Isolering af Primære myofibroblasts fra mus og Human tyktarmsvæv

Summary

Den myofibroblastlignende er en indflydelsesrig stromacellen af ​​mave-tarmkanalen, der regulerer vigtige fysiologiske processer i både normale og sygdomstilstande. Vi beskriver en teknik, der giver mulighed for isolering af primære myofibroblasts fra både mus og human colon væv, som kan anvendes til in vitro-eksperimenter.

Abstract

Den myofibroblastlignende er en stromal celle i den gastrointestinale (GI) kanal, der har vundet betydelig opmærksomhed for sin afgørende rolle i mange GI funktioner. Mens flere myofibroblastlignende cellelinjer er kommercielt tilgængelige til at studere disse celler in vitro, forskningsresultater fra en cellelinje udsættes for eksperimentel cellekultur betingelser har iboende begrænsninger på grund af den alt for reduktionistisk arbejdets art. Anvendelse af primære myofibroblasts giver en stor fordel i form af bekræftelse eksperimentelle resultater identificeret i en cellelinie. Isolering af primære myofibroblasts fra en dyremodel giver mulighed for undersøgelse af myofibroblaster under betingelser, som i højere grad efterligner den sygdomstilstand, der undersøges. Isolering af primære myofibroblasts fra human colon væv giver velsagtens de mest relevante eksperimentelle data, da cellerne kommer direkte fra patienter med den underliggende sygdom. Vi beskriver en veletableret teknik, som kan være utilized at isolere primære myofibroblasts fra både mus og human colon væv. Disse isolerede celler er blevet karakteriseret for at være alpha-glatmuskel-actin og vimentin-positive, og desmin-negative i overensstemmelse med subepithelial intestinale myofibroblasts. Primære myofibroblastlignende celler kan dyrkes i cellekultur og anvendes til forsøgsformål over et begrænset antal passager.

Introduction

Reguleringen af ​​gastrointestinal (GI) tarmkanalen funktion involverer komplekse og dynamiske samspil mellem slimhinde lag og dens underliggende mesenchyme. Disse interaktioner normalt tjener til at opretholde homøostase, men kan også føre til udvikling af sygdomstilstande under patologiske tilstande ^1. Myofibroblasts er en subpopulation af stromaceller placeret underliggende den epithellaget at kommunikere på en parakrin måde med omgivende cellesubpopulationer at regulere en række kritiske mavetarmkanalen processer, der inkluderer mucosal regenerering, reparation og fibrose ^2.

Den 18Co cellelinie er et eksempel på en human colon myofibroblastlignende cellelinie, som er blevet bredt anvendt til at undersøge myofibroblastlignende funktion, fordi den deler mange af kendetegnene ved primær in situ myofibroblasts. Heriblandt protein ekspression af a-glat muskulatur actin (α-SMA) og vimentin, såvel som ekspressionen af ​​en rækkeaf celleoverfladereceptorer, såsom den epidermale vækstfaktor receptor eller receptorer for lysophosphatidsyre ^3,4. På grund af disse delte ultrastrukturelle karakteristika, samt ligheder i biologisk funktion ⁵ har 18Co cellelinie vid udstrækning blevet anvendt til at studere myofibroblastlignende funktion i forbindelse med mange sygdomstilstande, såsom inflammatorisk tarmsygdom eller kolorektal cancer ^3,6. Der er imidlertid iboende begrænsninger og problemer ved brug af en cellelinie. Disse omfatter genotypisk ustabilitet over tid, der adskiller cellelinier fra primære celler, ændring af fænotype og biologiske funktion af cellen, herunder vækstrater og interaktioner med andre cellepopulationer. Cellelinier også mangle de normale bestanddele af GI mikromiljø (epitelial, stromal og vaskulære komponenter), som er en vigtig begrænsning for dens anvendelse. Derfor konklusionerne fra eksperimentel cellelinje forskning kræver yderligere validering for at reducere risk for fejlfortolkning.

Primære myofibroblasts kan fås fra mennesker og mus tyktarmsvæv at bekræfte eksperimentelle resultater identificeret i en celle linje ^7. Metoden blev oprindeligt beskrevet af Mahida et al. ⁸ og vores protokol er en af mange velbeskrevne teknikker, der kan anvendes til isolering primære myofibroblasts fra muse og human colon ^9. For enhver musemodel af colon sygdom, kan denne teknik bruges til at isolere primære myofibroblasts at studere, hvordan de interagerer med de omkringliggende celler eller bidrage til både normal eller patologisk GI processer ^10,11. Denne teknik kan anvendes til at undersøge, hvordan myofibroblasts bidrage til mucosale healing, fibrose og udviklingen af ​​colorektale adenomer og karcinomer. Primære myofibroblasts kan også fås fra human colon væv, der er blevet resekteret på tidspunktet for operation for godartede (inflammatorisk tarmsygdom, strikturer, diverticulitis) eller ondartet cETINGELSER. Isolerede primære celler fra mennesker og mus tyktarmsvæv kan dyrkes i cellekultur og anvendt i løbet af et begrænset antal passager.

