Summary
Se describe una metodología para llevar a cabo el análisis genético de Chlamydia basada en la mutagénesis química y la secuenciación del genoma completo. Además, un sistema para el intercambio de ADN dentro de las células infectadas se describe que se puede utilizar para la cartografía genética. Este método puede ser ampliamente aplicable a los sistemas microbianos que carecen de sistemas de transformación y herramientas de genética molecular.
Abstract
Chlamydia trachomatis, el agente etiológico de las enfermedades de transmisión sexual y las infecciones oculares, sigue siendo mal caracterizado por su inflexibilidad a la transformación experimental con ADN recombinante. Hemos desarrollado un enfoque para llevar a cabo el análisis genético en C. trachomatis a pesar de la falta de herramientas de genética molecular. Nuestro método consiste en: i) la mutagénesis química para generar rápidamente amplias bibliotecas de mutantes genéticamente definidos con fenotipos distintos; ii) secuenciación del genoma completo (WGS) para asignar las lesiones genéticas subyacentes y encontrar asociaciones entre genes mutados (s) y.. un fenotipo común. iii) la generación de cepas recombinantes a través de la co-infección de células de mamíferos con bacterias mutantes y de tipo salvaje. En consecuencia, hemos sido capaces de establecer relaciones causales entre los genotipos y fenotipos. El acoplamiento de la variación genética inducida químicamente y WGS establecer asociaciones genotipo-fenotipo correlativos Should ser ampliamente aplicable a la larga lista de razones médicas y ambientalmente microorganismos importantes actualmente intratables para el análisis genético.
Introduction
La bacteria Chlamydia trachomatis cuentas intracelulares obligados para un estimado de 2,8 millones de infecciones del tracto genital por año en los Estados Unidos (Center for Disease Control) asociado con secuelas tales como la enfermedad pélvica inflamatoria, embarazo ectópico e infertilidad (1). Chlamydia spp tienen un único fisiología con un ciclo de desarrollo bifásico que consiste en dos formas: el cuerpo elemental infecciosa pero no replicante (EB) y el cuerpo reticulado no infecciosa pero replicativa (RB). La infección comienza con la unión de EBs a células epiteliales seguido de endoctyotosis (2). Dentro de una vacuola de membrana denomina una inclusión, EBS se diferencian en la forma RB, que se replica por fisión binaria. En la mitad del ciclo, las transiciones RBs de nuevo en EBS, que luego son expulsados en el espacio extracelular para iniciar nuevas rondas de infección cuando la lisis de células huésped (3).
C. trachomatis esrefractario a la manipulación de rutina con herramientas genéticas moleculares estándar, tales como el reemplazo de gen objetivo, transposones, y los fagos de transducción, que han sido central para la mayoría de los estudios en genética bacteriana, No está claro el grado en que los genes de Chlamydia individuales contribuyen a la evasión de la inmunidad innata , la adquisición de nutrientes, transiciones del desarrollo, u otros procesos importantes para la supervivencia del patógeno en un huésped eucariota (4). En consecuencia, este patógeno permanece mal caracterizado a pesar de su importancia clínica.
Los genomas de Chlamydia spp. es relativamente pequeño (~ 1 Mb) (5) con múltiples especies y biotipos secuenciados utilizando tecnologías de secuenciación de próxima generación. El análisis comparativo del genoma de WGS ha proporcionado una visión única sobre la evolución de las especies de clamidias y su adaptación a los humanos (6-8) y, en cierta medida, ha proporcionado alguna información en cuanto a la función potencial de los factores de virulencia (9, 10). Tque la diversidad genética representada por los aislados clínicos no proporciona la resolución necesaria para trazar sistemáticamente la función de la mayoría de los factores de virulencia, presumiblemente debido a las mutaciones en dichos genes se han seleccionado fácilmente contra. Sin efectos de confusión de la selección natural, la variación del gen mutágeno inducida, junto con los ensayos definidos que los defectos de medida en la virulencia, pueden ampliar el espectro de mutaciones que pueden ser objeto de reconocimiento. Mutágenos químicos, en particular, son útiles ya que pueden generar nula hypomorphic (reducción de la función), condicional, y hypermorphic (ganancia de función) alelos. Con la llegada de las tecnologías de secuenciación del genoma robustos de última generación, tales mutaciones pueden ser fácilmente identificados y mapeados. De esta manera, las asociaciones fuertes se pueden realizar entre las mutaciones en un gen o vía genética y un fenotipo común, lo que permite la aplicación de enfoques genéticos hacia adelante.
