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Immunology and Infection

La alimentación de las garrapatas de los animales para Transmisión y xenodiagnóstico en Lyme Investigación de Enfermedades

Published: August 31, 2013 doi: 10.3791/50617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Division of Bacteriology & Parasitology, Tulane National Primate Research Center, Tulane University Health Sciences Center

Summary

La enfermedad de Lyme es la enfermedad transmitida por vectores más comúnmente reportados en América del Norte. El agente causante, Borrelia burgdorferi es una bacteria espiroqueta transmitida por garrapatas ixódidas. Transmisión y detección de la infección en modelos animales se optimiza mediante el uso de la alimentación de la señal, que se describe aquí.

Abstract

La transmisión del agente etiológico de la enfermedad de Lyme, Borrelia burgdorferi, se produce por la unión y la alimentación de la sangre de la especie Ixodes garrapatas en huéspedes mamíferos. En la naturaleza, este patógeno bacteriano zoonótico puede utilizar una variedad de reservorios, pero el ratón de patas blancas (Peromyscus leucopus) es el principal reservorio de larvas de garrapatas y de ninfas en América del Norte. Los seres humanos son huéspedes accidentales más frecuentemente infectados con B. burgdorferi por la picadura de garrapatas en la etapa de ninfa. B. burgdorferi se adapta a sus anfitriones durante todo el ciclo enzoótica, por lo que la capacidad de explorar las funciones de estas espiroquetas y sus efectos en huéspedes mamíferos requiere el uso de la alimentación de la garrapata. Además, la técnica de xenodiagnóstico (utilizando el vector natural para la detección y la recuperación de un agente infeccioso) ha sido útil en los estudios de la infección críptica. Con el fin de obtener de ninfa garrapatas que puerto B. burgdorferi,garrapatas se alimentan espiroquetas vivas en la cultura a través de tubos capilares. Dos modelos animales, ratones y primates no humanos, son los más utilizados para los estudios de la enfermedad de Lyme que involucran la alimentación de la garrapata. Demostramos los métodos por los cuales estas garrapatas pueden ser alimentados en, y se recuperaron de los animales, ya sea para una infección o xenodiagnóstico.

Introduction

En 2011, la enfermedad de Lyme es la sexta enfermedad de declaración obligatoria a nivel nacional más común en América del Norte ( http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html ). B. burgdorferi es un microbio versátil, tanto genética y antigénicamente (revisado en 1). Su constitución genética incluye un grande (> 900 kB) cromosoma y hasta 21 plásmidos (12 lineales, circulares 9), con un contenido variable plásmido entre los aislados. Hay mucho que aprender acerca de esta espiroqueta, ya que más del 90% de los marcos de lectura abierta de plásmidos no están relacionados con ninguna de las secuencias bacterianas conocidas 2,3. B. burgdorferi presenta una amplia variedad de antígenos como posibles objetivos de la inmunidad del huésped. Sin embargo, una infección no tratada a menudo persiste. La interacción de las espiroquetas con el medio de la garrapata y el medio ambiente hospedador vertebrado exige una adaptación de B. burgdorferi en todo el proceso de infección. Codificada-plásmido Varioslos genes son conocidos por ser expresadas diferencialmente en respuesta a cambios en la temperatura, el pH, la densidad celular e incluso etapa del ciclo de vida de garrapata 4-8.

El estudio de B. adaptación burgdorferi lo largo de su ciclo de enzoótica, y las respuestas del huésped después de la infección por la ruta natural se basa en la capacidad de alimentar las garrapatas en modelos animales apropiados. Este tipo de estudios se reunieron con los retos técnicos de la generación de garrapatas que albergan B. burgdorferi, y garantizar el transporte y / o alimentación eficiente de garrapatas en el modelo de acogida. Además, la contención y la recuperación de las garrapatas infectadas es esencial. Entre los modelos utilizados son ratones y primates no humanos, cada uno de los cuales sirve como una herramienta valiosa en la investigación de la enfermedad de Lyme. Al igual que con el ratón de patas blancas, que es un huésped reservorio natural para B. burgdorferi, el ratón de laboratorio es un anfitrión muy susceptibles que apoya la infección persistente por parte B. burgdorferi 9. FolLowing infección de ratones susceptibles de enfermedades, como la cepa C3H, las espiroquetas difunden a varios tejidos, incluyendo la piel, la vejiga, los músculos, las articulaciones y el corazón. Las respuestas inflamatorias a la infección conducen al corazón enfermo y el tejido articular. Mientras que las espiroquetas persisten en este host y siguen siendo infecciosas, lesiones inflamatorias pueden llegar a ser intermitente, no muy diferente del proceso en los seres humanos. Así pues, el modelo de ratón ha proporcionado mucha información sobre B. la patología inducida por burgdorferi, incluyendo la artritis y la carditis y respuestas inmunes del huésped 10-12. Desde la perspectiva del patógeno, ciertos genes expresados ​​diferencialmente durante la infección de mamíferos se han caracterizado, como tener algún necesario para la transmisión a partir del vector garrapata 13-21.

