Summary
Мы описываем методологию для выполнения генетического анализа в Chlamydia на основе химического мутагенеза и секвенирование целого генома. Кроме того, система ДНК обмена в инфицированных клетках описано, что могут быть использованы для генетического картирования. Этот метод может быть широко применима к микробных системах без системы трансформации и молекулярно-генетические инструменты.
Abstract
Хламидиоза, этиологическим агентом венерических заболеваний и глазных инфекций, остается слабо изучен из-за его несговорчивости экспериментальным преобразование с рекомбинантной ДНК. Мы разработали подход для выполнения генетического анализа в C. трахоматис несмотря на отсутствие молекулярно-генетических инструментов. Наши способ включает: а) химический мутагенез быстро генерировать подробные библиотеки генетически определенных мутантов с различными фенотипами; II) целого генома (ВГС) для отображения основных генетических повреждений и найти связь между мутировавший ген (ы).. общий фенотип. III) поколение рекомбинантных штаммов через ко-инфекции клеток млекопитающих с мутантным и диких бактерий типа. Соответственно, мы смогли установить причинно-следственные связи между генотипами и фенотипами. Сочетание химически индуцированного изменения генов и WGS установить корреляционные генотип-фенотип ассоциации ШоуLD быть широко применима к большой список медицинских и экологически значимых микроорганизмов в настоящее время неразрешимыми генетического анализа.
Introduction
Облигатные внутриклеточные бактерии хламидиоза, по подсчетам, 2800000 половых путей в год в США (Центр по контролю за заболеваниями) с соответствующими последствиями, таких как воспалительные заболевания тазовых органов, внематочная беременность и бесплодие (1). Chlamydia SPP есть уникальная физиологию с двухфазной цикл развития, состоящий из двух формах: инфекционной болезнью, но нереплицирующейся элементарное тело (EB) и неинфекционной но репликативное сетчатые тела (РБ). Инфекция начинается с приложением ЭТ в эпителиальных клетках последующим endoctyotosis (2). В мембраной вакуоли называют включение ЭТ дифференцироваться в УБ формы, которая затем размножается делением. В середине цикла, RBS переходит обратно в EBS, которые выбрасываются в межклеточное пространство, чтобы инициировать новые раунды инфекции, когда клетки-хозяина лизирует (3).
Хламидийной являетсярефрактерных к обычной манипуляции со стандартными молекулярно-генетические инструменты, такие как замена целевого гена, транспозонов и трансдуцирующих фаги, которые занимали центральное место в большинстве исследований в генетике бактерий, неясно, в какой степени отдельные гены Chlamydia вклад в уклонении от врожденного иммунитета , питательные приобретение, развитие переходов или других процессов, важных для выживания патогена в эукариотических хоста (4). Следовательно, этот возбудитель остается слабо изучен, несмотря на клиническую значимость.
Генома Chlamydia SPP. относительно малы (~ 1 Mb) (5) с несколькими видами и биоваров секвенировали с использованием технологии следующего поколения секвенирования. Сравнительный анализ генома WGS предоставил уникальную информацию об эволюции хламидийной видов и их адаптации к человеку (6-8) и в некоторой степени оказывает определенную информацию в отношении потенциальной функции факторов вирулентности (9, 10). Tон генетическим разнообразием отображается клинических изолятов не обеспечивает требуемого разрешения систематически отобразить функцию большинство факторов вирулентности, предположительно из-за мутаций в таких генов было бы легко выбраны против. Не смешивая эффекты от естественного отбора, мутагенным индуцированные изменения гена, в сочетании с анализами, которые определены меры дефекты в вирулентности, может расширить спектр мутаций, которые могут обследоваться. Химические мутагены, в частности, являются полезными, поскольку они могут генерировать нулевой, условно, гипоморфных (снижение функции) и гиперморфный (усиление функции) аллелей. С приходом надежные следующего поколения секвенирования генома-технологии, такие мутации могут быть легко выявлены и нанесены на карту. Таким образом, сильные ассоциации может быть сделано между мутации в гене пути или генетических и общий фенотип, что позволяет применение вперед генетических методов.