Las secuencias del genoma de cepas clínicas revelaron mosaicismo bserovares ntre y loci de recombinación frecuente (11). La evidencia empírica de recombinación se demostró a través de la co-infección de dos cepas resistentes a los antibióticos diferentes y la selección de la progenie de doble recombinante resistente, que fue revelado a tener contribuciones genéticas de ambas cepas (12, 13). Por lo tanto, el intercambio genético entre el tipo salvaje y las cepas mutantes en un entorno co-infección permite la segregación de las mutaciones inducidas químicamente para identificar el gen afectado que conduce al fenotipo observado.
Aquí se describe una metodología para llevar a cabo el análisis genético de Chlamydia basada en la mutagénesis química, WGS, y un sistema para el intercambio de ADN dentro de las células infectadas (14) (Figura 1).
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Protocol
1. Mutagénesis química
Nota: Se encontró que la forma replicativa RB es más susceptible a la mutagénesis química que forma EB. A mitad del ciclo (entre 18 a 20 años hpi), RBS se encuentran en los grandes números anteriores a la transición RB-EB. Debido a Chlamydia trachomatis es un patógeno intracelular obligado, los efectos de la mutágeno sobre la salud del huésped pueden limitar la recuperación bacteriana. Se encontraron células Vero a ser más resistentes a los efectos adversos de altos niveles de ccsme que otras líneas celulares ensayadas.
La segregación de las mutaciones de recombinación requiere la selección de la progenie recombinante resistente a los antibióticos. Se recomienda el uso de cepas resistentes a los medicamentos (por ejemplo, rifampicina, espectinomicina, o trimetoprim) para la generación de mutantes de la capacidad de realizar análisis recombinante y para aislar cepas isogénicas. Cepas resistentes a los antibióticos fueron generados por un proceso de selección paso a paso (15, 16).
Noe: Chlamydia trachomatis (cepa L2 / 434/Bu / ATCC VR902B) es BSL2 patógeno. Consulte los procedimientos operativos estándar (SOP institucionales) para el manejo de estos patógenos.
- Preparación de células cultivadas y la infección:
- Seed aproximadamente 1 10 6 células Vero (ATCC CCL x-81) por 25 cm 2 (T25) en matraz de 3 ml de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS). Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2. Las células deben formar una monocapa confluente dentro de 24 h.
- Aspirar medio. Infect matraces T25 confluentes de células Vero con clamidia a una multiplicidad de infección (moi) de 5 (~ 14 x 10 6) en un volumen total de 3 ml de medio (DMEM, 200 ng / ml de cicloheximida, 10% de FBS).
- Comience mutagénesis en 18 horas después de la infección (hpi):
- Preparar 20 mg / ml ccsme (metanosulfonato de etilo) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 0,9 mM de calcioy cloruro de magnesio 0,49 mM en una campana de seguridad química como EMS es un líquido volátil.
Nota: EMS es un mutágeno y carcinógeno potente. Neutralizar el ccsme residuos y descontaminación de derrames, plástico, papel y vidrio con hidróxido de sodio 1 M. - Aspirar el medio y lavar las células una vez con 3 ml de PBS / MgCl 2 / CaCl2. Se incuban las células con 3 ml de 20 mg / ml de EMS en el PBS / MgCl 2 / CaCl2 durante una hora en la campana de humos a temperatura ambiente. Células Vero son capaces de sobrevivir a esta concentración de EMS y las condiciones fuera de la incubadora por períodos cortos. Recuerde incluir una muestra de control que no ha sido mutagenizado.
- Retire medio que contiene EMS y colocarlo en un recipiente con NaOH 1 M para inactivar el mutágeno. Lavar las células infectadas por 3 veces en 3 ml de PBS + MgCl 2 / CaCl2 para eliminar mutágeno residual. Añadir 6 ml de DMEM/10% de FBS con 200 ng / ml de cicloheximida y 25 g / ml de gentamicina, y se incuba a 5% de CO
- Extraer EBs por lisis hipotónica: Completamente aspirar medio. Añadir 1,0 ml de H 2 O y el rock para desalojar las células durante 10 min. Lisar las células por pipeteo hacia arriba y hacia abajo por al menos 10 veces. Recoger lisado en una microcentrífuga y añadir 0,250 ml de 5x tampón de sacarosa fosfato glutamato (SPG) para llevarlo a una concentración final 1x. Almacenar a -80 ° C.
