Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Bir Published: August 7, 2013 doi: 10.3791/50688
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Pharmacology and Toxicology, Virginia Commonwealth University, 2Physiology and Biophyics, Virginia Commonwealth University

Summary

Bu enterik sinir sisteminin nöronal ve glial bileşenlerin doğrudan çalışma için bir hücre kültür protokolü göstermektedir. Lamelleri bir nöron / glia karışık kültür, immünohistokimyasal elektrofizyoloji, bireysel nöron ve glia fonksiyonu incelemek için yeteneği sağlayan yetişkin fare myenterik pleksustan hazırlanır

Abstract

Enterik sinir sistemi fonksiyonel mide-bağırsak hareketliliği kontrol gastrointestinal uzunluğu çalışan nöronlar ve glia geniş bir ağdır. Myenterik pleksustan nöron ve glia karışık bir nüfus izolasyonu ve kültürü için bir prosedür açıklanmıştır. Primer kültürlerinde nöronlar ve glia arasında gelişmekte olan bağlantıları ile, 7 gün boyunca korunabilir. Ekli myenterik pleksus ile uzunlamasına kas şerit fare ileum ya da kolon altında yatan dairesel kas sıyrıldı ve enzimatik sindirim tabi tutulur. Steril koşullar altında, izole edilmiş nöronal ve glial nüfus pelet aşağıdaki santrifüj içinde korunmuş ve lamelleri kaplama. 24-48 saat içinde, akson uzantısı oluşur ve nöronlar pan-nöronal belirteçler ile tespit edilebilir. Kültür içinde iki günden sonra izole nöronların yangın aksiyon potansiyelleri olarak yama kelepçe çalışmalar tarafından gözlenmiştir. Ayrıca, enterik glia da identif olabilirGFAP boyama ile ied. Yakın apozisyon nöronların ve glia bir ağ 5 içinde oluşturur - 7 gün. Enterik nöronların tek tek olması ve doğrudan bu immünhistokimya, elektrofizyoloji, kalsiyum görüntüleme ve tek hücreli PCR gibi yöntemler kullanılarak incelenmiştir olabilir. Ayrıca, bu prosedür genetik olarak modifiye edilmiş hayvanlarda gerçekleştirilebilir. Bu metodoloji gerçekleştirmek için basit ve ucuzdur. Daha iyi normal ve hastalık durumlarında, ENS özelliğe keşfedebilir, böylece genel olarak, bu protokol, kolayca manipüle şekilde enterik sinir sisteminin bileşenlerini ortaya koyar.

Introduction

Enterik sinir sistemi (ENS) sinir ve gastrointestinal (Gİ) sistem ve tüm uzunluğu çalışır glia geniş bir ağdır. ENS işlevsel peristaltizm, sıvı emme / salgılanması, uyaranların hissi, vb (yorum için 1) da dahil olmak üzere sindirim tüm yönleriyle, kontrol eder. Bu omurilik bulunan fazla 500 milyon nöron içerir ve beyinde bulunan her nörotransmitter sınıf içerir. Ayrıca, ENS bu merkezi sinir sistemi 2 girişi olmadan refleks olarak işlev görebilir benzersizdir. ENS anlaşılması normal fizyolojik rolünü anlamak için, ama (en Hirschsprung hastalığı), satın alınan (Chagas), hastalık durumları (diyabetik gastroparezi) bağlı, ilaç doğumsal olabilir nöropati çeşitli katılımının anlamak için değil sadece, çok önemlidir bağlı (opioid bağırsak sendromu) ya da yaralanma (postoperatif ileus) 1. nedeniyle. Buna ek olarak, enterik nöronlar yeniden olabilirviral enfeksiyon (varisella zoster) 3 servoir. Çünkü beyin ve bağırsak serotonin yüksek düzeyde olan benzerlikler, merkezi sinir sistemi kusurları tedavi edilmesini amaçlayan ilaçlar genellikle ENS 2 istenmeyen yan etkileri vardır. Bu tür Alzheimer hastalığı ve Parkinson hastalığı gibi birçok nöropatiler ENS bu hastalıkların 4 patogenezinde incelemek için bir kolay kullanılabilir hale, merkezi nöronlarda kendi görünümünü çok önce enterik nöronların benzer hücresel değişiklikler gösteriyor olması da dikkat çekicidir. Bu nedenle, ENS tam bir anlayış hastalık durumları anlama ve farmakolojik yan etkileri önlemede / tahmin bir zorunluluktur.

ENS olan nöronlar geleneksel olarak 8. 5-7 veya kültür nöronlar wholemount hazırlıkları kullanarak kobay olarak incelenmiştir. Nöronların bu büyük hayvan okudu olabilir hangi kolaylığı rağmen, bu model de dahil olmak üzere birçok sınırlamalar vardırgenetiği değiştirilmiş suşları, bu türe özgü reaktifler eksikliği ve bu konularda sipariş ve konut ile ilgili yüksek maliyetli olmaması. Bir kemirgen enterik sinir sistemi modeli geliştirme sistemleri, hücre kültürü tekniği ile birlikte kullanılabilecek diğer yöntemler arasında kurulan geniş bir dizi ve kobay modeli için bir doğrulama sağlama yeteneği üzerinden vuruş çeşitli en önemli avantajı vardır .