Последовательности геномов клинических штаммов показало мозаицизмом Between сероваров и локусов часто рекомбинации (11). Эмпирические данные рекомбинации была продемонстрирована через ко-инфекцией двух различных устойчивых к антибиотикам штаммов и отбор устойчивых двойного рекомбинантного потомства, который был показан, чтобы генетические вклады от обоих штаммов (12, 13). Таким образом, генетический обмен между дикого типа и мутантных штаммов в ко-инфекции настройка позволяет сегрегации химически индуцированных мутаций, чтобы точно определить, что пострадавших гена приводит к наблюдаемым фенотип.
Здесь мы описываем методологию для выполнения генетического анализа в Chlamydia основе химического мутагенеза, WGS, и система обмена в ДНК зараженных клеток (14) (рис. 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Химического мутагенеза
Примечание: Мы обнаружили, что форма репликативное РБ является более пригодным для химического мутагенеза, чем EB форме. В середине цикла (от 18 до 20 HPI), RBS находятся в наибольшем количестве до RB-EB перехода. Поскольку хламидиоза является облигатным внутриклеточным патогеном, эффекты мутагена на здоровье хозяина может ограничить бактериальное восстановление. Vero клетки оказались более устойчивыми к неблагоприятным воздействиям высоких уровней, чем EMS других исследованных клеточных линий.
Сегрегация мутаций путем рекомбинации требует отбора устойчивых к антибиотикам рекомбинантного потомства. Мы рекомендуем использовать лекарственно-устойчивых штаммов (например, рифампицин, спектиномицин или триметоприм) для генерации мутантов способность выполнять анализ рекомбинантных и изолировать изогенного штаммов. Антибиотикам штаммов были получены путем ступенчатого процесса выбора (15, 16).
НеE: хламидиоза (штамм L2 / 434/Bu / АТСС VR902B) является BSL2 патогена. Обратитесь к институциональным стандартных операционных процедур (СОП) для обработки таких патогенов.
- Подготовка культуры клеток и инфекции:
- Семенной примерно 1 × 10 6 клеток Веро (АТСС CCL-81) на 25 см 2 (T25) колбу в 3 мл Дульбекко изменения Eagle (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Инкубируют при 37 ° С, 5% СО 2. Клетки должны сформировать монослоя в течение 24 часов.
- Аспирируйте среды. Infect сливной колбы Т25 в клетках Веро с Chlamydia при множественности инфекции (MOI) 5 (~ 14 × 10 6) в общем объеме 3 мл среды (DMEM, 200 нг / мл cyclohexamide, 10% FBS).
- Начать мутагенеза в 18 часа после инфекции (HPI):
- Подготовка 20 мг / мл EMS (этил метансульфонат) в фосфатном буферном солевом растворе (PBS) с 0,9 мМ кальцияхлорида и 0,49 мМ хлорида магния в капюшоне химическую безопасность как EMS является летучей жидкости.
Примечание: EMS является мощным мутагенным и канцерогенным. Нейтрализовать EMS отходы и обеззараживанию разливов, пластик, бумага и изделия из стекла с 1 М раствора гидроксида натрия. - Аспирируйте средних и мыть клетки один раз с 3 мл PBS / MgCl 2 / CaCl 2. Выдержите клетки с 3 мл 20 мг / мл в PBS EMS / MgCl 2 / CaCl 2 в течение одного часа в вытяжной шкаф при комнатной температуре. Vero клетки способны пережить эту концентрацию EMS и условия вне инкубатора в течение коротких периодов. Запомнить включать контрольный образец, который не был мутагенезу.