Nota: El nivel de mutagénesis se puede evaluar mediante la inducción de la resistencia a rifampicina. Para ensayar la frecuencia de la resistencia a rifampicina, la placa 1 x 10 x 8 y 7 diluciones en serie de 10 veces de bacterias en la presencia de 200 ng / ml de rifampicina. La frecuencia de la resistencia a rifampicina se define como el número de placas resistentes a rifampicina dividido por el número total de bacterias chapados. Consulte la sección siguiente para obtener instrucciones de placa. - Extraer EBs por lisis hipotónica: Completamente aspirar medio. Añadir 1,0 ml de H 2 O y el rock para desalojar las células durante 10 min. Lisar las células por pipeteo hacia arriba y hacia abajo por al menos 10 veces. Recoger lisado en una microcentrífuga y añadir 0,250 ml de 5x tampón de sacarosa fosfato glutamato (SPG) para llevarlo a una concentración final 1x. Almacenar a -80 ° C.
- Preparar 20 mg / ml ccsme (metanosulfonato de etilo) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 0,9 mM de calcioy cloruro de magnesio 0,49 mM en una campana de seguridad química como EMS es un líquido volátil.
2. Aislamiento clonal de Chlamydia trachomatis cepas mutantes de purificación en placa
- Establecer monocapas confluentes de células Vero en placas de 6 pocillos: Seed ~ 0,4 x 10 6 células en 3 ml DMEM/10% de SFB por pocillo. Permiten a las células para formar una monocapa homogénea en los próximos 24 h.
- Descongele la solución madre de Chlamydia mutado en hielo. Realizar 6 x diluciones seriadas de 10 veces en un volumen total de 200 l por dilución en DMEM/10% de SFB y los establecido en el hielo.
Nota: título bacteriana en unidades formadoras de inclusión (IFU) es una buena estimación de las unidades formadoras de placa (ufp). Apunta a la placa 10, 100 y 1000 ufp. - Lavar las células Vero dos veces con 3 ml de PBS por pocillo.
- Añadir 3 ml de DMEM a cada pocillo para placas de 6 pocillos y 100 l de las diluciones bacterianas en duplicado. Agite la placa para asegurar una mezcla.
- Gira placas infectadas a 2700 xg durante 30 min a 15 ° C y después se incuba a 37 ° C en un humidificado,5% de CO2 durante 1-2 horas.
- Prepare 0,54% de agarosa en DMEM (para 6 pozos):
- Añadir los siguientes ingredientes: 18,9 ml de DMEM frío 2x, 4,2 ml de FBS, 0,42 ml 100x NEAA, 0,042 ml de 200 mg / ml de cicloheximida, 0,021 ml de gentamicina 50mg/ml. Mezclar bien.
- Mezclar con 18,9 ml de agarosa al 1,2% / H 2 O estéril caliente, revolviendo para evitar grumos. La mezcla debe estar caliente al tacto. Mantener en un baño de agua caliente a 55 ° C antes de añadir a las células infectadas.
- Aspirar suspensión bacteriana de los platos y aplicar 6 ml de agarosa al 0,54% / DMEM por pocillo. Permitir agarosa se solidifique por completo a temperatura ambiente fuera de la campana durante 15 min. Secar las placas con las tapas quitadas, en la campana de bioseguridad durante 15 min.
Nota: las vibraciones de la campana de contención biológica puede distorsionar la agarosa solidificación. - Se incuba a 37 ° C en el incubador de CO2 durante 7-10 días. Las placas deben ser visibles con la ayuda de un microscopio de disección. (Refer a la figura 3 para una imagen típica de las placas.)
- Un día antes del aislamiento de mutantes, semilla de 1 x 10 4 células Vero en 100 l por pocillo en una placa de 96 pocillos. Las células serán confluentes en un plazo de 24 h.
- Utilizando un microscopio de disección, placas marca para ser recogidos. Recoge los tapones de las placas utilizando un estéril 1,0 ml barrera de punta de pipeta.
- Volver a suspender las placas en 100 l de DMEM suplementado con 10% de FBS, 400 ng / ml de cicloheximida, 50 mg / ml de gentamicina.