Bağırsak peristaltik eylemleri için esas sorumlu olan dış myenterik pleksus (uzunlamasına ve dairesel kas arasında), hem de submukozal ve mukozal pleksi, (: ENS gastrointestinal sistem uzunluğu çalışan üç pleksi oluşur büyük ölçüde sıvı emilimi / salgılanmasını uyaran ve 1 algılama kontrol mukoza, sırasıyla) altında ve içinde bulunan. Bu yöntem, soyma ile uzunlamasına kas / myenterik pleksus (LMMP) hazırlık izolasyonu ile başlargastrointestinal dış kas tabakası kapalı. Bu dramatik mukoza tabakası izolasyon söz konusu olduğunda ortaya çıkan kirlenme sorunları azalır. Sonuç olarak, bu işlem oldukça ENS salgı işlemleri daha motilite sinirsel kontrolü çalışma için idealdir.

Yöntemi burada enterik nöronlar ve glia karışık bir kültür sonuçlarını sundu. Nöronların en az iki farklı türde önceki mevcut elektrofizyolojik ve immünositokimyasal gözlemler 9 dayanmaktadır. Glia varlığı kendi başlarına çalışmak için önemli bir hücre tipi sadece gibi, son derece avantajlıdır, ancak enterik nöronlar 10 hayatta kalma katkıda bulunmak ve nöronal hücre yüzeyinde 11 yerli reseptör ifade korumak. Ayrıca, enterik glia eksiklikleri 'nöro-gliopathies' 12 icat anormal gastrointestinal motilite hastalık durumları, yol açabilir. Bu nedenle, ENS kültür Burada yer RSoruşturma için olgunlaşmış birkaç hücre tiplerinde onu ç lar.

Bu yöntem için avantajları izolasyon, ucuz araç gereksinimleri ve deneyimli laboratuvar personeli tarafından teknik ana kısa bir süre kolaylığı vardır. Metodoloji sınırlamaları düşük genel hücreli yüksek doku birimleri verim ve mukozal ve submukozal pleksi gelen ENS nöronların dışlama içerir. Bu işlem elektrofizyoloji, immünhistokimya, tek hücreli PCR ve diğer yöntemler konusunda uzmanlaşmış bilim adamları için son derece avantajlı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan bakımı ve deneysel prosedürlere uygun olarak ve Virginia Commonwealth Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. 24-yuvalı plakalar içinde steril Poli-D-lizin ve laminin kaplı cam lameller hazırlanması

  1. Adım 1 için tüm işlemler steril koşullarda yapılmaktadır, bir başlık altında ve steril reaktifler ile. Cam lamelleri ve çift deiyonize su (GKD 2 O) önceden sterilize edilmelidir. Tabak hazırlanması nöron izolasyonu önce iki hafta kadar yapılabilir.
  2. Kaputun altında, bir 24 plaka 12 kuyu otoklava cam lamelleri yerleştirmek için steril forseps kullanabilir.
  3. Vaktinden poli-D-lizin stok hazırlayın. 5 mg poli-D-lisin ile steril ddH2O 50 ml ilave edilir. -20 ° C'de vorteks ve 3 ml alikotları mağaza Kullanmadan önce alikotları çözülme.
  4. Pipet 80 ul: 25 cm2 başına 1 ml poli-D-lizin hazır bir son konsantrasyon için,Her bir cam lamel üzerine (2 cm 2) üstüne poli-D-lisin stoklar. Çözüm 10 dakika dinlendiriniz.
  5. Poli-D-lizin kullanarak vakum çıkarın ve steril GKD 2 O. ile 3x lamelleri yıkayın
  6. Plakaları başlık altında en az 2 saat kurumasını bekleyin.
  7. Plakalar 4 ° C veya saklanabilir - 20 ° C laminin kaplama geçmeden önce.
  8. Vaktinden laminin stok hazırlayın. Buz üzerinde laminin çözülme ve kullanım sırasında buz üzerinde tutmak. 50 ug / ml 'lik bir konsantrasyona kadar seyreltilir; konsantrasyonu çok dikkat edin; her biri çok farklı olacaktır. Çok konsantrasyonuna bağlı olarak, yaklaşık 20 ml GKD 2 O laminin her flakon eklenecektir. -80 Alikot (5 mi) ve mağaza ° C Kullanmadan önce buz üzerinde hacimde çözülme.
  9. 5 mg / cm 2 laminin ile kaplayın lamelleri, her lamel laminin stok pipet 200 ul.
  10. 1 saat boyunca lamelleri, laminin çözelti inkübe edin.
  11. Kalan laminin çözüm aspire ve bir kez lamelleri yıkayınGKD 2 O. Lamelleri yüzey kazıma kaçının.
  12. Kadar iki hafta boyunca 4 ° C'de saklayın plakalar.