- Удалить среде, содержащей EMS и поместить его в емкость с 1 М NaOH для инактивации мутагенов. Вымойте инфицированные клетки 3 раза в 3 мл PBS + MgCl 2 / CaCl 2 для удаления остаточных мутагенов. Добавить 6 мл DMEM/10% FBS с 200 нг / мл cyclohexamide и 25 мкг / мл гентамицина, и инкубировали в 5% СО
- Извлечение ЭТ гипотоническим лизисом: Полностью аспирации среды. Добавить 1,0 мл H 2 O и рок выбить клетки в течение 10 мин. Клетки лизируют с помощью пипетки вверх и вниз, по крайней мере в 10 раз. Сбор лизата в микроцентрифуге и добавить 0,250 мл 5x сахарозы фосфата глутамата буфера (SPG), чтобы довести его до 1x конечной концентрации. Хранить при температуре -80 ° C.
Примечание: уровень мутагенеза может быть оценена путем индукции сопротивление рифампицин. Для анализа частоты сопротивление рифампицин, зубной налет 1 × 10 8 и 7 х 10-кратные серийные разведения бактерий в присутствии 200 нг / мл рифампицина. Частота сопротивление рифампицин определяется как количество рифампицин устойчивы бляшек деленное на общее количество бактерий покрытием. См. ниже в разделе доски инструкции. - Извлечение ЭТ гипотоническим лизисом: Полностью аспирации среды. Добавить 1,0 мл H 2 O и рок выбить клетки в течение 10 мин. Клетки лизируют с помощью пипетки вверх и вниз, по крайней мере в 10 раз. Сбор лизата в микроцентрифуге и добавить 0,250 мл 5x сахарозы фосфата глутамата буфера (SPG), чтобы довести его до 1x конечной концентрации. Хранить при температуре -80 ° C.
- Подготовка 20 мг / мл EMS (этил метансульфонат) в фосфатном буферном солевом растворе (PBS) с 0,9 мМ кальцияхлорида и 0,49 мМ хлорида магния в капюшоне химическую безопасность как EMS является летучей жидкости.
2. Клональный Выделение хламидиоза мутантных штаммов путем очистки бляшек
- Установить сливной монослоя Vero клеток в 6-луночные планшеты: Семя ~ 0,4 х 10 6 клеток в 3 мл DMEM/10% FBS на лунку. Разрешить клетки представляют собой однородную монослоя в течение следующих 24 часов.
- Разморозить исходный раствор мутагенеза Chlamydia на льду. Выполнить 6 х 10-кратные серийные разведения в общем объеме 200 мкл в разбавлении в DMEM/10% FBS и установить их на льду.
Примечание: бактериальный титр в единиц, образующих включения (IFU) является хорошей оценкой бляшкообразующих единиц (БОЕ). Стремитесь доска 10, 100, и 1000 PFU. - Мытье Vero клетки дважды 3 мл PBS на лунку.
- Добавьте 3 мл DMEM в каждую лунку на 6-луночные планшеты и 100 мкл бактериальной разведений в двух экземплярах. Swirl пластину для обеспечения равномерного смеси.
- Спин инфицированных пластин при 2700 х г в течение 30 мин при 15 ° С, затем инкубировали при 37 ° С в увлажненной5% CO 2 в течение 1-2 часов.
- Подготовить 0,54% агарозы в DMEM (для 6 скважин):
- Добавьте следующие компоненты: 18,9 мл холодного 2х DMEM, 4,2 мл ФБС, 0,42 мл 100x NEAA, 0,042 мл 200 мкг / мл cyclohexamide, 0,021 мл 50мг/мл гентамицин. Хорошо перемешать.
- Смешайте в 18,9 мл горячей стерильной 1,2% агарозном / H 2 O, помешивая, чтобы предотвратить сгустки. Смесь должна быть теплой на ощупь. Имейте в теплой водяной бане при 55 ° С перед добавлением в инфицированных клетках.
- Аспирируйте бактериальной суспензии от блюда и применяются 6 мл 0,54% агарозном / DMEM на лунку. Разрешить агарозном укрепить полностью при комнатной температуре за пределами капота в течение 15 мин. Сушат пластин с крышками удалены, в вытяжном шкафу биологической безопасности в течение 15 мин.
