Summary
El miofibroblastos es una célula estromal influyente del tracto gastrointestinal que regula importantes procesos fisiológicos en los estados tanto normales y de enfermedad. Se describe una técnica que permite el aislamiento de miofibroblastos primarios de ratón y tejido de colon humano, que puede ser utilizado para la experimentación in vitro.
Abstract
El miofibroblastos es una célula estromal del tracto gastrointestinal (GI) que ha ido ganando considerable atención por su papel crítico en muchas funciones gastrointestinales. Mientras que varias líneas celulares myofibroblast están disponibles comercialmente para estudiar estas células in vitro, los resultados de investigación desde una línea de células expuestas a condiciones experimentales de cultivo de células tienen limitaciones inherentes debido a la naturaleza excesivamente reduccionista de la obra. El uso de miofibroblastos primaria ofrece una gran ventaja en términos de confirmación de los hallazgos experimentales identificados en una línea celular. Aislamiento de miofibroblastos primarios a partir de un modelo animal permite el estudio de los miofibroblastos en condiciones que imitan más estrechamente se estudió el estado de enfermedad. Aislamiento de miofibroblastos primarios de tejido del colon humano ofrece sin duda los datos experimentales más relevantes, ya que las células vienen directamente de los pacientes con la enfermedad de base. Se describe una técnica bien establecida que puede ser utilized aislar miofibroblastos primarias de ratón y el tejido del colon humano. Estas células aisladas se han caracterizado a ser actina alfa del músculo liso y vimentina-positivo, y negativo-desmina, consistente con los miofibroblastos subepiteliales intestinales. Células miofibroblastos primarias se pueden cultivar en cultivo celular y se utilizan para fines experimentales más de un número limitado de pasajes.
Introduction
La regulación de la función del tracto gastrointestinal (GI), implica complejas interacciones dinámicas entre la capa de la mucosa y su mesénquima subyacente. Estas interacciones normalmente sirven para mantener la homeostasis, pero también puede conducir al desarrollo de enfermedades en condiciones patológicas 1. Los miofibroblastos son una subpoblación de células del estroma situado subyacente a la capa epitelial que se comunican de una manera paracrina y la zona subpoblaciones de células para regular una serie de procesos del tracto GI críticos que incluyen la regeneración de la mucosa, la reparación, y la fibrosis 2.
La línea celular 18Co es un ejemplo de una línea celular humana de colon miofibroblastos que ha sido ampliamente utilizado para estudiar la función de miofibroblastos ya que comparte muchas de las características de primaria en miofibroblastos in situ. Estos incluyen la expresión de la proteína de un liso-actina de músculo (α-SMA) y vimentina, así como la expresión de un númerode receptores de la superficie celular tales como el receptor del factor de crecimiento epidérmico, o receptores para el ácido 3,4 lisofosfatídico. Debido a estas características ultraestructurales comunes, así como similitudes en la función biológica 5, la línea celular de 18Co se ha utilizado ampliamente para estudiar la función de miofibroblastos en el contexto de muchos estados de enfermedad tales como la enfermedad inflamatoria intestinal o 3,6 cáncer colorrectal. Sin embargo, hay limitaciones inherentes y preocupaciones al utilizar una línea celular. Estos incluyen la inestabilidad genotípica con el tiempo que diferencia líneas celulares a partir de células primarias, alterando el fenotipo y la función biológica de la célula, incluyendo las tasas de crecimiento y las interacciones con otras poblaciones celulares. Las líneas celulares también carecen de los componentes normales de la microambiente GI (epitelial, estromal, y componentes vasculares), que es una limitación importante para su uso. Por lo tanto, las conclusiones extraídas de la investigación experimental línea celular requiere una validación adicional de rsk de una mala interpretación.
Miofibroblastos primarias pueden ser obtenidas a partir de tejido de colon humano y el ratón para confirmar los hallazgos experimentales identificados en una línea celular 7. El método fue descrito originalmente por Mahida, et al. 8, y el protocolo es una de las muchas técnicas bien descritos que se pueden utilizar para aislar miofibroblastos primarios de ratón y de colon humano 9. Para cualquier modelo de ratón de la enfermedad colónica, esta técnica se puede utilizar para aislar miofibroblastos primarias para estudiar cómo interactúan con las células vecinas o contribuir a tanto normal o patológica GI procesa 10,11. Esta técnica se puede utilizar para estudiar cómo miofibroblastos contribuyen a la curación de la mucosa, la fibrosis, y el desarrollo de los adenomas y carcinomas colorrectales. Miofibroblastos primarios también se pueden obtener a partir de tejido de colon humano que ha sido resecado en el momento de la operación de (enfermedad inflamatoria del intestino, estenosis, diverticulitis) benigno o maligno Condiciones. Células primarias aisladas de tejido de colon humano y de ratón se pueden cultivar en cultivo celular y se utilizan en un número limitado de pasajes.