2. Nöron İzolasyon Çözümleri önceden hazırlanması

  1. (: 118 NaCl, 4.6 KCl, 1.3 2 PO 4, 1.2 MgSO 4, 25 NaHCO3, 11 glikoz ve 2.5 CaCl 2 NaH mM) Krebs çözeltisi hazırlayın. Yeri 13.79 g NaCl (FW 58.44), 0,686 g KCl (FW 74.55), 0,312 g NaH 2 PO 4 (FW 120), 0,289 g MgSO 4 (FW 120.4), 4.20 g NaHCO3 (FW 84.01), 3.96 g glukoz (FW 180.2), ve 2 L GKD 2 0 içinde 0.555 g CaCI2 (FW 111). 4 ° C'ye soğutun
  2. Ortamı (% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotik / antimikotik ile F12 ortamı) durulama hazırlayın: F12 ortamı 500 ml'lik bir şişe için 50 ml FBS ve antibiyotik / antimikotik 100x sıvı (Gibco) ve 5 ml ekleyin.
  3. Enterik nöron ortamı (Neurobasal B-27 içeren bir ortam, 2 mM L-glutamin,% 1 FBS, 10 ng / ml, gliyalden türevlenmiş Neurotr hazırlanmasıophic faktör (GDNF) ve antibiyotik / antimikotik 100x sıvı). GDNF stok yapmak için, -80 ° C de 10 mg GDNF için 1 ml GKD 2 O ekleyin ve 50 ul alikotları, mağaza geri dondurma Tam nöron bir ortam 50 ml'lik bir şişe için, 47.5 mi Neurobasal bir ortam, 1 mi B-27 (50x), 500 ul FBS, 500 ul 200 mM L-glutamin (Gibco) ve 50 ul stok GDNF ve 500 ul / antibiyotik kombine antimikotik 100x Sıvı. Medya GDNF tazelik sağlamak ve bu pahalı cep medya karışımı büyük miktarda kirlenmesini önlemek için küçük 50 ml gruplar halinde yapılır.

3. Fareler ile hasat boyuna kas / myenterik Pleksus (LMMP) hazırlanması

  1. Hayvan deneylerinde gerçekleştirmeden önce uygun ulusal ve kurumsal etik yerinde olmalıdır. 25 g (genellikle yaş 8 hafta boyunca) üzerinden ağırlığında Yetişkin Swiss Webster fareler önce deneylere 6 gruplar halinde yerleştirilmiştir. İki farelerden alınan dokular İleal enterik nöronlar ve glia izolasyonu için kullanılır ve üç farenin için kullanılırkolon hücrelerin izolasyonu.
  2. Cerrahi alan hazırlayın. Küçük cerrahi makas, açılı forseps, pamuklu, üç 200 ml cam bardak ve cam / plastik çubuk (fırça) toplayın. Tüm malzemeleri iyice yıkanmış ve kontaminasyonu en aza indirmek için kullanmadan önce durulanır olun. Bu adım, deney bir gün önce gerçekleştirilebilir.
  3. PH stabilize etmek için, en az 30 dakika karbojen (% 95 oksijen,% 5 CO2) buz ve kabarcık Krebs çözeltisi yerleştirin.
  4. Istenen sıcaklıklarda stabilize etmek için çeşitli ekipman ve sıcak kimyasal açmak; 37 ile sıcak su banyosu (ler) ° 4 ° C'de, bir yer Hank dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ve su banyosu içinde% 0.5 tripsin (37 ° C-C, serin santrifüj .) Komple nöron medya ve durulama medya buzdolabında kalmalıdır.
  5. Yeri 150 ml buz gibi 'kirli', 'temiz' ve 'LMMP' etiketli üç 200 ml cam bardak içinde Krebs kabarmış. Kabarcık beher carbogen ile 'LMMP' etiketli.
  6. Etik kurul, euthanize m onayından sonraservikal dislokasyon veya CO 2 boğulma ouse.
  7. % 70 EtOH ile cerrahi yüzey, temiz cilde dorsal recumbence fare yerleştirin ve forseps kullanarak karın cilt kaldırın. Makas, açık karın boşluğu ve iç sindirim organları ortaya kullanma.
  8. Ileum bir bölüm kaldırma ve mezenteri ortaya çıkararak, gastrointestinal yolun uzunluğu çıkarın. Makasla mezenter ile Snip yavaşça çıkarın ve ileum / kolondan mezenter çekmek için dikkatli olmak, ileum ve kolon çözülmeye.
  9. Bağırsak tam uzunlukta sökülmüş sonra, bağırsak yoluyla çekum için mide distalinde ve proksimal keserek ileum çıkarın Not:. Bu prosedür de proksimalinde için çekum için distalinden kolon kaldırarak kolon doku ile yapılabilir anüs.
  10. Dokular daha proksimal ve distal kolon ve jejenum ve ileum arasında bölünebilir. Bu işlemi geri kalanı ileum izolasyonu sevk edecektir; to işlem kolon LMMP en izolasyonu için aynıdır. Buz Krebs 'kirli' olarak işaretlenmiş bir cam kapta tüm ileum yerleştirin.
  11. Ileum temizlemek için bir araç oluşturmak ve bir dosyalama taş kullanarak künt büyük 20 G iğne buz soğuk Krebs içeren büyük bir şırınga (10 ml) ekleyin.
  12. Üç ya da daha fazla büyük parçalar halinde ileum kesit tarafından ilumundan dışkı temizleyin. Beher bir ileal kısmını çıkarın ve bir ileal parçasının ucunu Kör İğne yerleştirin.
  13. Tüm dışkı ayrı bir atık kabı içine kaldırılır kadar yavaşça bağırsak bölümü üzerinden Krebs çalıştırın. 'Temiz' olarak işaretlenmiş Krebs kaba temizlenmiş bölümüne yerleştirin. Tüm ileum temizlenir kadar tekrarlayın.
  14. LMMP kaldırmak için, yaklaşık 2, küçük bölümler halinde ileum kesmek - 4 cm. Bir plastik veya cam çubuk üzerinde ileum bir segment yerleştirin; ileum kuytu uygun ama (~ 2 mm) gevşek veya gergin olmamalıdır. Yavaşça mezenter parçaları kaldırarak LMMP çıkarılması başlayın hala eklemekBir forseps kullanarak gastrointestinal (Gİ) sistem için ed. Yavaşça başparmak kullanarak çubuk için tüp iğneleyerek çubuk etrafında dönmesini gastrointestinal önleyin.
  15. Temel dairesel kas LMMP ayırın, önce hafifçe hafifçe uzunlamasına kas bir boşluk yaratarak, üst segment altına, mezenter bağlı olduğu tüm hat boyunca forseps kenarına sürün. Sonra yavaşça Krebs ile ıslatılmış bir pamuklu çubuk kullanarak uzunlamasına kas uzak kızdırmak.
  16. Uzunlamasına kas boşluğu üst başlar ve uzunlamasına kas sadece dairesel kas ayrı başlayana kadar çok hafif bir basınç uygularken hafif yatay vuruş kullanarak uzak kızdırmak; mezenter bağlantı noktası birlikte tüm şerit aşağı yapıyoruz.
  17. Sonra yavaşça GI tüp etrafında çalışmaya başlar, boyuna kas yavaş yavaş tüp etrafında dairesel kas tüm yol ayrılır gibi yukarıdan aşağıya ve geriye hareket. Tamamlandığında,LMMP doğal olarak GI borusunun kalanı kapalı gelecektir.
  18. 'LMMP' işaretli beher uzunlamasına kas elde edilen ince bir şerit yerleştirin. Tüm kesimleri için tekrarlayın.
  19. LMMP tüm şeritler tek bir fare elde edildikten sonra, kullanılan diğer fareler için işlemi tekrarlayın. Iyice Tekrar kullanmadan önce 'kirli' ve 'temiz' bardak durulayın.
  20. Biyolojik kirlenme kaldırmak için 3x LMMP durulayın. Buz Krebs ile üç 2 ml Eppendorf tüpleri doldurun. Bir santrifüj içinde 356 x g'de 30 saniye boyunca ilk tüp ve spin LMMP şeritleri yerleştirmek 4 ° C'ye kadar soğutuldu Dikkatli bir pipet ile süpernatant kaldırmak ve sonraki temiz Krebs dolu tüpe LMMP şeritler hareket ettirin. Kalan her tüp için bu işlemi tekrarlayın.