Aunque varias especies de animales se han utilizado para estudiar la enfermedad de Lyme 22, macacos rhesus imitan más de cerca el carácter multi-órgano de la enfermedad humana 23. A diferencia de otrosmodelos animales, la amplitud de manifestaciones de la enfermedad tales como eritema migratorio, la carditis, la artritis, la neuropatía y de los sistemas nerviosos periférico y central se observaron en macacos. En ratones, el huésped reservorio de B. burgdorferi, la enfermedad varía según la cepa de ratón y los 24 años, mientras que las manifestaciones tempranas y tardías diseminada son infrecuentes 9. Además, otros roedores, lagomorfos, y caninos todos fallan en exhibir enfermedad neurológica de B. burgdorferi infección 25. Es importante destacar que los macacos muestran signos característicos de las tres fases de la borreliosis de Lyme, a saber,,-diseminada temprana temprana localizada, y la enfermedad de Lyme en etapa tardía 26-28. Eritema migrans (EM) se cree que ocurre en el 70-80% de los casos en humanos 29, y también se observaron en macacos rhesus 28,30. Después de la infección, las espiroquetas difunden desde el sitio de la inoculación a múltiples órganos. ADN espiroquetas se ha detectado en MU esqueléticoscles, corazón, la vejiga, los nervios periféricos y del plexo, así como en el sistema nervioso central (cerebro, tronco cerebral y cerebelo, médula espinal, y duramadre) 31.

Marque alimentándose de ratones ha sido utilizada por nosotros y otros equipos de investigación para la propagación de las colonias de garrapatas, en competencia como reservorio estudia 32-36 y en los estudios de B. burgdorferi patogenia 37-40. Esta técnica también se ha utilizado para xenodiagnóstico y pruebas de eficacia de la vacuna en ratones 41-44. Hemos alimentado Ixodes garrapatas en primates no humanos para el desarrollo del modelo 28, un estudio de la eficacia de la vacuna de 45 años, y para el xenodiagnóstico en la evaluación de la persistencia del tratamiento post-antibiótico 46. Las garrapatas que puerto B. burgdorferi se puede mantener en un ciclo enzoótico naturales por la alimentación de las larvas en los ratones infectados y el uso de las ninfas de los estudios, como las espiroquetas se transmiten a través de las etapas de la vida. En este informe, Instruimos sobre cómo generar garrapatas infectadas con el tipo salvaje o mutante B. burgdorferi, con alimentación por tubo capilar. Esto también se puede lograr mediante microinyección 47 y por inmersión 48. El propósito de la introducción artificial de B. burgdorferi en las garrapatas pueden ser para estudiar cepas mutantes cuya transmisibilidad es desconocido, para generar un grupo de garrapatas con una alta tasa de infección, y para reducir el potencial de error mediante el mantenimiento de una colonia garrapata limpio y de lo contrario no infectada. Además, demostramos marcar la alimentación en ratones y primates no humanos, así como para asegurar la contención y recuperación de las garrapatas repletas. El uso de marcar la alimentación es esencial para futuros estudios de la respuesta inmune a B. burgdorferi infección, el potencial de eficacia de la vacuna de Lyme y xenodiagnóstico para la detección de infecciones ocultas.

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Protocol

Un esquema experimental de la inoculación de la garrapata y la alimentación de los animales para la investigación La enfermedad de Lyme se representa en la figura 1.

1. Inocular ninfas Ixodes garrapatas con B. burgdorferi Uso Capilar-La alimentación por sonda

Al realizar manipulaciones con las garrapatas, se usan batas blancas con mangas elásticas, guantes y gorras bouffant desechables.