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Protocol
1. Obtener el tejido del colon
Ratón
Un protocolo para llevar a cabo experimentos con animales, que detalla los fundamentos y objetivos de la investigación, fue presentado y aprobado por nuestra oficina institucional de Investigación Animal de Supervisión.
- La eutanasia del ratón con isoflurano inhalado seguido por dislocación cervical.
- Haga una incisión en la línea media ventral, retraer el intestino delgado de distancia e identificar el colon. Repliegue la vejiga y el útero (si existe) lateralmente e identificar el hueso púbico y cortar con tijeras finas para exponer el recto.
- Diseccionar el mesenterio dorsal del recto fuera del colon y movilizar el colon desde el ano hasta el ciego, y seccionar para desenchufar el colon desde el intestino delgado.
- Coloque la muestra en solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo (PBS).
- Llene una jeringa de 10 ml con PBS enfriado con hielo y lavar el colon luz varias veces para borrar su contenido, a continuación, cortar la opa de colonn en sentido longitudinal con tijeras.
- Coloque el colon en un tubo cónico de 50 ml que contiene 20 ml de PBS enfriado en hielo. El colon no tiene que ser colocado en cualquier orientación particular. Lave el colon mediante la sustitución de la PBS hasta que el líquido es transparente, sin partículas.
Humano
Un protocolo para obtener tejido humano de pacientes quirúrgicos, detallando la importancia de la obtención de este tejido, así como una evaluación de los riesgos y beneficios potenciales, fue presentado y aprobado por nuestra oficina institucional del Programa de Protección de la Investigación Humana.
- Colaboración de investigación con un cirujano colorrectal es necesario ser capaz de obtener tejidos humanos para su investigación. Un protocolo para obtener tejido del colon humano debe ser presentado y aprobado por la junta de revisión institucional.
- Escrito el consentimiento informado se obtuvo a partir de la paciente antes del procedimiento quirúrgico.
- El cirujano realizará una resección de colon en el standmoda ard. Una vez que el colon se ha retirado del paciente, el espécimen es llevado inmediatamente a la patología. Un 0,5 en la sección de espesor total de la pared del colon que no sea necesario para la evaluación patológica se proporciona y se coloca inmediatamente en helado de PBS. Este espécimen no debe incluir el mesenterio del colon y apéndices epiploicos debe retirar también, ya que la presencia de grasa va a afectar el proceso de la digestión.
2. Dénudé células epiteliales
- Incubar toda la colon de ratón en 25 ml de EDTA 5 mM en HBSS (temperatura ambiente) en un tubo cónico de 50 ml. Colocar el tubo cónico en un C agitando baño de aire 37 ° (250 rpm) durante 15 min. Después de 15 minutos, se vierte con cuidado el líquido y vuelva a llenar el tubo con 25 ml de EDTA 5 mM, repita para un total de 5 lavados. Para colon humano, después de obtener una tira de ½ pulgada de la pared del colon del patólogo cortar el colon con tijeras en cuatro trozos de igual tamaño. Coloque dos de las piezas en un tubo cónico de 50 ml, y secolocar las dos piezas restantes de tejido de colon en un tubo cónico de 50 ml separado. A continuación, se incuba con 25 ml de EDTA 5 mM en HBSS y realizar lavados, como se describe anteriormente.
- Enjuague el colon dos veces en 20 ml de PBS enfriado en hielo.
- Coloque el tejido de colon de ratón en un nuevo tubo cónico de 50 ml que contiene 20 ml de medio RPMI-5, 10 U de dispasa, y 2000 U de colagenasa D (temperatura ambiente). Para el tejido del colon humano, utilice el doble de la cantidad de dispasa y colagenasa (20 U dispasa, 4.000 U de colagenasa D).
- Coloque el tubo en un baño de aire 37 ° C agitando orientada verticalmente (Si se coloca horizontalmente, hay demasiada aireación y daño celular). Agitar a 250 rpm durante un máximo de 60 min. Después de la exposición a la dispasa y colagenasa D, el tejido del colon se iniciará de digerir y el tejido del colon se comenzará a verse fibrosa. Esto por lo general toma alrededor de 30 minutos. Cuando el colon tiene esta apariencia, extirpar el colon de las enzimas.
- Agitar cada tubo hacia arriba y abajo 2-4 veces para romper el tejido. PEllet el tejido a 200 xg en una centrífuga de mesa (4 ° C) durante 5 min. Vierta cuidadosamente el sobrenadante y deséchelo.
3. Aislamiento miofibroblastos y Cultura
- Resuspender cada sedimento mediante la adición de 10 ml de tampón de lisis ACK (47 ° C). Centrifugar de nuevo a 200 xg durante 5 minutos (4 º C), verter y desechar el sobrenadante.