4. Digest LMMP

  1. 10 ml carbogen-kabarmış Krebs solüsyonu 13 mg kollajenaz tip 2 ve 3 mg BSA koyarak sindirim çözeltisi hazırlayın.
  2. Sindirim çözüm ve kullanım SCIS içine durulanır LMMP Yeri segmentlerisors küçük parçalar halinde LMMP snip için.
  3. ° C su banyosunda çalkalayıcı ile 37 60 dakika hafifçe carbogen ile kabarmış olan süre Digest LMMP.
  4. Sindirim tamamlandıktan sonra, 356 x g'de santrifüj az 8 dakika boyunca santrifüj hücreleri toplamak için 4 ° C'de soğutuldu
  5. Bu noktadan itibaren tüm işlemler bir hücre kültürü kaputu steril koşullar altında yapılmalıdır! Tüm reaktifler ve kaplar kullanımdan önce sterilize edilmelidir.
  6. Santrifüj sırasında, 1 mi yerleştirerek% 0.05 tripsin solüsyonu hazırlamak% 0.25 tripsin ısıtıldı ve 4 ml steril bir 50 ml hücre kültür tüpüne HBSS ısıtıldı.
  7. Santrifüj sonra, kaldırmak ve supernatant atın. Bir vakum kullanmayın, bu olasılığı düşük santrifüj hızı nedeniyle hücre pelet emmek olacaktır. Dikkatlice% 0.05 tripsin solüsyonu 5 ml temiz bir tüp içine hücre pelet ve yer çıkarın.
  8. 37 7 dakika boyunca çalkalanarak ° C su banyosu içinde% 0.05 tripsin solüsyonu hücreleri Digest. 7 mi aşmayınn toplam tripsin tedavi ya da nöronların yok olacak.
  9. Tripsin muamelesi 7 dakika sonra soğuk durulama ortam 10 ml tripsin nötralize edilir.
  10. 356 x g 8 dakika hücreler santrifüj. Çıkarın ve medya atın.
  11. Santrifüj sırasında, steril bir 15 ml'lik hücre kültürünün tüpün üstüne sterilize Nitex örgü bir bölümü dengesi.
  12. Santrifüj sonra, kaldırmak ve supernatant atın. 3 ml tam ortam nöron içinde öğütülerek yavaşça tekrar süspansiyon hücre karışımı. Bu adımı ve hücre karışımı toz haline olduğu gelecekteki tüm adımları sırasında hava kabarcıkları oluşmasını önleyin. Tüm triturations çok nazikçe yapılmalıdır. Temiz 15 ml hücre kültürü tüp içine Nitex örgü süzülür hücre çözümü.
  13. İsteğe bağlı: Cap hücre kültürü tüp ve 30 dakika için hafif haddeleme ve devirme ile soğutmalı Hula mikser yer (veya dönme sağlayan herhangi bir mikser). Bu adım isteğe bağlıdır, ancak önerilen olduğunu.
  14. İsteğe bağlı: Hula mikser sonra hücreler yıkamak için 2 ml soğuk durulama medya ekleyin.
  15. Santrifüj hücreleri (8 dk, 356 x g) toplayın. Çıkarın ve supernatant atın.
  16. 1.200 ul tam nöron medya hücreleri tekrar süspansiyon. Yavaşça 1 ml plastik pipet kullanarak hücreleri Karışım. Hava kabarcıkları oluşturmaz. En parçalar kırık ve hücrelere sıvı içine askıya kadar yavaş ve nazikçe pipetle.
  17. Bir ön-kaplamalı cam lamel içeren 12 gözeneği için tam ortam 750 ul ilave edilerek ezildi hücre çözeltisinden 100 ul ilave edin.
  18. % 5 CO2 ile 37 ° C'de hücre kültürü inkübatöründe inkübe nöronlar.
  19. Hücre ortamı her 2 günde bir yarısı değiştirin.
  20. Nöronlar 1 sonra elektrofizyolojik kayıtlar için hazır - kültüründe 2 gün.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LMMP türetilmiş hücreler, nöronlar ve diğer hücre tipleri arasında hemen takip eden izolasyon kolayca belirgin olmayacaktır. Yaşam, belirsiz fenotip yuvarlak hücreler de tam olarak sindirilir doku parçaları ve bağ dokusu doku döküntü olarak görülebilir. Bu ayaktakımı hiçbir endişe ve büyük ölçüde iki gün içinde ilk medya değişikliği ile kaldırılacak. Sağlıklı, canlı hücreler de silinecektir bu önce slaytlar temizlemek için çalışmayın.