Примечание: Вибрация от биологического сдерживания капотом может исказить затвердевания агарозы. - Инкубировать при 37 ° C в CO 2 инкубаторе в течение 7-10 дней. Бляшки должны быть видимыми с помощью рассекает микроскопом. (ReТЭР на рисунке 3 представлена типичный образ бляшек.)
- За день до выделения мутантов, семена 1 × 10 4 Vero клеток в 100 мкл на лунку в 96-луночный планшет. Клетки будут сливающийся в течение 24 часов.
- Использование микроскопом рассечение, Марк бляшек, чтобы ее взяли. Сбор пробки бляшек использованием стерильного 1,0 мл барьер пипетки.
- Ресуспендируют бляшек в 100 мкл DMEM с добавлением 10% FBS, 400 нг / мл cyclohexamide, 50 мкг / мл гентамицина.
- Для расширения мутантных штаммов, наложение суспензии на монослоев из клетки Веро. Спин пластин при 2700 х г при 15 ° С в течение 30 мин.
- Инкубировать при 37 ° C / 5% CO 2 в увлажненном инкубаторе. Урожай ЭТ когда> 50% клеток инфицированы, который может произойти уже в 48 HPI и, как в конце 14 дней. Это количество инфицированных клеток позволяет достаточно жизнеспособных бактерий для сохранения. Мутантные штаммы отличаются по темпам роста и инфекционной. Разрешить медленный рост штаммов NaturaLLY вновь заразить соседние клетки, пока достаточное количество клеток не заражены.
- Извлечение ЭТ от гипотонического лизиса инфицированных клеток:
- Полностью аспирации среды.
- Добавить 160 мкл стерильной воды. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Разрушить клетки с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы гарантировать полный лизис, используйте барьер советов, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
- Передача 160 мкл лизатов в микроцентрифужную труб.
- Смешайте в 40 мкл 5x SPG. Хранить при температуре -80 ° C.
- Анализ и экран для фенотип мутантов (ы) интересов.
3. Всего Секвенирование генома Выбранный Мутанты Chlamydia
- Извлечение геномной ДНК из градиент-очищенный EBS, которая в значительной степени свободны загрязняющих ДНК хозяина. Протоколы для больших масштабах культуры Chlamydia и очистки ЭТ можно найти в работе. (17). Используйте коммерческой очистки геномной ДНК комплекты (например, Qiagen кошки. 69504), чтобы добRACT ДНК из 2 х 10 9 бактерий после инструкциями производителя.
- Используйте флуорометре (кубит, Invitrogen кошки. Q32866) для точного измерения количества ДНК. 1-5 мкг очищенной ДНК необходима для Illumina платформа секвенирования.
Примечание: Некоторые платформы могут быть использованы для последовательности бактериального генома, в том числе Illumina/Solexa- и твердых систем. Мы решили использовать HiSeq (Illumina), поскольку она производит высокую плотность коротким, но высоким качеством секвенирования читает. Более мелкий масштаб генома секвенсоров, таких как IonTorrent (Life Technologies) и MySeq (Illumina) подходят также и более чем достаточно для мультиплексирования этих quencing до 4 Chlamydia геномов за один раз, что превышает минимальный охват 25X для адекватной сборки генома. Подготовка секвенирования ДНК библиотеки для Illumina платформа описаны ниже. - Фрагмент ДНК соответствующего размера (300-400 пар оснований для секвенирования Illumina) с использованием адаптивной Ориентированные Акустика S220 вприборе (Covaris) в соответствии с предложенным заводских установок. Примечание: фрагментация ДНК через небулайзер приводит к большей потере образца за счет аэрозолизации образца.
- Подготовьте секвенирования геномных библиотек с использованием коммерческих строительных комплектов (Illumina FC-102-1001), в соответствии с инструкциями производителя. Библиотеки могут быть проиндексированы использованием штрих-праймеров (Illumina FC-121-1003) такой, что несколько образцов могут быть объединены и секвенировать одновременно.