- Resuspender cada sedimento mediante la adición de 10 ml de RPMI-5 con una pipeta.
- Pase medio de la suspensión de células (5 ml) a través de un colador de malla 70 micras utilizando una pipeta de 10 ml en una placa de TC tratados con 100 mm. A continuación, añadir otros 15 ml de RPMI-5. Repita el procedimiento con los 5 ml restantes de la suspensión celular en una placa de 100 mm TC-tratada diferente. Por lo tanto, uno de colon de ratón producirá dos platos TC tratados 100 mm. Una tira de ½ pulgada de tejido de colon humano producirá un total de cuatro platos TC-tratada de 100 mm.
- Coloque las placas de cultivo de tejidos en una incubadora de CO2 un 10% a 37 ° C. Las condiciones de cultivo son los mismos fo el ratón y células humanas primarias.
- Después de 3 horas, lavar suavemente las células no adherentes con dos cambios de HBSS. La flotación de escombros se debe lavar suavemente. Las células adherentes se componen de células epiteliales, macrófagos y miofibroblastos. Una semana después de la siembra, sólo miofibroblastos brecha, macrófagos y células epiteliales entran en senescencia después de la primera paso. Añadir fresco RPMI-5 y crecer las células en cultivo celular.
- Las células se pasaron por tratamiento con tripsina durante 5 min y se dividen 2:01.
Abreviaturas
HBSS: solución salina equilibrada de Hank; RPMI-5: Medios de Roswell Park Memorial Institute; ACK: amonio-cloruro y potasio; FCS: suero fetal de ternero; TC-tratada: el cultivo de tejidos tratados
Soluciones
Tampón de lisis ACK - (4,15 g NH 4 Cl, 0,5 g de KHCO3, 18,6 mg de Na 2 EDTA, 400 ml de H2O, ajustar el pH a 7.2 a 7.4 con HCl 1 N). Esterilizable Filtroelectrónico a través de un filtro de 0,2 micras y se almacenan a 4 ° C. RPMI-5 - (para hacer 500 ml: 454,5 ml RPMI, 25 ml de FCS, 5 ml de 200 mM L-glutamina, 5 ml 1 M HEPES, pH 7,4, 5 ml piruvato de sodio 100 mM, 5 ml 100x Pen-Strep, 500 ml 50 mM B-ME en PBS).
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Representative Results
Una vez aislado, miofibroblastos humanas primarias se pueden cultivar en cultivo celular y se utilizan en un número limitado de pasajes (hasta el paso 4). Estas células se caracterizan por ser un suave-actina y vimentina positivo muscular, y desmina-negativo (Figura 1A), en consonancia con los miofibroblastos subepiteliales intestinales 5,7. También tienen una morfología estrellada característica (Figura 1B). Miofibroblastos primarias se pueden utilizar para confirmar los hallazgos experimentales identificados en una línea celular. Este enfoque se utilizó para demostrar que la citoquina TNF-α pro-inflamatoria (10 ng / ml) indujo la regulación por incremento de la expresión del receptor de EGF y de señalización en estas células 7. Expresión del receptor de EGF Upregulated y la señalización se encontró inicialmente utilizando la línea celular myofibroblast mencionado humana colónica 18Co (Figura 2). En la Figura 2A, que demuestran que la exposición de células 18Co a TNF-45; llevado a un aumento dependiente del tiempo en la expresión del receptor de EGF. Esto correlaciona con una mejora de la COX-2 en la expresión inducida por EGF y p42/44 MAPK fosforilación en estas células (Figura 2B). Para validar estos resultados experimentales, los experimentos se repitieron usando miofibroblastos humanos primarios aislados a partir de colon resecado quirúrgicamente de pacientes con cáncer colorrectal. Como se muestra en la Figura 2C y 2D, miofibroblastos humanos primarios imitan los hallazgos experimentales identificados inicialmente en la línea celular de 18Co 7.
Figura 1. Miofibroblastos primarias pueden ser aisladas a partir de tejido de colon humano 7. Células primarias aisladas demuestran un fenotipo de miofibroblastos como que son consistentemente un-SMA y vimentina positivo (Figura 1A) y demuestran una morfología estrellada ( 
Figura 2. Los datos experimentales obtenidos en una línea celular se fundamentan el uso de células humanas primarias myofibroblast 7. La línea celular de miofibroblastos de colon humano 18Co se utilizó para demostrar que el TNF-α induce la regulación al alza de la expresión del receptor de EGF y de señalización en estas células (Figura 2A). Esta regulación al alza de la expresión del receptor de EGF se asoció con una mejora de la señalización del receptor de EGF, que se muestra en la Figura 2B, en donde la posterior exposición a EGF condujo a aumento de la fosforilación de MAPK p42/44 y COX-2 expresión. Estos efectos fueron completamente inhibidas con el inhibidor del receptor de EGF AG1478. Miofibroblastos humanos primarios aislados de de colon resecado quirúrgicamente de pacientes con cáncer colorrectal confirman estos hallazgos experimentales (Figuras 2Cy 2D). Factor de necrosis tumoral alfa = TNF-α, EGFR = receptor de EGF, AG = AG1478, la COX-2 = la ciclooxigenasa-2. Haga clic aquí para ver más grande la figura. 