Kültüründe bir gün sonra, nöronlar akson uzantısı göstermeye başlar. Nöronların özel tanımlama şu anda hala belirsiz olabilir. Hücrelerin deneysel odasına aktarmak için yeterli yapışık kaydıyla, kültür bir gün sonra elektrofizyolojik çalışma için hazır olacak. 5 - Ancak, hücreler yaklaşık gün 2 kültür ve fonksiyon testleri için idealdir (elektrofizyoloji, kalsiyum görüntüleme) iki gün sonra daha yapışık.

ent "> nöron morfolojik özellikleri kültüründe yaklaşık bir hafta (Şekil 1) sonra belirgin hale gelir. nöronlar (glia serpiştirilmiş moda gibi neredeyse 'ganglion' uzun projeksiyonlar görüntülemek ve büyüyünce ideal immunocyctochemical özellikleri, yaklaşık on gün sonra tespit edilebilir Şekil 2). Bu lekeler bu metodoloji kullanılarak bu hücrelerin sinaptik etkileşimleri incelemek mümkündür olabileceğini düşündürmektedir.

Kültüründe bir gün sonra, nöronlar kendi sinüs que olmayan ya da 'belirleyici özelliği', aksiyon potansiyeli (Şekil 3) tarafından kabul edilmektedir. Elektrofizyolojik olarak, onlar işlevsel en az iki nöronal tip olarak sınıflandırılabilir: bir sonrası hiperpolarizasyon içeren nöronlar ve sodyum ve potasyum ve sonrası hiperpolarizasyon ve daha az sodyum ve potasyum iletkenlik (Şekil yok nöronların akım / yoğunluğu ilişkileri arttı 4). AHP pozitif ve negatif neurons sırasıyla, AH ve önceki gine iş görülen S nöronlar ile ilişkili görünmektedir. AHP negatif nöronlar (S nöronlar) hangi dalları birçok kez uzun bir projeksiyon varken AHP pozitif nöron (AH nöronlar), hücre gövdesi etrafında kaynaklanan birden fazla uzun projeksiyonlar var. Bu, Şekil 1 'de immünositokimyasal kodlama ile bağlantılı olarak, nöronal çok heterojen popülasyon olduğunu göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1. Fare uzunlamasına kas izole enterik nöronlar ve glia immünohistokimyasal karakterizasyonu. Mikroskopisi bütün montaj ileum uzunlamasına kas nöronal özgü β-III-tubulin (Abcam, tavşan, 1:1,000) boyama (A), fare hazırlama saptandı. Hücreler izole lkalbindin (C) (Chemicon, tavşan, 1:1,000) ve kalretinin (D) için pozitif leke, ongitudinal kas / myenterik pleksus (LMMP) hazırlıkları nöronlar (β-III-tubulin, Abcam, tavşan, 1:1,000 B) içerir (Swant, tavşan, 1:2,000). Glia hücreleri (E) Glia-spesifik bir işaretleyici GFAP (Chemicon, fare, 1:500) ile görselleştirilmiştir. Antikorlar uygun keçi sekonder antikor Alexa 488 (yeşil, Moleküler Probları, 1:1,000) 0 ile görüntülendi. Çekirdekler Hoescht 33.342 (mavi, CG, 1 mcg / ml) kullanılarak görüntülendi. Birincil antikor (F) ihmal edildiği zaman herhangi bir boyanma görüldü. . Modifiye ve Smith, TH, ve ark yeniden basıldı Morfin Sodyum Kanalları inhibisyonu ile Enterik Nöron Eksitabilite azaltır PLoS One, DOI:... 10.1371/journal.pone.0045251.g001 (2012) büyük rakam görmek için buraya tıklayın <./ P>