- Para ampliar las cepas mutantes, superponer la suspensión sobre monocapas confluentes de células Vero. Girar las placas a 2700 x g, 15 º C durante 30 min.
- Se incuba a 37 ° C / 5% de CO 2 humidificado en una incubadora. Harvest EBS cuando> 50% de las células están infectadas, lo que puede ocurrir tan pronto como 48 hpi y tan tarde como 14 días. Esta cantidad de células infectadas permite que las bacterias viables suficiente para ser almacenados. Las cepas mutantes difieren en las tasas de crecimiento y la infectividad. Permitir estirpes de crecimiento lento que naturally volver a infectar a las células vecinas hasta que suficientes células están infectadas.
- Extraer EBs por lisis hipotónica de las células infectadas:
- Completamente aspirar el medio.
- Añadir 160 l de agua estéril. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
- Disrupt células pipeteando arriba y abajo varias veces para asegurar la lisis completa, utilice los consejos de barrera para evitar la contaminación cruzada.
- Transferir 160 l de lisados a tubos de microcentrífuga.
- Mezclar en 40 l de 5x SPG. Almacenar a -80 ° C.
- Ensayo y pantalla de mutantes de fenotipo (s) de interés.
3. Secuenciación del genoma completo de mutantes Chlamydia seleccionadas
- Extraer el ADN genómico de gradiente purificado EBS, que son en gran parte libre de contaminación de ADN del huésped. Protocolos para el cultivo a gran escala de clamidia y purificación de EBs se pueden encontrar en la ref. (17). Utilice kits de purificación de ADN genómico comerciales (por ejemplo Qiagen cat. 69504) para extRACT ADN de 2 x 10 9 bacterias siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Utilice un fluorómetro (Qubit, Invitrogen cat. Q32866) para medir con precisión la cantidad de ADN. Se requiere 1-5 g de ADN purificado para la plataforma de secuenciación de Illumina.
Nota: Varias plataformas se pueden utilizar para la secuencia de los genomas de bacterias, incluyendo sistemas de Illumina/Solexa- y sólida basada. Hemos elegido utilizar HiSeq (Illumina), ya que produce una alta densidad de corto, pero la secuencia de alta calidad lee. Secuenciadores del genoma escala más pequeña, como IonTorrent (Life Technologies) y myseq (Illumina) son adecuados también y más que suficiente para multiplexar estos Quencing de hasta 4 genomas clamidia a la vez, lo que supera la cobertura mínima de 25X para el genoma de montaje adecuado. Preparación de bibliotecas de secuenciación de ADN para la plataforma Illumina se describen a continuación. - ADN Fragmento de tamaño adecuado (300-400 pares de bases para la secuenciación de Illumina) utilizando una adaptación acústica S220 enfocados entrumento (Covaris) de acuerdo con los ajustes sugeridos por el fabricante. Nota: la fragmentación del ADN por los resultados de nebulización en una mayor pérdida de la muestra debido al uso de aerosol de la muestra.
- Preparar las bibliotecas de secuenciación genómica utilizando kits de construcción comercial (Illumina FC-102-1001), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las bibliotecas pueden ser indexados usando cebadores de código de barras (Illumina FC-121-1003) de tal manera que múltiples muestras se unen y se secuenciaron de forma simultánea.
- Ejecutar secuenciación de muestras. Este paso se realiza generalmente por los servicios comerciales o instalaciones centrales operadas por personal técnico especializado. Siga los procedimientos y recomendaciones.
- Illumina lecturas (formato FASTQ) se puede montar a un genoma de referencia utilizando usar software de interfaz de usuario gráfica de usuario, tales como Geneious (Biomatters), que puede ser también utilizado para SNP / identificación de mutaciones. Para mutaciones del mapa, establecer los parámetros de un 90% para la frecuencia de la variante mínima y 50X para la cobertura mínima. Abrir vitame ensambladores del genoma, tales como MAQ (18) y BWA (19), también se pueden utilizar.
- Confirmar mutaciones por secuenciación de Sanger: usar el ADN genómico como molde para la amplificación por PCR de 300-500 bp regiones que flanquean las mutaciones identificadas y purificadas o secuencia (01:20) productos de PCR diluido por secuenciación de Sanger.