- Выполнить секвенирование образцов. Этот шаг обычно выполняют коммерческие услуги или основные средства управляется выделенным технического персонала. Следуйте их процедур и рекомендаций.
- Illumina чтения (FASTQ формат) могут быть собраны с опорным генома использовании Удобный графический интерфейс программного обеспечения, например, Geneious (Biomatters), который также может быть использован для SNP / мутация идентификации. Чтобы карта мутации, установить параметры до 90% для минимальной частоты варианта и 50X для минимального покрытия. Открытое Sourcэлектронной геном монтажники, такие как MAQ (18) и BWA (19), также могут быть использованы.
- Подтверждение мутаций Sanger последовательности: использование геномной ДНК в качестве матрицы для ПЦР-амплификации из 300-500 пар оснований областей, фланкирующих определены мутации и последовательность очищенной или разбавляют (1:20) ПЦР-продуктов Sanger секвенирования.
4. Генерация Chlamydia Рекомбинанты
Примечание: Chlamydia могут обмениваться ДНК во время инфекции, которая дает возможность получения рекомбинантных штаммов (12, 13, 20). После совместной инфекции клеток с двух уникальных устойчивых к антибиотикам штаммов, рекомбинантный "потомство" может быть выбран для двойной устойчивости к антибиотикам (12, 13). Мы воспользовались этим явлением отделить мутаций и для создания совместного изогенного штаммов. Таким образом, мутантные штаммы были получены устойчивые к антибиотикам в фоне (например, рифампицин сопротивления (РИФ R) H471Y в CTL0567 (гроВ)) такой, что они могут быть пересечены диким штаммом BearinGA различных устойчивых к антибиотикам аллеля (например, устойчивости к спектиномицину (SPC R), G1197A в r01/r02 (16SRNA копирует 1 и 2)). Дополнительную информацию, касающуюся обмена ДНК и рекомбинации в Chlamydia, см. Список литературы (12, 13).
- Со-инфицировать дикого типа и мутантных штаммов клональной по centrifuging6 × 10 5 бактерий каждого штамма на сливной монослоев Vero клетки, выращенные в 24-луночный планшет. Параллельно заражают монослои с каждого штамма в покое.
- На 44 HPI, урожай ЭТ гипотоническим лизис инфицированных клеток:
- Полностью аспирации среды.
- Добавить 0,4 мл стерильной воды и дать постоять 10 мин.
- Клетки лизируют энергичным пипетки вверх и вниз, по крайней мере в 10 раз. Передача лизатов в пробирке.
- Смешать в 0,1 мл 5x SPG для конечной концентрации SPG 1x.
- Сырая лизаты можно использовать сразу или хранить при температуре -80 ° C.
- Зубной налет 50 мкл неочищенного EB подготавливаетD 5 х 1:10 серийные разведения в агарозном / DMEM дополнена соответствующими антибиотиками, чтобы выбрать для рекомбинантами. (См. таблицу для концентрации типичных антибиотиков для выбора рекомбинантами.)
- Налет очистить и обогатить рекомбинантных штаммов, как указано выше. Оценка рекомбинантов на наличие или отсутствие желаемый фенотип. Извлечение ДНК из рекомбинантных штаммов DNAzol обработки (следующий раздел) с целью генотипирования на наличие или отсутствие мутации.
- Кресты можно повторить с другими штаммами несущие маркеры устойчивости к антибиотикам дальнейшего разделения мутаций, а также генерировать изогенного штаммов. Co-заразить выбранной рекомбинантами в другую штамма дикого типа, имеющего отдельный антибиотик маркер.