Şekil 2,
Şekil 2. Fare uzunlamasına kas izole nöronlar ve glial birbirlerine yakın olarak büyür. Mikroskopisi görüntü nöronların (yeşil, β-III-tubulin Abcam, tavşan, 1:1000) ve glial (kırmızı, GFAP, Chemicon, fare göstermektedir , 1:500) kolayca birbirine bitişik büyümek ve in vitro etkileşim görünür. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. Kültürlü enterik nöronlar ve glia elektrofizyoloji. Cu olarakrrent kelepçe modu, bütün nöronlar (A) akım enjeksiyon üzerine aksiyon potansiyelleri görüntülenir. Glia (B) aksiyon potansiyelleri yok ama mevcut enjeksiyon yanıt olarak büyük elektrotonik potansiyelleri görüntülerim. A & B -0.01 nA güncel bir enjeksiyon ile başlangıç ​​ve on 0.01 nA adımlarla 0.09 nA artırmak olarak Protokoller. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 4,
Şekil 4. Fare ileum kültüründe nöronlar bir elektrofizyolojik heterojen nüfus bulunmaktadır. Akım kelepçe modunda, aksiyon potansiyelleri nöronların sonuçlara 0.09 nA güncel bir enjeksiyon içinde. S nöronlar (A), hemen istirahat membran potansiyeli f dönmekstimülasyon ollowing. AH-tipi nöronlar (B) istirahat membran potansiyeli yavaşça başlangıç ​​değeri dönmeden önce aşağıdaki temel düşer hangi uyarılmasını takiben bir afterhyperpolarization (AHP) görüntüler. . Modifiye ve Smith, TH, ve ark yeniden basıldı Morfin Sodyum Kanalları inhibisyonu ile Enterik Nöron Eksitabilite azaltır PLoS One, DOI:.. 10.1371/journal.pone.0045251.g001 (2012).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kullanılan hayvanların

Bu protokol İsviçre Webster fareler için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntem, sıçan gibi diğer küçük ölçekli memelilere ve farenin diğer suşları için de uyarlanabilir. Biz başarıyla C57 fare ve μ-opioid reseptör knock-çıkışları ile ön izolasyonları gerçekleştirdik. Ancak, bu farelerin diğer suşları GI morfolojik farklılıklar nedeniyle sorunlu olabilir olması da mümkündür. Ayrıca, nihai izolasyon nöronların çıkan karışım etkileyebilir LMMP hazırlanması 13 arasında nöronal devre içinde fare suşları arasında, bilinen bir fark (genel Balb / c C57BL / 6) vardır. Ayrıca, yaş bu yöntemi kullanırken yaşa bağlı nöronal kayıp kolinerjik nöronlar ve bunlara karşılık gelen glia özgü myenterik pleksusta ortaya gibi, dikkate alınmalıdır, ve yaş 14 12 ay gibi erken görülebilir. Son olarak, diğer speci için bu protokolü adapte zamanhayvanların es, bakım myenterik pleksus yerine dairesel kas bağlı kalan daha uzunlamasına kas ortadan gelir sağlamak için alınmalıdır.

Doku

Nöronlar ve glia bu protokolü kullanarak ileum ve kolon hem de yetiştirilebilir. İleal izolasyonların uygun bir doku daha büyük bir miktarda ve uzunlamasına kas kalınlığında dairesel kas ayıran hangi kolaylığı nedeniyle gerçekleştirmek için daha kolaydır. İki hayvan az ya da bu gibi elektrofizyolojik İmmünositokimya gibi uygulamalar için 24 plaka 12 kuyu işgal etmek için ihtiyaç vardır. Kolon malzeme yalıtım daha problemlidir. Kalın bağırsak uzunlamasına kas dairesel kas ayırmak için daha zordur. Ayrıca, temel dairesel kas yırtılmaları için daha hassas hale getirir kolonda daha incedir. , En az üç hayvandan, 12 wel işgal etmek gereklidir, bu nedenle aynı zamanda, kolon, ileum daha kısadır24 plaka ls. Ileum ve kolon hasat ve aynı hayvan ayrı kaplama, ancak ek hayvanlar veya daha az hücre kaplama alanının kullanımı kolon izolasyonu için gerekli olacaktır olabilir de.