4. Generación de recombinantes de Chlamydia
Nota: La clamidia puede intercambiar ADN durante la infección, lo que permite la generación de cepas recombinantes (12, 13, 20). Después de la co-infección de células con dos cepas resistentes a los antibióticos únicas, recombinante "progenie" se puede seleccionar para la doble resistencia a los antibióticos (12, 13). Nos aprovechamos de este fenómeno para segregar mutaciones y generar cepas co-isogénicas. Por lo tanto, se generaron cepas mutantes en el fondo resistente a los antibióticos (por ejemplo, resistencia a rifampicina (RIF R) H471Y en CTL0567 (rpoB)) de tal manera que se pueden cruzar con el tipo salvaje cepa bearinalelo resistente al antibiótico diferente ga (por ejemplo, resistencia a la espectinomicina (spc R), G1197A en R01/R02 (16SRNA copia 1 y 2)). Para detalles con respecto a intercambio de ADN y la recombinación en la clamidia, referirse a las referencias (12, 13).
- Co-infectar tipo salvaje y cepas mutantes clonales por centrifuging6 x 10 5 bacterias de cada cepa en monocapas confluentes de células Vero cultivadas en una placa de 24 pocillos. En paralelo, infectar monocapas con cada cepa solo.
- A los 44 hpi, cosecha EBS mediante lisis hipotónica de las células infectadas:
- Completamente aspirar el medio.
- Añadir 0,4 ml de agua estéril y dejar reposar durante 10 min.
- Lyse células por pipeteo vigoroso arriba y abajo durante al menos 10 veces. Transferencia lisados a un tubo de microcentrífuga.
- Mezclar en 0,1 ml de SPG 5x para una concentración final de 1x SPG.
- Lisados crudos se pueden utilizar inmediatamente o se almacenaron a -80 ° C.
- La placa 50 l de la EB crudo preps und 5 x 1:10 diluciones seriadas de agarosa / DMEM suplementado con los antibióticos adecuados para seleccionar a los recombinantes. (Véase la tabla de concentraciones de antibióticos típicos para la selección de recombinantes.)
- La placa purificar y enriquecer las cepas recombinantes como anteriormente. Puntuación recombinantes para la presencia o ausencia del fenotipo deseado. Extraer el ADN de las cepas recombinantes mediante tratamiento DNAzol (siguiente sección) con el propósito de determinación del genotipo para determinar la presencia o ausencia de mutaciones.
- Cruces pueden repetirse con otras cepas que llevan marcadores de resistencia a antibióticos para segregar más mutaciones, y generar cepas isogénicas. Co-infectar recombinantes seleccionados a otra cepa de tipo salvaje que lleva un marcador antibiótico diferente.
Tabla 1: Las concentraciones de antibióticos para la selección de recombinantes:
| Concentración final | Instrucciones de preparación |
|---|---|
| 200 ng / ml de rifampicina Hacer 25 mg / ml de caldo de almacenamiento en dimetilsulfóxido (DMSO). Maquillaje 200 mg / ml solución de trabajo diluyendo la solución madre de almacenamiento con H 2 O. Almacenar a -20 ° C en la oscuridad. | |
| 200 mg / ml de trimetoprima | Hacer un mg / ml de caldo de 100 en DMSO. Almacenar a -20 ° C |
| 200 g / ml de espectinomicina | Hacer un mg / ml de caldo de 100 en agua en 100 ml de alícuotas. Almacenar a -20 ° C. Evite repetida congelación y descongelación. |
5. Extracción de ADN genómico a partir de cepas recombinantes para la genotipificación
Nota: kits de purificación de columna de base también se pueden utilizar. Una ventaja de la extracción de ADN por el tratamiento DNAzol es el costo.
- Infect 1.2 x 10 5 clamidias en monocapas de células Vero cultivadas en placas de 12 pocillos.
- En 36 a 48 hpi, aspirar a medio y añadir 0,375 ml de DNAzol (Invitrogen 10503-027). Agite suavemente las células y la pipeta lysates en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- ADN precipitado mediante la adición de 0.188 ml de etanol al 100%. Mezclar por inversión.
- Extraer el ADN de cola de impresión, con una punta de pipeta y colocarla en un tubo limpio. Alternativamente, el pellet de ADN por centrifugación a velocidad máxima durante 2 minutos a temperatura ambiente o 4 º C, y el sobrenadante se decanta.