Protocol

1.. Opnå tyktarmsvæv

Mus

En protokol til at udføre dyreforsøg, beskriver rationalet og målsætninger for forskning, blev forelagt og godkendt af vores institutionelle Office of Animal Research Oversight.

1. Aflive mus med inhaleret isofluran efterfulgt af cervikal dislokation.
2. Lav en ventral midtlinjeincision, trække tyndtarmen væk og identificere tyktarmen. Træk blæren og livmoderen (hvis tilstede) sideværts og identificere skambenet og klippe det med fine saks til at eksponere endetarmen.
3. Dissekere dorsale mesenterium af endetarmen off af tyktarmen og mobilisere tyktarmen fra anus til coecum, og transektere det til at afmontere tyktarmen fra tyndtarmen.
4. Placer prøven i iskoldt phosphatpufret saltvand (PBS).
5. Fyld en 10 ml sprøjte med iskold PBS og skyl tyktarmen lumen flere gange for at rydde indholdet, derefter skæres tyktarmen OPEn på langs med en saks.
6. Placer tyktarmen i et 50 ml konisk rør, der indeholder 20 ml iskold PBS. Tyktarmen behøver ikke at være anbragt i en bestemt orientering. Vask tyktarmen ved at erstatte PBS, indtil væsken er klar uden partikler.

Menneskelige

En protokol til at opnå humant væv fra kirurgiske patienter, beskriver betydningen af ​​at opnå dette væv samt en vurdering af potentielle risici og fordele, blev fremlagt og godkendt af vores institutionelle Office of Human Research Protection Program.

1. Forskningssamarbejde med en kolorektal kirurg er nødvendig for at være i stand til at opnå humant væv for din forskning. En protokol til at opnå menneskelig tyktarmsvæv skal forelægges og godkendes af din Institutional Review Board.
2. Skriftligt informeret samtykke er opnået fra patienten før det kirurgiske indgreb.
3. Kirurgen vil udføre en colonresektion i standerenard mode. Når tyktarmen er blevet fjernet fra patienten, er prøven straks taget til patologi. En 0,5 i fuld tykkelse afsnit af tyktarm ikke nødvendig for den patologisk vurdering er forudsat, og er straks placeret på iskold PBS. Denne model bør ikke omfatte tyktarmen mesenteriet, og epiploic vedhæng bør fjernes så godt, da tilstedeværelsen af ​​fedt vil påvirke fordøjelsesprocessen.

2. Denude epitelceller

1. Inkubér hele muse colon i 25 ml 5 mM EDTA i HBSS (stuetemperatur) i en 50 ml konisk rør. Placer konisk rør i et 37 ° C omrystning air bath (250 rpm) i 15 min. Efter 15 minutter hældes forsigtigt fra væsken og fyld røret med 25 ml 5 mM EDTA, gentages i alt 5 vaske. Til human colon, efter at have fået en ½ tomme stribe af tyktarm fra patologen skære kolon med en saks i fire lige store stykker. Placer to af stykkerne i en 50 ml konisk rør, ogPlacer de resterende to stykker af tyktarmsvæv i en separat 50 ml konisk rør. Derefter inkuberes med 25 ml 5 mM EDTA i HBSS og udfører vask, som beskrevet ovenfor.
2. Skyl tyktarmen to gange i 20 ml iskold PBS.
3. Anbring musen tyktarmsvæv i en ny 50 ml konisk rør indeholdende 20 ml RPMI-5, 10 U dispase og 2.000 U collagenase D (stuetemperatur). For den menneskelige kolon væv, bruge den dobbelte mængde dispase og collagenase (20 U dispase, 4.000 U collagenase D).
4. Glasset anbringes i et 37 ° C ryste air bad orienteret lodret (Hvis placeres vandret, der er for meget udluftning og celleskader). Ryst ved 250 rpm i op til 60 min. Efter eksponering til dispase og collagenase D, vil tyktarmsvæv begynde at fordøje og tyktarmen væv vil begynde at se trævlet. Dette tager normalt omkring 30 minutter. Når tyktarmen har dette udseende, fjerne tyktarmen fra enzymerne.
5. Ryst hvert rør op og ned 2-4 gange for at opbryde væv. Pellet væv ved 200 x g i en bordcentrifuge (4 ° C) i 5 min. Hæld forsigtigt supernatanten og kasseres.