Таблица 1: Антибиотик концентраций селекцию рекомбинантов:
| Конечная концентрация | Подготовка инструкций |
|---|---|
| 200 нг / мл рифампицина Сделайте 25 мг / мл хранения фото за диметилсульфоксида (ДМСО). Макияж 200 мкг / мл рабочего раствора путем разбавления хранения акции с H 2 O. Хранить при -20 ° C в темноте. | |
| 200 мкг / мл, триметоприм | Сделайте 100 мг / мл в ДМСО. Хранить при -20 ° C |
| 200 мкг / мл спектиномицина | Сделайте 100 мг / мл в воде акции в 100 мкл аликвоты. Хранить при -20 ° C. Избегать повторного замораживания-оттаивания. |
5. Добыча геномной ДНК из рекомбинантных штаммов для генотипирования
Примечание: Колонка на основе наборов очистки также может быть использован. Преимущество выделения ДНК по DNAzol лечение стоило.
- Infect 1,2 х 10 5 хламидий на монослои Vero клеток, выращенных на 12-луночных планшетах.
- В 36-48 HPI, аспирации среднего и добавить 0,375 мл DNAzol (Invitrogen 10503-027). Аккуратно перемешивать клетки и пипетки ЛысаяТЭС в 1,5 мл трубки микроцентрифужную.
- Осадок ДНК добавлением 0,188 мл 100% этанола. Смешать инверсии.
- Извлечение ДНК путем намотки с кончика пипетки и поместите его в чистую пробирку. Альтернативно, гранулы ДНК центрифугированием при максимальной скорости в течение 2 минут при комнатной температуре или температуре 4 ° С и супернатант декантируют.
- Мытье ДНК осаждают в два раза с 1,0 мл 75% этанола.
- Сушка на воздухе ДНК после удаления этанола в течение 15 сек.
- Растворения ДНК с 0,2 мл 8 мМ NaOH, затем нейтрализуют до рН 8,0 с 20,2 мкл 0,1 М HEPES. Подогреть до конечного объема 0,5 мл воды или ТЕ. Кроме того, ресуспендируйте ДНК в ТЕ буфере (осадок ДНК не будет солюбилизированы полностью.).
- Использование DNAzol экстрагированной ДНК в качестве матрицы для ПЦР-амплификации 300-500 п.н. фланкирующих областей определены мутаций. Последовательность очищенной или разбавленным (1:20) продуктов ПЦР Сангером секвенирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Воздействие мутаген приводит к включений, которые появляются лишенной бактерий, предположительно из-за бактериальной клеточной смерти. Как правило, серовар LGV-L2 полностью лизировать инфицированные клетки в течение 48 ч после заражения, но лечение с мутагенов может продлить этот цикл> 90 час. Примерно 10% включений, как ожидается, восстановление. В наших экспериментах инфицированных Vero клетках, обработанных 20 мг / мл EMS привело к 99% снижению восстановление инфекционное потомство по сравнению с необработанным контролем. Mutagen лечение также привело к появлению бляшек с измененной морфологией, в том числе небольших бляшек (товарной партии) (рис. 3). Другие включают морфологию бляшки, которые появляются зернистые, массивные, или в виде сотовой конструкции (рис. 3). Эти фенотипы могут отражать дефектов в процессы, необходимые для выживания инфекции и в принимающей среде. Мутанты с небольшая табличка (товарной партии) морфологии обычно производят значительно меньше инфекционного потомства и может занять до 2-3 недельmplify. Следует проявлять осторожность, когда пассажи этих штаммов, возвраты и супрессоров мутации могут накапливаться на высокой частоте.
Дозы EMS используемые в этих исследованиях может привести к от 3 до 30 мутаций на Chlamydia геном, как определено экспериментально путем WGS (рис. 4). Хотя градиент очищенный ЭТ в значительной степени свободны принимающих клеточного материала, ДНК хозяина также обнаружены и состоит примерно на 10-15% геномной подготавливает.