Hücre Kültürü Süresi

Elektrofizyolojik en iyi kültüründe 2 ila 6 gün sonra izole nöronların enterik / glia yapılmaktadır, bu zamanda hücreleri tam hücreli mühür yapmak için yuvarlak ve uysal, ideal koşullardır. Kültür hücrelerinde bir hafta olmak sonra düz ve hücreler plakasına bağlı olarak görsel olarak daha farklı. Hücreleri daha sıkı plaka takılı olduğunda immünositokimyasal deneyler iyi çok sayıda yıkama adımları sırasında hücre kaybını önlemek için, gün yaklaşık 10, yapılır. Fare enterik hücreleri üç hafta için kültür muhafaza edilmiştir. Zaman içinde reseptör ve nörotransmitter ifade kalıpları bu kültürlerde incelenecek henüz. Nöronal sağkalım üzerine Ancak, daha önceki çalışmalardave geleneksel kobay enterik sinir izolasyonların biyokimyasal / farklılaşma morfolojik nöronlar 15 gün öncesine kadar hayatta ve yukarı diğer hayvanlar kaynaklardan elde edilen nöronlar aynı şeyi olabileceğini düşündürmektedir üç hafta 8, için histokimyasal ve morfolojik özellikleri yüksek derecede korumak bulduk .

Hücre Verim

Ilumundan izole zaman, bu teknik bir hücre toplam verimi, iki farenin bir 24 kuyulu plaka 12 kuyu olup. Myenterik pleksus toplam bağırsak duvarının en az% 1 oluşur, bu, doku hacmi ile karşılaştırıldığında nöronların nispeten düşük bir sayıdır. Bu yöntemin bir dezavantajı, elde edilen hücrelerin sayısını arttırmak için, tek bir kullanılan hayvanların sayısını artırmak zorunda olmasıdır. Hayvan sayısında artış olduğu zaman, birkaç laboratuar üyeleri LMMP en izolasyonu ilk adımda işbirliği önerilmektedir. Bu son p önce hücreler, bir kesintiye durumda olan süreyi azaltıralanlarındaki durum ve bu artış hücre sağkalım.

Hücre Yoğunluğu

Yazılı gibi, bu protokol, düşük yoğunluklu hücre izdiham (- Bir günlük kültürden sonra ölçülen% 40 ~ 10) ileal yalıtım elde etmek için iki hayvan kullanır. Düşük yoğunluklu hücre kaplama son kültüründe kontaminasyon riskini azaltmak için bu yöntem idealdir. Tek bir hücre elektrofizyoloji gerçekleştirilir zaman da faydalıdır. Hücre sayısı, daha fazla hayvan kullanılarak veya nihai kaplama alan, ancak kontaminasyon riski artar azaltarak artırılabilir. Yüksek hücre yoğunlukları gerekli olduğunda bu sorun off-set, ya adım veya antibiyotik kullanımının artması yıkama önerilir artış için.

Hücre heterojenite

Bu protokoller kullanılarak elde edilen nöronlar gibi elektrofizyolojik karakterizasyon ile gösterilen en az iki fonksiyonel olarak farklı popülasyonlar, (Şekil 3) içermektedir. Ancak, pek çok bilinen türleri vardır kobay 15 ve aynı bulunan belirli nörokimyasal kodlama desenli nöronlar muhtemelen fare doğru değildir. Bu hücre heterojen bu yöntem için bir avantaj ve dezavantaj hem de. Diğerleri arasında, immünositokimya ya da hücre-hücre etkileşimleri gözlem tek hücreli fonksiyonel çalışmalar, gerçekleştirirken Hücre heterojen faydalıdır. Kültür nöron / glia etkileşimleri (Şekil 3) okuyan zaman hücre heterojen özellikle avantajlı olabilir. Bununla birlikte, cep heterojen protein ekspresyonu, vs değişikliği, herhangi bir hücre tipi ya da nöron tipi katkıda edilemediğinde, immünolojik olarak metodolojiler için bir engeldir. Intraganglionic ve kas içi enterik glia 16: sadece iki alt tipi LMMP hazırlık var olduğu gösterilmiştir gibi glia incelenmesi daha az sorunlu olacaktır. Diğer hücre tipleri, aynı zamanda bu tür Cajal veya fibroblast interstitial hücrelerin olarak, bu kültürde mevcut olabilir.

ep "> Kaplama Hücreler

Bu yöntemde, hücreler oniki kuyularda kaplanmıştır. Bazen, bu kuyuların bir ya da iki izolasyon sonraki ilk günde kirlenme gelişecektir. Bu durumda, kirlenmiş kuyulardan slaytlar derhal atılır ve de kalan kirlenme öldürmek için% 70 etanol ile durulanır. Bu protokol daha az kuyu veya tek bir çanak içinde izole edilmiş tüm hücreler, ve bunun sonucu olarak levha için modifiye edilebilir, kirlenme riskini arttıracaktır. Yine, zaman kirlenme artması, ekstra yıkama adımları ya da artmış antibiyotik kullanımının riskleri önerilmektedir. Protokolde kullanılan antibiyotik / antimikotik sıvı (Gibco) ve Amfoterisin B, streptomisin ve Penisilin oluşur. Diğer antibiyotik kombinasyonları ya da artan konsantrasyonları yıkayın ve nöron ortamda da hazırlanması sırasında kontaminasyon azaltılması optimize etmek için kullanılabilir.