3. Myofibroblastlignende Isolering og Kultur

1. Resuspender hver pellet ved tilsætning af 10 ml ACK-lysis-buffer (47 ° C). Der centrifugeres igen ved 200 x g i 5 minutter (4 ° C), hæld og kassér supernatanten.
2. Resuspender hver pellet ved tilsætning af 10 ml RPMI-5 med en pipette.
3. Pass halvdelen af ​​cellesuspensionen (5 ml) gennem en 70 um mesh si anvendelse af en 10 ml pipette i en 100 mm TC-behandlede skålen. Derefter tilsættes yderligere 15 ml RPMI-5. Gentag med de resterende 5 ml cellesuspension til en anden 100 mm TC-behandlede skålen. En mus kolon vil derfor give to 100 mm TC-behandlede skåle. En ½ tomme strimmel af human colon væv vil give en i alt fire 100 mm TC-behandlede skåle.
4. Placer vævskulturskåle i en 10% _{CO2-inkubator} ved 37 ° C. Dyrkningsbetingelserne er de samme feller muse og humane primære celler.
5. Efter 3 timer, forsigtigt vaske ikke-klæbende celler med to ændringer i HBSS. Resterne flydende skal vaskes forsigtigt fra. Adhærente celler er sammensat af epithelceller, makrofager og myofibroblaster. En uge efter såning, myofibroblasts kun kløft, makrofager og epitelceller senesce efter den første passage. Læg frisk RPMI-5 og dyrke cellerne i cellekultur.
6. Celler inkuberet ved trypsinisering i 5 minutter og deles 2:1.

Forkortelser

HBSS: Hank balanceret saltopløsning, RPMI-5: Roswell Park Memorial Institute medier ACK: ammoniumklorid-kalium; FCS: føtal kalveserum; TC-behandlede: vævskulturbehandlede

Løsninger

ACK-lysepuffer - (4,15 g _NH4Cl, 0,5 g _KHCO3, 18,6 mg _Na2EDTA, 400 ml _H2O, justere pH til 7,2-7,4 med 1 N HCl). Filter steriliseree gennem et 0,2 um filter og opbevares ved 4 ° C. RPMI-5 - (at 500 ml: 454,5 ml RPMI, 25 ml FCS, 5 ml 200 mM L-glutamin, 5 ml 1 M HEPES, pH 7,4, 5 ml 100 mM natriumpyruvat, 5 ml 100x Pen-Strep, 500 ml 50 mM B-ME i PBS).

Representative Results

Når isolerede, kan primære humane myofibroblasts dyrkes i cellekultur og anvendes over et begrænset antal passager (op til passagen 4). Disse celler er kendetegnet ved at være a-glat muskel-actin og vimentin positive, og desmin-negative (figur 1A), i overensstemmelse med intestinal subepithelial myofibroblasts ^5,7. De har også en karakteristisk stjerneformet morfologi (figur 1B). Primære myofibroblasts kan derefter anvendes til at bekræfte eksperimentelle resultater er identificeret i en cellelinie. Denne fremgangsmåde blev anvendt til at vise, at den pro-inflammatoriske cytokin TNF-α (10 ng / ml) inducerede opregulering af EGF-receptor-ekspression og signalering i disse celler ^7. Opreguleret EGF-receptor-ekspression og signalering blev oprindeligt fundet at udnytte de tidligere nævnte humane colon myofibroblastlignende cellelinie 18Co (figur 2). I figur 2A, viser vi, at eksponering af 18Co celler for TNF-45, førte til en tidsafhængig stigning i EGF-receptor-ekspression. Dette korrelerede med øget EGF-induceret COX-2-ekspression og p42/44 MAPK-phosphorylering i disse celler (figur 2B). For at validere disse eksperimentelle resultater blev der eksperimenter gentaget med primære humane myofibroblasts isoleret fra kirurgisk resektion kolon af patienter med colorectal cancer. Som vist i figur 2C og 2D, primære humane myofibroblasts nøje efterligner de eksperimentelle resultater oprindeligt identificeret i 18Co cellelinje ^7.