Co-инфекцией двух штаммов могут генерировать потомства с генетическими взносов обоих штаммов и имеет место на частотах от 10 -4 до 10 -3, примерно в 10 4 раза чаще, чем стихийное сопротивление (13). Точками рекомбинации перерыв обычно происходят между ~ 100 Кб до 800 Кб (12). Анализ таких рекомбинантных штаммов может выявить мутации, которые генетически связаны с фенотипом при исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Данная методика отвечает основным требованиям для генетического анализа, как он устанавливает связь между генотипами и фенотипами. Важно отметить, что это достигается без помощи обычных молекулярных инструментов для преобразования рекомбинантный ДНК и инсерционной инактивации генов в бактерии, которые часто является лимитирующей стадией в анализе функции гена в не-модель микробов.
Одним из наиболее важных шагом является обеспечение клональности налета очищенных мутантов. Перекрестное загрязнение дикого типа или "Монтажник" мутантов может быстро привести к мутантных штаммов время вытеснили. Кроме того, отображение мутаций целом секвенирование генома не-клонального образцов может привести к неоднозначным результатам. Изоляция мутантов из сильно plaqued скважин или подключение бляшек, которые находятся слишком близко друг к другу, следует избегать. Кроме того, для медленно растущих мутантов, ревертантов может возникнуть при относительно высоких частот. Мы рекомендуем сохранением исходного или низкие запасы проход. ОтвAque мутантов, если перекрестное загрязнение или ревертантов подозреваемых.
Концентрация EMS может быть снижена для уменьшения частоты мутаций. Частота мутаций, по оценке поколение рифампицин устойчивых вариантов (за счет точечных мутаций в гене полимеразы РНК кодирования, гроВ) был оптимальным в наших руках при 20 мг / мл EMS. Индукция сопротивление рифампицин может быть оценена частота бляшки формируются в присутствии рифампицина и должен коррелировать с частотой химически индуцированных мутаций.
СЭМ могут быть заменены другими мутагенами расширить спектр мутаций, которые могут быть получены. Например, ДНК интеркалирующие агенты, такие как псорален и его производные могут быть использованы для индуцирования делеции и вставки (21).
Мутации, которые отображают рядом друг с другом в геноме (<100 кб друг от друга), которые трудно удалить связь посредством рекомбинации. При высоких темпов мутагенеза достижимойиздание, это может быть трудно однозначно идентифицировать причинные мутации. Однако, так как преобразование C. инфекцией теперь можно с челнока плазмид (22), хотя и не эффективно, то можно решить эти проблемы связи, дополняя мутации в транс с копию дикого типа мутантного гена на плазмиде.
Рисунок 1. Стратегия вперед генетического анализа и рекомбинации на основе отображения в Chlamydia. Rifampin устойчивостью (Риф R) С. трахоматис был мутации во время его репликативной стадии и используют для заражения Vero монослоя клетки до образования видимого бляшек не сформирован. Индивидуальные клоны мутантов, собирали и анализировали на специфический фенотипы, например, изменение морфотипов бляшки. Геномы мутантов, имеющих общие фенотипа были упорядочены для яdentify общих генетических поражений. Чтобы установить связь между этими повреждениями генов и конкретных морфологии зубного налета, Vero клетки были заражены с мутантами генерируется в Ариф R фона и дикого типа СТС R штаммы хламидий и рекомбинантные Риф R Spc R штаммов, среди полученных инфекционного потомства были выбраны в присутствии рифампицина и спектиномицину ("креста"). Сегрегации отдельных мутаций, присутствующих в родительских Риф R мутантного штамма среди рекомбинантных бактерий измененной морфологией отображения налета определялся целевой последовательности ДНК. (Воспроизводится с разрешения PNAS (14)) Нажмите сюда, чтобы просмотреть увеличенное изображение .
Рисунке 2. Схематическое представление EMS мутагенеза протокола. Хламидиоза LGV-L2-инфицированные клетки подвергали воздействию EMS на этапе RB инфекционного цикла, а заражение проводили в течение 72 ч, чтобы обеспечить генерация инфекционного элементарные тельца (EB) . Мутагенизированные бассейнов EB собирали и титровали для включения единиц (IFU) и бляшкообразующих единиц на Vero клетках. N, ядра. (Воспроизводится с разрешения PNAS (14)) Нажмите сюда, чтобы просмотреть увеличенное изображение .