  1. Nuestra técnica es una versión modificada de la reportada por Broadwater et al. 49. Preparar tubos capilares calentando y tirando pipetas Pasteur para romper la delgadez con un extractor pipeta. Con unas pinzas de disección y alcance, romper los consejos para el diámetro óptimo (aproximadamente 0,2 mm). Un tubo estandarizado para el tamaño mouthpart garrapata se utiliza como guía de tallas. Un protector de la cara debe ser usado en la preparación de las pipetas.
  2. Crecer B. burgdorferi a entre 2-8 x 10 7 / ml (fase semilogarítmica) en BSK-H medio (Sigma) CONconteniendo 6% de suero de conejo.
  3. Utilice las garrapatas ninfa que se han almacenado a 23 ° C durante 4-6 semanas después de la muda de las larvas. Marque, a un pequeño de 60 x 15 mm placa de Petri con cinta de doble cara en la superficie inferior externa del plato. Coloque el lado ventral garrapatas hacia arriba.
  4. Sumerja la punta del tubo capilar en el B. tubo de cultivo burgdorferi después de la mezcla. Coloque el tubo capilar sobre el hipostoma de las partes de la boca garrapata con un microscopio de disección. Utilice la arcilla de moldeo para fijar el tubo en su lugar, como se muestra en la Figura 2A.
  5. Coloque las placas de Petri con las garrapatas Colocada en el interior de una gran bañera de plástico transparente para un mayor nivel de contención. Se añaden las toallas de papel húmedas para proporcionar la humedad. Coloque las garrapatas en un incubador térmica 37 ° C durante 30 h min-2 hasta la defecación es aparente. Esto indica que los medios de comunicación que contienen espiroquetas ha pasado a través de la garrapata.
  6. Descanse las garrapatas durante 2-4 semanas a 23 ° C para permitir la adaptación al medio de garrapatas antes de alimentarellos en animales.

2. La infección de ratones con B. burgdorferi por Tick

  1. Diluir ketamina Stock 1:10 en agua estéril. Se anestesia cada ratón con 100 mg / kg de ketamina por inyección intraperitoneal con una jeringa de tuberculina
  2. Una vez que el ratón está totalmente anestesiado, afeitarse el ratón de los oídos a la media de la espalda utilizando una multa (Remington suave y sedoso) condensador de ajuste eléctrico.
  3. En una cacerola blanca con ningún otro objeto cercano, transfiera las garrapatas ninfa (aquel puerto B. burgdorferi) por un pincel humedecido a la zona sin pelo del ratón. Alternativamente, las garrapatas no infectadas se pueden colocar en los ratones para xenodiagnóstico de ratones con infección sospechoso. El uso de una superficie limpia y blanco para la colocación de garrapata ayuda a asegurar que las garrapatas no unidas se verán fácilmente.
  4. Coloque el ratón en jaulas especializada (Allentown introducción en jaula, Allentown, PA). La introducción en jaula consiste en una parrilla de acero inoxidable elevado desde el fondo de la jaula. Tél cima de la jaula fue modificada por nuestro propio taller de máquinas para elevar el soporte para botellas de agua suficiente como para permitir el libre movimiento del ratón debajo. La bandeja está llena de alrededor de ½ pulgada de agua para atrapar cualquier garrapata que se caen de los ratones (Figura 3A). Para minimizar el riesgo de hipotermia, almohadillas de calor reutilizables, cocinados en el microondas antes de su uso, se colocan debajo de las jaulas hasta que los ratones despiertan completamente de la anestesia. Los animales son a menudo atáxica mientras se recupera de la anestesia y rozar la alimentación y bandejas de agua, por lo que estos deben ser removidos. El nivel del agua es lo suficientemente baja para evitar las extremidades de los ratones de la sumersión.
  5. Coloque la jaula dentro de una bandeja que se ha alineado con la trampa de Maraña pasta (Contech, Victoria, BC, Canadá) y cinta adhesiva para asegurar el atrapamiento de los artrópodos. Los ratones se enjaularon individualmente y se observaron continuamente durante el período de la anestesia.
  6. Dentro de 2 horas, cuando los ratones son completamente despierto de la anestesia, la bandeja de la comida y la botella de agua son reemplazados a la jaula. Después de 24 horas, se sustituye el enriquecimiento de la vivienda que consta de una cabaña de plástico y Nylabone.
  7. Después de 3, 4 y 5 días, verifique el ratón, la jaula y el agua jaula por garrapatas alimentadas. El agua jaula se tamiza a través de un recipiente de metal blanco (es decir, "el lavado de oro"). Enjuague alimentado las garrapatas en agua limpia y almacena en frascos de plástico (Figura 3B). En los días 3 y 4, reemplazar el agua en la jaula con agua limpia. El día 5, comprobar no sólo la jaula, pero el ratón a fondo en busca de garrapatas. Por lo general, a estas alturas todas las garrapatas han alimentado y los ratones pueden ser vuelto a introducir en la jaula regular.
  8. Coloque todos los residuos de las jaulas de ratones, incluyendo líquidos, en cajas de seguridad para el autoclave y la eliminación. Mantenga un registro del número de garrapatas colocados en los ratones y los recuperados en todo momento.