Figur 1. Primære myofibroblasts kan isoleres fra human colon væv ^7. Isolerede primære celler demonstrere en myofibroblastlignende fænotype, der er konsekvent en-SMA og vimentin positive (figur 1A), og demonstrere en stjerneformet morfologi (

Figur 2. Eksperimentelle resultater i en cellelinie er underbygget ved hjælp af primære humane myofibroblastlignende celler ^7. Den humane colon myofibroblastlignende cellelinie 18Co blev anvendt til at påvise, at TNF-α inducerer opregulering af EGF-receptor-ekspression og signalering i disse celler (figur 2A). Denne opregulering af EGF-receptor-ekspression blev associeret med forbedret EGF-receptor signalering, vist i figur 2B, hvor den efterfølgende eksponering for EGF førte til øget p42/44 MAPK-phosphorylering og COX-2-ekspression. Disse effekter blev fuldstændigt hæmmet med EGF-receptoren hæmmer AG1478. Primære humane myofibroblasts isoleret fra kirurgisk resektion kolon af patienter med colorectal cancer bekræfte disse eksperimentelle resultater (figur 2Cog 2D). Tumornekrosefaktor-alfa = TNF-α, EGFR = EGF-receptoren, AG = AG1478, COX-2 = cyclooxygenase-2. Klik her for at se større figur.

Figur 3. Primære myofibroblasts kan isoleres fra mus tyktarmsvæv. En 10X visning af primære muse myofibroblastlignende celler. Klik her for at se større figur.

Discussion

Den generelle teknik er den samme ved brug af enten mus eller human colon. Denne teknik kan også anvendes til at isolere myofibroblasts fra tyndtarmen. Specifikke detaljer til isolering af myofibroblasts fra 1.. mus og 2. human colon er beskrevet nedenfor.

1.. Mus Colon

Vanding af muse colon lettes ved at fastgøre en 4, 16 G Popper stumpendede nålen til den ene ende af tyktarmen. Det hjælper også, når tyktarmen skæring i længderetningen. Du kan harmonika tyktarmen væv på nålen, og derefter placere en spids saks med den spidse ende op og skub tyktarmsvæv over saks kant, mens der skæres at åbne den på langs.

I trin 2.1, er det vigtigt at forstå, at nukleart materiale fra døde celler kan føre til celle sammenklumpning. Tilsætningen af ​​DNase (50 mg / ml) kan anvendes til at løse dette problem.

Den mest kritiske trin er trin 2.4. Hold en caomhyggelige overvågning af tyktarmen væv. Når tyktarmen begynder at se trævlet fjerne tyktarmen fra enzymerne. Du behøver ikke at udruge tyktarmen for hele 60 min. Hvis tyktarmen væv udsættes for dispase og collagenase D for længe, ​​vil cellerne dør. Dette er en almindelig fejl, som vil resultere i et lavt celle udbytte.

Forurening af celler er et andet fælles problem. Omhyggelig teknik passende vask og filtrering vil minimere risikoen for kontaminering, sammen med standard sterile teknikker, der anvendes til celledyrkning arbejde.

2. Human colon

Længden af ​​tid for inkubationen med enzymerne afhænger af størrelsen af ​​prøven, der bliver fordøjet. Vi modtager typisk en ½ tommer fuld tykkelse strimmel af human colon væg. Der er en ændring i trin 2.3, da isolering myofibroblasts fra human colon væv. For trin 2.3, du for den menneskelige kolon skal fordoble mængden af ​​dispase (20 U) og collagenase D (4000 U) anvendes. En endnu større segment af tyktarmen vil kræve en længere inkubationstid. Også huske på, at den specifikke aktivitet af enzymerne kan variere med masser, så du måske nødt til at justere inkubationstiden i overensstemmelse hermed.

For både primær mus og menneskelige myofibroblasts, 0nce dyrkes i kultur, de isolerede celler bør evalueres for at vurdere for renhed af cellerne, og at bekræfte, at cellerne er myofibroblastlignende. Dette kan gøres med en række teknik herunder immunhistokemisk farvning (antistoffer myofibroblastlignende markører indbefatter a-glat muskel-actin og vimentin, monoklonalt antistof mod CD68 er specifikt makrofager CD31 er specifikt til endothelceller og CD45 er specifik for immuncellerne; antistoffer til e-cadherin og forskellige cytokeratiner er specifik for epitelceller. mRNA-ekspression kan også vurderes ved RT-PCR ^12. Flowcytometri kan også anvendes til celleanalyse ^13.

in vitro-og co-kultur eksperimenter. Primære celler kan også implanteres i det subkutane væv af mus til at studere celle-celle-interaktioner ^14. Fremtidige programmer kan indebære re-implantation af primære myofibroblasts ind i tyktarmen væggen i en syngen mus udnytte mus koloskopi efter genetisk manipulation.

Er også blevet beskrevet en række alternative metoder til at isolere primære myofibroblasts fra menneske og mus kolon. To er angivet nedenfor:

1. Mahida et al. Am. J. Physiol. 273 G1341-1348 (1997).
2. De Wever, et al. Int. J. Oncol. 39, 393-400, (2011).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Dispase I	Invitrogen/GIBCO	#17105-041
Collagenase D	Roche	#1 088 858
4 in, 16 G Popper blunt-end needle	Fisher	#14-825-16K