Рисунок 3. Примеры часто морфологии бляшки среди EMS-мутагенизированный C. инфекцией. Мутагенизированные C. трахоматис LGV-L2 позволило сформировать бляшек на Vero клеточный монослойс в течение 14 дня. Бляшки разнообразны по размерам (A) и морфологии (B), который может быть выделен, усиливается в клетках Веро, и используется в реинфекций Веро монослоев, чтобы подтвердить стабильность бляшки морфотипов. Примеры общих фенотипов указаны с сотовым (Hcm), групповым (CLMP), небольшая табличка (Spq) и гранулированный (ГРН). Стрелки указывают больших гранулярных депозитов в доску грн. (Воспроизводится с разрешения PNAS (14)) Нажмите сюда, чтобы просмотреть увеличенное изображение .
Рисунок 4. Идентификация EMS-индуцированные повреждения гена. Хромосомной локализации нуклеотидных вариантов у мутантов, которые отображают Grn морфотипом бляшки. Всего секвенирования генома из трех мутантов Grn определили мутацииы, которые приводят к изменениям аминокислот в glgB, кодирующих гликогена разветвления фермента. (Воспроизводится с разрешения PNAS (14)) Нажмите сюда, чтобы просмотреть увеличенное изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Там нет ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Ethyl methanesulfonate (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid) | |||
| SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid) | |||
| Water (sterile, tissue culture grade) | |||
| 2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate | Sigma | D7777 | |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1.2% GTG Agarose , autoclaved | Lonzo | 50070 | |
| Genomic DNA purification kits | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| Ethanol (molecular biology grade) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer | |||
| 25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks) | |||
| 6-well tissue culture plates | |||
| 12-well tissue culture plates | |||
| 96-well tissue culture plates | |||
| Chemical safety hood | |||
| Biological safety hood | |||
| >Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates | |||
| >Dissection microscope | |||
| Fluorometer (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |
References
- Haggerty, C. L., et al. Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women. J Infect Dis. 201, Suppl 2. S134-S155 (2010).
- Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of Chlamydia trachomatis entry into nonphagocytic cells. Infect Immun. 75 (8), 3925-3934 (2007).
- Heuer, D., Kneip, C., Maurer, A. P., Meyer, T. F. Tackling the intractable - approaching the genetics of Chlamydiales. Int J Med Microbiol. 297 (7-8), 569-576 (2007).
- Stephens, R. S., et al. Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans, Chlamydia trachomatis. Science. 282 (5389), 754-759 (1998).
- Thomson, N. R., et al. Chlamydia trachomatis, genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates. Genome Res. 18 (1), 161-171 (2008).
- Harris, S. R., et al. Whole-genome analysis of diverse Chlamydia trachomatis strains identifies phylogenetic relationships masked by current clinical typing. Nat Genet. 44 (4), 413-419 (2012).
- Somboonna, N., et al. Hypervirulent Chlamydia trachomatis clinical strain is a recombinant between lymphogranuloma venereum (L(2)) and D lineages. MBio. 2 (3), e00045-00011 (2011).
- Voigt, A., Schofl, G., Saluz, H. P. The Chlamydia psittaci genome, a comparative analysis of intracellular pathogens. PLoS One. 7 (4), e35097 (2012).
- Jeffrey, B. M., et al. Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination. Infect Immun. 78 (6), 2544-2553 (2010).
- Gomes, J. P., et al. Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots. Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).
- DeMars, R., Weinfurter, J. Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance. J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).
- Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).
- Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
- Tipples, G., McClarty, G. Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure. J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).
- Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis. Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).
- Scidmore, M. A. Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11 (2005).
- Li, H., Ruan, J., Durbin, R. Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores. Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. D. Horizontal transfer of tetracycline resistance among Chlamydia spp. in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 53 (11), 4604-4611 (2009).
- Sladek, F. M., Melian, A., Howard-Flanders, P. Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathog. 7 (9), e1002258 (2011).