Takılması Hücreler

Hücreleri üzerinde kaplanmıştırlamelleri laminin ve poli-D-lisin ile kaplanmış. Laminin enterik nöronlar ve glia yaşam önemlidir, ve akson uzantısı ve nöronal gelişim 17 teşvik ve gibi, bu izolasyon için gerekli olarak kabul edilir. Bununla birlikte, örneğin ornithin veya Matrigel olarak, poli-D-lizin alternatif bağlanma faktörleri olarak istenen denenebilir.

Sonuç olarak, bu enterik nöronların izolasyonu ve çalışma teknikleri ile geniş bir aralığı için uygun bir glia hücresi, bir karışık kültür içerir. Bu metodoloji, usta kolay ucuz ve zaman etkilidir. Bu hücre modeli ENS ile ilgili çeşitli patolojiler anlayışına katkı sağlayacağını umut ediyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar önemli bir çıkar çatışması var olduğunu beyan ederim.

Acknowledgments

Sağlık Hibe DA024009 Ulusal Enstitüsü, DK046367 & T32DA007027.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter) Fisher Scientific 12-545-82  
Poly-D-lysine Sigma P6407- 5 mg  
24-well cell culture plate CELLTREAT 229124 May use any brand
Laminin BD Biosciences 354 232  
ddH2O Can prepare in lab 
15 ml Sterile Centrifuge Tube Greiner Bio-one 188261 May use any brand
50 ml Sterile Centrifuge Tube Greiner Bio-one 227261 May use any brand
NaCl Fisher BioReagents BP358-212 MW 58.44
KCl Fisher BioReagents BP366-500 MW 74.55
NaH2PO4 .2H2O Fisher Chemicals S369-3 MW137.99
MgSO4 Sigma Aldrich M7506-500G MW 120.4
NaHCO3 Sigma Aldrich S6014-5KG MW 84.01
glucose Fisher Chemicals D16-1 MW 180.16
CaCl22H2O Sigma Aldrich C5080-500G MW 147.02
F12 media Gibco 11330  
Fetal Bovine Serum Quality Biological Inc. 110-001-101HI May use any brand
Antibiotic/antimycotic 100x liquid Gibco 15240-062  
Neurobasal A media Gibco 10888  
200 mM L-glutamine Gibco 25030164  
Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF) Neuromics PR27022  
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 8940 May use any brand
Dissecting Tissue Forceps Fisher Scientific 13-812-41 May use any brand
Cotton-Tipped Applicators Fisher Scientific 23-400-101 May use any brand
250 ml Graduated Glass Beaker Fisher Scientific FB-100-250 May use any brand
2 L Glass Erlenmyer flask Fisher Scientific FB-500-2000 May use any brand
Plastic rod (child's paint brush) Crayola 05 3516 May use any brand
Carbogen Airgas UN 3156 5% CO2
10 ml Leur-lock Syringe Becton Dickinson 309604 May use any brand
21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle Becton Dickinson 305167 May use any brand
Collagenase type 2 Worthington LS004174  
Bovine Serum Albumin American Bioanalytical AB00440  
2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes Fisher Scientific 13-864-252 May use any brand
Nitrex Mesh 500 µM Elko Filtering Co 100560 May use any brand
Pipette Set Fisher Scientific 21-377-328 May use any brand
Sharpeining Stone Fisher Scientific NC9681212 May use any brand
Equipment
LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood) Nuaire NU-425-400 May use any brand
10 L Shaking Waterbath Edvotek 5027 May use any brand
Microcentrifuge 5417R Eppendorf 5417R May use a single larger centrifuge with size adapters
Allegra 6 Series Centrifuge Beckman Coulter 366816 May use any brand
HuluMixer Sample Mixer Invitrogen 15920D  
AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator Nuiare NU-4750 May use any brand
Analytical Balance Scale Mettler Toledo XS104 May use any brand

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).
  2. Gershon, M. D. The enteric nervous system: A second brain. Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).
  3. Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons. J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).
  4. Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).
  5. Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig. J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).
  6. Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig. Neuroscience. 82 (3), 899-914 (1998).
  7. Rugiero, F., et al. Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia. J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).
  8. Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation. Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).
  9. Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels. PLoS One. 7 (9), e45251 (2012).
  10. Abdo, H., et al. Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione. FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).
  11. Aube, A. C., et al. Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption. Gut. 55 (5), 630-637 (2006).
  12. Bassotti, G., et al. Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies. World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).
  13. Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).
  14. Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract. Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).
  15. Furness, J. B. Types of neurons in the enteric nervous system. J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).
  16. Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).
  17. Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin. Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).

Tags

Nörobiyoloji Sayı 78 potansiyel Nörobilim Biyomedikal Mühendisliği Anatomi Fizyoloji Moleküler Biyoloji Hücre Biyolojisi Biyofizik Farmakoloji myenterik Pleksus Sindirim Sistemi Nörobilim Enterik sinir sistemi kültür fare yama kelepçe aksiyon gastrointestinal nöropatiler doku hücre kültürü hayvan modeli
Bir<em&gt; In-vitro</emYetişkin Mouse myenterik Pleksus izole edilen enterik Nöronlar ve Glia bir&gt; hazırlanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, … More

Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse. J. Vis. Exp. (78), e50688, doi:10.3791/50688 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter