water
TEOS	Sigma	13190-3
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)	Sigma	A3648
5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE)	Invitrogen	C1311
6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE)	Invitrogen	C1171
Sodium phosphate monobasic (0.2 M)	Sigma Aldrich	S-9638
Sodium phosphate dibasic (0.2 M)	Sigma Aldrich	S-0876
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
Trypsin/EDTA	Sigma Aldrich	T4174
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P0781
PBS	Sigma Aldrich	D8537
DMEM	Sigma Aldrich	D6046
FBS	Source Bioscience	Batch-213-101992
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G7513
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Optimem	Invitrogen	11058-021
LysoTracker Red	Invitrogen	L-7528
Draq5	Biostatus Ltd	DR50050
Nitrogen gas	BOC
DCM	Sigma Aldrich	320269
TFA	Sigma Aldrich	T6508
Confocal microscope	Leica TCS-SP		equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens
UV light	UVLS28 UVP, USA
Stirrer plate	SB161-3 Jencons-PLS
pH meter	Jenway model 3510
Rotary Evaporator	Buchi Rotary Evaporator R200
Centrifuge (nanosensors)	Hermle Z300
Centrifuge (cell culture)	Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo
Vortex	Whirlimixer Fisherbrand
Ultrasonicator	FB11021 Fisherbrand
Aluminum sheet	Nottingham University
35mm cell culture plate	Iwaki	3000035
10 ml syringe	Becton Dickenson
3T3 Fibroblast cells	European Collection of Cell Cultures
PLGA	Lakeshore Biomaterials	7525 DLG 7E
Pyridinium formate	Sigma Aldrich	P8535
Trypan blue	Sigma Aldrich	T8154
Sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S9638
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S5136
HCl	Sigma Aldrich	320331