3. La alimentación de las garrapatas en primates no humanos para la infección por B. burgdorferi o xenodiagnóstico

  1. Prepare el dispositivo de contención de garrapata: Cortar un círculo de diámetro 1 ¾ de pulgada de la pulgada x 33 pulgadas LeFlap (colgajo), utilizando un bisturí limpio y la guía de medición. Utilice la corte como una plantilla para cortar círculos del mismo tamaño en la espuma Biatane y Duoderm. La espuma se usa para elevar solapa sobre la superficie de la piel y evitar la posible aplastamiento de garrapata. El Duoderm añade otra capa de amortiguación y se superpone a los bordes del dispositivo de contención para mayor seguridad de escapar de la garrapata. Un diagrama del dispositivo de contención se representa en la Figura 4.
  2. El personal veterinario anestesiar al animal con 5-8 mg / kg de Telazol por inyección intramuscular.
  3. Clip el pelo del animal usando condensador de ajuste eléctrico (Oster) equipado con el tamaño de 40 cuchillas. Todas las áreas que serán cubiertas por la chaqueta se recortan: espalda, frente, brazos. El uso de la crema de afeitar y maquinillas de afeitar desechables de doble cuchilla, afeitado de cerca un área de aproximadamente 25 cm x 20 cm vertical, horizontal. Limpie con toallas de papel húmedas y secar con calor bajo para secar la piel.
  4. Coloque la tapa en tél de animales dorso, justo debajo de la escápula, a cada lado de la columna vertebral. Use un marcador para trazar el círculo en ese lugar. Prepare el área de la piel alrededor del círculo frotándola con SkinPrep. Esto elimina el aceite en la piel que podrían afectar a la adhesión de los dispositivos de pegamento y contención. Dejando alrededor de una circunferencia de 1 cm de espacio alrededor del círculo, aplicar una capa de pegamento de la piel (SkinBond) con un ancho de ~ 4 cm.
  5. Retire el adhesivo de la espuma Biatane y colocar sobre la piel en el lugar apropiado. Los animales son nuevamente anestesiados por el personal veterinario con 5 mg / kg Telazol. Selle los bordes con pegamento de la piel y la cinta Hypafix. Retire el adhesivo de la solapa y colocar en la parte superior de la Biatane. Coloque cinta Hypafix alrededor de los bordes de la LeFlap, a continuación, con cinta adhesiva la solapa de malla de la solapa y colocar la chaqueta en el animal. Pasta de cinta y Trampa Maraña se aplica al suelo en un perímetro que rodea a la introducción en jaulas de primates no humanos para mayor seguridad.
  6. Para minimizar los efectos de chemicals utilizados en Step 3,4 sobre la alimentación de garrapatas, las garrapatas se añaden 24 horas después de que el dispositivo de contención está en su lugar. En este punto, la seguridad del dispositivo también es inspeccionado y reforzado si es necesario. Por lo general, se añaden 20 ninfas sin alimentar (muda 4-8 semanas post-larval) a la piel en el dispositivo utilizando un pincel.
  7. Retire el adhesivo de la malla de la tapa y el sello en su lugar. Por último, retire el respaldo Duoderm para exponer el adhesivo y colocar en la parte superior del dispositivo de contención. Añadir un trozo de cinta Hypafix a través del círculo de malla abierta, y vuelva a colocar la cubierta. El dispositivo de contención completado se muestra en la Figura 5A.
  8. Después de 5 días, anestesiar a los animales como anteriormente y se eliminan las chaquetas. Retire la cinta primero para inspeccionar marcar la alimentación a través de la malla (Figura 5B). Retire con cuidado el Duoderm lejos de la solapa.
  9. Tire hacia atrás de la porción de malla en los bordes para facilitar el acceso a las garrapatas. Garrapatas de la Fed se encuentran con frecuencia cerca o debajo deel círculo de espuma (Figura 5 C) y se retiran y se colocan en agua limpia con un pincel. Retire el dispositivo una vez que se recogen todas las garrapatas alimentadas visibles (Figura 5D).

Nota: A menudo, el dispositivo de contención simplemente se puede despegar de la piel. Si la adherencia es fuerte y potencialmente podría dañar la piel, Unisolve disolvente se aplica a la zona para la eliminación suave. La piel se limpia con isopropanol y garrapatas se almacenan a 23 ° C. Si se utiliza para la infección, las garrapatas pueden ser aplastados para confirmar el número que contenía B. burgdorferi. Si se utiliza para el xenodiagnóstico, las garrapatas se mantienen durante 1-3 semanas antes del análisis del contenido del intestino medio.

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Representative Results

Tras la finalización de la alimentación capilar, las garrapatas son típicamente descansaban a 23 ° C durante 2-3 semanas antes de que se alimentan de animales para la transmisión. El uso de la técnica de alimentación capilar, se ha encontrado que más del 90% de la Fed garrapatas puerto B. burgdorferi. El porcentaje de las garrapatas positivas se determina mediante lavado garrapatas en peróxido y etanol, y luego aplastarlas en PBS estéril con una mano de mortero en forma de tubo de microcentrífuga. Los contenidos del intestino medio se derramaron en el PBS se fijan en portaobjetos y se tiñeron con un anticuerpo anti-especie de Borrelia que es conjugada con FITC. Representante frotis del intestino medio garrapata vistos por microscopía de fluorescencia se representan en la Figura 2B-C

Las tasas de infección del ratón con pocos pases cepa B31 tipo salvaje B. burgdorferi son cerca de 100%. Una combinación de la serología y cultivo de B. burgdorferi de tejidos de ratón se utiliza para determinar si cada ratón se ha infectado. A showi western blotng respuestas de anticuerpos en suero de ratones infectados con B. burgdorferi por garrapata se muestra en la Figura 3C. Esta técnica se ha utilizado para examinar la transmisibilidad y la infectividad de B. mutante burgdorferi cepas de 37-39.

Hemos utilizado la alimentación garrapata en primates no humanos para la infección y para el xenodiagnóstico. Se han hecho esfuerzos para mejorar la alimentación de la garrapata y la recuperación de las garrapatas totalmente alimentadas por la aplicación del dispositivo de contención de la aleta. El producto colgajo se utiliza para la aplicación de larvas medicinales en los seres humanos, pero se ha modificado para garrapatas se alimentan de primates. En estudios previos, se utilizó una cápsula dura de garrapata contención 27,28,45,46 y obtuvimos una tasa de alimentación de media (# alimentado las garrapatas / # garrapatas añadido a cápsulas) del 35,2%, oscilando entre 23,5 a 52,5%. En estudios de la infección, las tasas de transmisión (# animales infectados / # alimentado de) promediaron 86,5%. En experimentos más recientes, las tasas de alimentación utilizando LeFlap han sido de entre 50-90%. En raras ocasiones, utilizando el método anterior, las garrapatas se metió debajo de la cápsula y en la cinta adhesiva, en el que se secan y mueren. El uso de la solapa de la mejora de la alimentación y de múltiples capas de adhesivo han mantenido las garrapatas contenidos.

Además de la tinción fluorescente directa de garrapata preparación del intestino medio (Figura 2B-C), los métodos más sensibles se pueden utilizar para detectar B. burgdorferi en garrapatas. Detección molecular puede, y se ha utilizado para detectar B. -burgdorferi específica de ADN 42,50,51 con ya sea estándar o PCR cuantitativa. Objetivos comunes para la detección son la flacidez 46,50, OspC 46 y OspA 42,51 genes. La viabilidad de las espiroquetas recuperados también ha sido examinada por la cultura de los preparativos del intestino medio y xenodiagnóstico alimentando garrapatas en ratones ingenuo 42.

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Figura 1. La alimentación de las garrapatas en los animales para la transmisión de Borrelia burgdorferi. Esquema general de las técnicas utilizadas para la alimentación de las garrapatas de los animales para los estudios de la enfermedad de Lyme. Las garrapatas son cultivos en tubos alimentados con capilares de B. burgdorferi y puede ser alimentado en modelos animales de la enfermedad de Lyme, como ratones y primates no humanos (macacos rhesus). Haz click aquí para ver más grande la figura .

Figura 2
Figura 2. El método y los resultados. A)-alimentación por tubo capilar El aparato utilizado para alimentar las garrapatas en muestra, con una vista ampliada del tubo de la garrapata y capilar a la derecha. BC) imágenes representativas de los intestinos medios de garrapatas alimentadas B. burgdorferi. sme El intestino medioars fueron teñidas con anti-Borrelia anticuerpos policlonales de especies con FITC (Kirkegaard & Perry Labs) y mirado bajo el microscopio fluorescente.

Figura 3
Figura 3. Ixodes scapularis garrapatas se alimentan de ratones de laboratorio. A) La introducción en jaula especializada para los ratones cuando se utiliza para la alimentación de la garrapata. El piso de alambre se eleva por encima de un recipiente con agua para recoger las garrapatas. Un ratón anestesiado se muestra en la imagen de la derecha. B) Los recipientes de almacenamiento utilizadas para las garrapatas. C) inmunotransferencias representativas de los ratones con garrapatas infectadas. El suero de 21 días después de la infección se utilizó para sondar transferencias que contienen B. lisados ​​burgdorferi y la proteína OspC recombinante, un antígeno inmunodominante.

Figura 4
Figura 4. Diagrama del dispositivo de contención de la garrapata utilizado para la alimentación de las garrapatas en macacos rhesus. La primera capa consiste en espuma Biatane. El colgajo se coloca en la parte superior de la espuma y la Duoderm es la tercera capa. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

La figura 5
Figura 5. Ixodes scapularis garrapatas se alimentan de macacos rhesus. A) El dispositivo de contención completa. B, C) ​​Puntos de vista de las garrapatas se alimentan a través del dispositivo, y después de la extracción de la tapa. D) El sitio de marcar la alimentación después de la extirpación completa de la dispositivo.

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Discussion

Con el fin de obtener las garrapatas que puerto B. burgdorferi para estudios posteriores, las garrapatas pueden ser: (1) que se nutre de los ratones infectados en la etapa larval, (2) sumergido en B. culturas burgdorferi, ya sea en la etapa de larva o ninfa; 48 (3) microinyectaron con B. burgdorferi 47; o (4) alimentado-tubo capilar B. burgdorferi 49. Aunque cada uno de estos métodos tiene su propósito, para asegurar que una gran porción de las garrapatas que se utilizará para el puerto de la infección por B. burgdorferi, estamos a favor de la alimentación por tubo capilar. Si no se requiere la inoculación con cantidades conocidas de espiroquetas, los métodos de alimentación capilar pueden tener menos potencial de dañar las garrapatas. Esto es de importancia si se quiere alimentar a los animales. Este método también puede ser preferible si los investigadores están probando los mutantes de transmisibilidad / infectividad. Es importante reconocer que el crecimiento en cultivo puede resultar en la pérdida de plásmido 52, por lo que el uso debajo pasaje B. burgdorferi es esencial. Además, el medio y la densidad de espiroquetas es artificial después de la introducción, por lo que las garrapatas no deben utilizarse inmediatamente después de la alimentación capilar. En su lugar, se concederá un plazo de no menos de 2 semanas para que las espiroquetas se adapten al microambiente garrapata antes de su uso en los experimentos.