- Lavar precipitar el ADN dos veces con 1,0 ml de etanol al 75%.
- DNA aire seco después de retirar el etanol durante 15 s.
- Solubilizar ADN con 0,2 ml de NaOH 8 mM a continuación, neutralizar a pH 8,0 con 20,2 l de 0,1 M de HEPES. Llevar hasta un volumen final de 0,5 ml con agua o TE. Alternativamente, resuspender el DNA en tampón TE (sedimento de ADN no solubilizado completamente.).
- Utilice DNAzol ADN extraído como molde para la amplificación por PCR de 300 a 500 bp regiones que flanquean las mutaciones identificadas. Secuencia purificado o diluido (1:20) productos de PCR mediante secuenciación de Sanger.
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Representative Results
La exposición a mutágeno conduce a inclusiones que aparecen desprovisto de bacterias, presumiblemente debido a la muerte de la célula bacteriana. Normalmente, serovar LGV-L2 lisará completamente las células infectadas en las 48 horas de la infección, pero el tratamiento con mutágenos puede extender este ciclo para> 90 h. Se espera que aproximadamente el 10% de las inclusiones de recuperar. En nuestros experimentos, las células Vero infectadas tratadas con 20 mg / ml de SGM dirigida a una disminución de 99% en la recuperación de la progenie infecciosa en comparación con los controles no tratados. Tratamiento mutagénico también dio lugar a la aparición de placas con morfología alterada, incluidas las pequeñas placas (SPQ) (Figura 3). Otras morfologías incluyen placas que aparecen granular, grumoso, o en forma de nido de abeja (Figura 3). Estos fenotipos pueden reflejar defectos en los procesos requeridos para la infección y la supervivencia en el entorno de acogida. Los mutantes con pequeña placa (SPQ) morfología generalmente producen significativamente menos progenie infecciosa y puede tomar hasta 2-3 semanas a unmplify. Se debe tener cuidado cuando pases estas cepas como reversiones y mutaciones supresoras pueden acumular en una frecuencia alta.
Las dosis de ccsme utilizados en estos estudios pueden conducir a entre 3 a 30 mutaciones por genoma de Chlamydia, evaluadas experimentalmente por WGS (Figura 4). Aunque purificado en gradiente EBS son en gran parte libre de material celular de acogida, también se detectó ADN del huésped y consiste en alrededor del 10-15% de preparaciones genómicas.
Co-infección de dos cepas pueden generar descendencia con las contribuciones genéticas de ambas cepas y se produce a frecuencias de 10 -4 a 10 -3, aproximadamente 10 4 veces más frecuentemente que la resistencia espontánea (13). Normalmente recombinación puntos de ruptura se producen entre ~ 100 kb a 800 kb (12). Un análisis de este tipo de cepas recombinantes puede revelar mutaciones que están genéticamente vinculados con el fenotipo en estudio.
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Discussion
Esta metodología cumple con los requisitos básicos para el análisis genético ya que establece la vinculación entre los genotipos y fenotipos. Es importante destacar que esto se logra sin la ayuda de herramientas moleculares convencionales para la transformación del ADN recombinante y la inactivación insercional de genes en bacterias, lo cual es a menudo un paso limitante de la velocidad en el análisis de la función de genes en los microbios no modelo.
Un paso fundamental es asegurar la clonalidad de los mutantes purificados en placa. La contaminación cruzada con el tipo salvaje o mutantes "ajustador" puede conducir rápidamente a las cepas mutantes se outcompeted. Del mismo modo, las mutaciones de mapeo de secuenciación del genoma completo de muestras no clonales pueden dar lugar a resultados ambiguos. Aislamiento de mutantes de pozos muy plaqued o conectar las placas que están muy cerca entre sí se debe evitar. Además, para los mutantes de crecimiento lento, revertientes pueden surgir a frecuencias relativamente altas. Se recomienda conservar las poblaciones pasaje original o bajo. Sust.mutantes aque si la contaminación cruzada o reversiones son sospechosos.
La concentración de EMS puede ser rebajado para disminuir la frecuencia de las mutaciones. La tasa de mutación, según la evaluación de la generación de variantes resistentes a rifampicina (debido a mutaciones puntuales en el gen que codifica la ARN polimerasa, rpoB) era óptima en nuestras manos a 20 mg / ml el EMS. La inducción de la resistencia a rifampicina puede ser evaluada por la frecuencia de placas formadas en presencia de rifampicina y debe correlacionarse con la frecuencia de las mutaciones inducidas químicamente.
EMS puede ser sustituido por otros mutágenos para ampliar el espectro de mutaciones que se pueden obtener. Por ejemplo, agentes de intercalación de ADN como psoraleno y sus derivados se pueden utilizar para inducir deleciones e inserciones (21).
Las mutaciones que mapean cerca uno del otro en el genoma (<100 kb aparte) son difíciles de desvincular través de la recombinación. Cuando las altas tasas de mutagénesis son achieved, puede ser difícil de identificar de forma inequívoca una mutación causal. Sin embargo, ya que la transformación de C. trachomatis es ahora posible con plásmidos lanzadera (22), aunque de manera ineficiente, puede ser posible hacer frente a estos problemas de vinculación al complementar las mutaciones en trans con una copia de tipo salvaje del gen mutado en un plásmido.
Figura 1. Estrategia para el análisis prospectivo genética y mapeo recombinación basada en Chlamydia. Rifampicina resistente (Rif R) C. trachomatis fue mutagenizado durante su fase replicativa y se utiliza para infectar monocapas de células Vero hasta que se formaron placas visibles. Se recogieron clones individuales de mutantes y se ensayaron para fenotipos específicos, tales como morfotipos placa alterados. Los genomas de los mutantes que comparten un fenotipo común se secuenciaron para identificar lesiones genéticas comunes. Para establecer la relación entre estas lesiones genéticas y morfologías placa específicas, las células Vero fueron co-infectados con mutantes generados en Arif R fondo y las cepas de tipo salvaje Spc R clamidia y cepas recombinantes RifR Spc R entre la progenie infecciosa resultante fueron seleccionados en el presencia de rifampicina y espectinomicina ("cruces"). La segregación de las mutaciones individuales presentes en la cepa mutante parental Rif R entre las bacterias recombinantes se presentan morfología de la placa alterada se determinó por secuenciación del ADN objetivo. (Reproducido con permiso de PNAS (14)) Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. Representación esquemática del protocolo células LGV-L2-infectados mutagénesis EMS. Chlamydia trachomatis fueron expuestos a EMS durante la etapa de RB del ciclo infeccioso, y la infección se dejó proceder durante 72 h para permitir la generación de organismos infecciosos elementales (EB) . Piscinas EB mutagenizadas se recogieron y se titularon las unidades formadoras de inclusión (IFU) y unidades formadoras de placas en células Vero. N, núcleo. (Reproducido con permiso de PNAS (14)) Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 3. Ejemplos de morfologías placa comunes entre EMS-mutado C. trachomatis. Mutagenizada C. trachomatis LGV-L2 permitió para formar placas en la monocapa de células Veros durante 14 días. Las placas variaban en tamaño (A) y morfología (B), que se pueden aislar, amplificados en células Vero, y se utilizan en reinfecciones de monocapas Vero para confirmar la estabilidad de los morfotipos de placa. Se muestran ejemplos de fenotipos comunes incluyendo panal (HCM), agrupada (CLMP), pequeña placa (SPQ), y granular (Grn). Las flechas indican grandes depósitos granulares dentro de una placa grn. (Reproducido con permiso de PNAS (14)) Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
La Figura 4. Identificación de lesiones genéticas inducidas por EMS. Localización cromosómica de las variantes de nucleótidos en mutantes que muestran el morfotipo placa Grn. Secuenciación de todo el genoma de tres mutantes Grn identificados mutacións que conducen a cambios de aminoácidos en glgB, que codifica para una enzima glucógeno-ramificación. (Reproducido con permiso de PNAS (14)) Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
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Disclosures
No hay nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Ethyl methanesulfonate (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid) | |||
| SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid) | |||
| Water (sterile, tissue culture grade) | |||
| 2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate | Sigma | D7777 | |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1.2% GTG Agarose , autoclaved | Lonzo | 50070 | |
| Genomic DNA purification kits | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| Ethanol (molecular biology grade) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer | |||
| 25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks) | |||
| 6-well tissue culture plates | |||
| 12-well tissue culture plates | |||
| 96-well tissue culture plates | |||
| Chemical safety hood | |||
| Biological safety hood | |||
| >Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates | |||
| >Dissection microscope | |||
| Fluorometer (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |
References
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