Figura 3. Miofibroblastos primarias pueden ser aisladas a partir de tejido de colon de ratón. Una vista 10 veces más de células myofibroblast ratón primarios. Haga clic aquí para ver más grande la figura.
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Discussion
La técnica general es similar cuando se utiliza el ratón o de colon humano. Esta técnica también se puede utilizar para aislar miofibroblastos en el intestino delgado. Los detalles específicos para el aislamiento de miofibroblastos de 1. ratón y 2. colon humano se discuten a continuación.
1. Ratón Colon
Irrigación del colon de ratón se facilita uniendo un 4 en, 16 G Popper aguja de extremo romo a un extremo del colon. Esto también ayuda al cortar el colon longitudinalmente. Puede acordeón el tejido del colon en la aguja, y luego coloque una punta de la tijera con la punta hacia arriba y deslice el tejido del colon por encima del borde de tijera durante el corte para abrirlo longitudinalmente.
En el paso 2.1, es importante entender que el material nuclear de las células muertas puede conducir a la formación de grumos de células. La adición de ADNasa (50 mg / ml) puede ser utilizado para hacer frente a este problema.
El paso más importante es el paso 2.4. Mantenga un careloj Reful del tejido del colon. Cuando el colon comienza a verse fibrosa, extirpar el colon de las enzimas. No es necesario incubar los dos puntos para toda la 60 min. Si el tejido del colon se expone a la dispasa y colagenasa D durante demasiado tiempo, las células morirán. Este es un error común que se traducirá en un rendimiento bajo de células.
La contaminación de las células es otro problema común. Técnica cuidadosa, el lavado apropiado y el filtrado se minimice el riesgo de contaminación, junto con técnicas estériles estándar utilizados para el trabajo de cultivo de células.
2. Colon humano
La longitud de tiempo para la incubación con las enzimas depende del tamaño de la muestra que se está digiriendo. Por lo general recibimos una tira de espesor total de ½ pulgada de la pared del colon humano. No es una modificación en el paso 2.3 al aislar miofibroblastos de tejido de colon humano. Para el paso 2.3, por colon humano debe duplicar la cantidad de dispasa (20 U) y collagenase D (4000 U) utilizado. Un segmento aún mayor de cáncer de colon requerirá un tiempo de incubación más largo. Además, tenga en cuenta que la actividad específica de las enzimas puede variar con una gran cantidad, por lo que puede que tenga que ajustar el tiempo de incubación en consecuencia.
Tanto para ratón primario y miofibroblastos humanos, 0nce crecido en cultivo, las células aisladas deben ser evaluados para determinar la pureza de las células y para confirmar que las células son parecidas a miofibroblastos. Esto se puede hacer con una variedad de la técnica incluyendo la tinción inmunohistoquímica (anticuerpos a miofibroblastos marcadores incluyen un suave-actina y vimentina muscular; anticuerpo monoclonal para CD68 es específico de macrófagos, CD31 es específico a las células endoteliales, y CD45 es específico para las células inmunes; anticuerpos a E-cadherina y diversas citoqueratinas son específicos para las células epiteliales. expresión de ARNm también puede ser evaluada por RT-PCR 12. citometría de flujo también se puede utilizar para el análisis de células 13.
in vitro y co-cultura de la experimentación. Las células primarias también se pueden implantar en el tejido subcutáneo de ratones para estudiar las interacciones célula-célula 14. Las futuras aplicaciones pueden implicar reimplantación de miofibroblastos primarios en la pared del colon de un ratón singénico utilizando colonoscopia ratón después de la manipulación genética.
Un número de métodos alternativos para aislar miofibroblastos primarias de humano y de colon de ratón también se han descrito. Dos son los siguientes:
- Mahida, et al. Am. J. Physiol. 273 G1341-1348, (1997).
- De Wever, et al. Int. J.. Oncol 39, 393-400, (2011).
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Disclosures
Los autores tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Grant 5KO8DK085136-02 a JY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dispase I | Invitrogen/GIBCO | #17105-041 | |
| Collagenase D | Roche | #1 088 858 | |
| 4 in, 16 G Popper blunt-end needle | Fisher | #14-825-16K |
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