Cuando la alimentación de garrapatas en los ratones, no es necesario rasurar los ratones de antemano. En un estudio anterior (sin publicar) en el que hemos tratado de examinar los efectos de la saliva de garrapata en la piel, el afeitado era necesario. De este modo, y contra intuitiva, hemos descubierto que las garrapatas: a) fijar fácilmente a la piel sin pelo, b) tienen una alta tasa de alimentación, y c) son fácilmente visibles. Las tasas de alimentación varían dependiendo de si las larvas o ninfas se utilizan, pero son consistentemente por encima de 50% cuando se utilizan ninfas. Como tal, el afeitado ratones antes de la alimentación se ha convertido en práctica común en nuestro laboratorio, no sólo para los experimentos, sino también para la propagación de la colonia. Previamente, en nuestra División del Centro de Investigación Nacional de Primates de Tulane, 34 monos se han alimentado de por 770 ninfas Ixodes en 5 estudios diferentes. Marque las tasas de alimentación (# fed / # añade a cápsulas) promedio de 35.2%, que oscilan entre los 23,5 a 52,5%. En estudios de la infección, las tasas de transmisión media del 86,5%. En un estudio piloto reciente (no publicado), tick alimentación tasas variaron desde 5 hasta 75% y ninguna resistencia a la alimentación posterior fue aparente. Sin embargo, las tasas de éxito entre los intentos de 2 y 3 variaron significativamente, en donde las tasas de lactancia eran mucho más altos para el intento 3 º de la 2 ª. Las garrapatas "intento 2" se alojaron a temperatura ambiente mayor que el "intento de 3" garrapatas. El factor más importante que hemos encontrado que afecta a la alimentación de garrapatas es la edad de la garrapata y del entorno previa al experimento. Los mantiene a 4 ° C después de la muda hasta poco antes de usar generalmente se alimentan mejor. Como tal, le recomendamos que se propaga continuamente garrapatas, almacenándolos accordingly, y que tiene dos lotes diferentes de garrapatas disponibles cuando se realiza la alimentación de los animales.

En nuestro estudio más reciente (no publicado) se comparó la alimentación de las garrapatas en macacos utilizando la cápsula dura de la alimentación con el dispositivo de solapa. Diez monos fueron alimentados a una vez con cápsulas y dos veces con LeFlap. En esta serie de experimentos, se observó y tasa de alimentación promedio de 17% (rango 5-25%) con las cápsulas y una tasa promedio de 54.75% (rango 35-90%) con la solapa. Suponemos que la superficie más amplia para la alimentación de la garrapata y la reducción del uso de adhesivos duros mejora la alimentación. El uso de la solapa de contención también permite a los investigadores que permita que sea garrapatas se alimentan ya o añadir más garrapatas, como la garrapata puede ser retirado sin la eliminación de todo el dispositivo. Por último, aunque los adhesivos pueden causar irritación leve de la piel en algunos animales (que podrían afectar o inducir respuestas inmunes cutáneas) el propio dispositivo colgajo puede haber limitado, si alguno, incomodidad para los animales.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Nicole Hasenkampf y Amanda Tardo para soporte técnico. También queremos agradecer a los Dres. Linden Hu y Adriana Marques por recomendación del dispositivo de contención LeFlap, y el Dr. Lise Gern para obtener instrucciones sobre el método de alimentación capilar. Este trabajo fue apoyado por el NIH / CNRR Beca 8 P20 GM103458-09 (MEE) y por el Centro Nacional para Recursos de Investigación y la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación (ORIP) de los Institutos Nacionales de Salud a través de P51OD011104/P51RR000164 subvención.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
BSK-H Sigma B-8291
Ketamine HCl
Tangle Trap coating Paste Ladd research T-131
SkinPrep Allegro Medical Supplies 177364
LeFlap, 3" x 3" Monarch Labs
Hypafix tape Allegro Medical Supplies 191523
SkinBond Allegro Medical Supplies 554536
UniSolve Allegro Medical Supplies 176640
Biatane Foam, adhesive 4"x4" Coloplast 3420
DuoDerm CGF Dressing - 4" x 4", (3/4)" adhesive border Convatec 187971
Nonhuman primate jackets with flexible 2" back panels; add drawstrings at top and bottom Lomir Biomedical Inc.
EQUIPMENT
Pipet puller David Kopf Instruments Model 700C
Dark field microscope Leitz Wetzlar Dialux
Dissecting microscope Leica Zoom 2000
Mouse caging Allentown caging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Embers, M. E., Grasperge, B. J., Jacobs, M. B., Philipp, M. T. Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research. J. Vis. Exp. (78), e50617, doi:10.3791/50617 (2013).

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