Summary
Il tessuto adiposo (AT) è un sito di attivazione delle cellule immunitarie intensa e interazione. Quasi tutte le cellule del sistema immunitario sono presenti in AT e per i rapporti sono alterati da obesità. Isolamento adeguato, quantificazione e caratterizzazione di AT popolazioni di cellule immunitarie sono fondamentali per comprendere il loro ruolo nella malattia immunometabolic.
Abstract
La scoperta di una maggiore infiltrazione di macrofagi nel tessuto adiposo (AT) di roditori obesi e gli esseri umani ha portato ad un intensificarsi di interesse contributo delle cellule immunitarie all'insulina locale e sistemica di resistenza. Isolamento e quantificazione delle diverse popolazioni di cellule immunitarie nel magri e obesi AT è oggi una tecnica comunemente utilizzata nei laboratori immunometabolism; ancora estrema cura deve essere presa sia in stromale isolamento delle cellule vascolari e nella analisi di citometria a flusso in modo che i dati ottenuti siano affidabili e interpretabile . In questo video mostriamo come per tritare, digerire, e isolare la frazione di cellule vascolari-arricchito stromale immune. Successivamente, mostriamo come anticorpi etichetta macrofagi e linfociti T e come correttamente cancello su di loro in esperimenti di citometria a flusso. Sono forniti di flusso rappresentativi citometria trame di basso contenuto di grassi alimentati magra e ricca di grassi nutriti topi obesi. Un elemento critico di questa analisi è l'uso di anticorpi che fannoNon fluorescenza nei canali dove AT macrofagi sono naturalmente autofluorescenti, così come l'uso di controlli di compensazione adeguati.
Introduction
Storicamente, il tessuto adiposo (AT) è stato visto come un organo inerte di stoccaggio dei lipidi, che si espande e si contrae in risposta al bilancio energetico. Ora capiamo che AT rappresenta un organo endocrino dinamica che secerne attivamente una serie di ormoni che influenzano direttamente il comportamento alimentare e l'omeostasi del glucosio sistemico. Inoltre, negli ultimi dieci anni c'è stato un crescente apprezzamento per le numerose popolazioni di cellule immunitarie che risiedono nella AT frazione stromale vascolare (SVF), così come il loro contributo alla AT omeostasi.
La possibilità di separare la AT adipociti e SVF utilizzando un collagenasi digest seguita da centrifugazione differenziale è stato descritto da Rodbell nel 1964 1. Collagenasi II è più spesso utilizzato per la separazione degli adipociti e SVF a causa di manutenzione di adipociti recettori dell'insulina 1. All'inizio, frazionamento enzimatica di AT è stato principalmente impiegato per studiare adipocyte metabolismo e per isolare preadipocytes. Più recentemente, questa tecnica, combinata con l'ampia disponibilità di citofluorimetri e il numero sempre crescente di anticorpi coniugati fluoroforo disponibili in commercio, ha facilitato la caratterizzazione di AT cellule immunitarie.
Sebbene la presenza di cellule immunitarie nella infiammato AT era stato descritto in precedenza 2, gli articoli fondamentali per Weisberg et al. e Xu et al. pubblicato nel 2003, furono i primi a documentare l'accumulo di AT macrofagi (ATM) in obesità, che secernono citochine infiammatorie e correlare con AT-specifica e sistemica insulino-resistenza 3,4. Queste osservazioni hanno fornito la base di un nuovo campo di indagine recentemente coniato, "immunometabolism," 5 e sono state seguite da studi che implicano varie popolazioni di cellule immunitarie, comprese le cellule dendritiche 6, mastociti, cellule T 7 8 -10, cellule B, cellule NKT 11 12 13, eosinofili e neutrofili 14,15 nello sviluppo dell'obesità associata resistenza all'insulina.
L'obiettivo di questo articolo è di fornire una descrizione dettagliata della tecnica digest collagenasi utilizzata per isolare le cellule del AT SVF e caratterizzare bancomat e AT cellule T mediante citometria a flusso. Questo protocollo è stato ottimizzato per mouse, tuttavia, gli spettatori possono trarre beneficio dalla lettura di un ottimo articolo che fornisce ampi dettagli sulla ottimizzazione di questa tecnica per l'uomo a 16 anni. I destinatari di questo articolo include investigatori con limitata esperienza di lavoro con il mouse e l'esecuzione di citometria a flusso. Diverse considerazioni pratiche per il bilanciamento resa cellulare e la vitalità con il tempo e le risorse sono presentate così come controlli di citometria a flusso ottimali per la caratterizzazione di AT popolazioni di cellule immunitarie. Oltre al nostro protocollo, i lettori sono referred un recente articolo JoVE da Basu et al. per una eccellente discussione di alcuni aspetti tecnici della citometria a flusso per comprendere adeguati controlli e compensazioni 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reagenti e accessori per la
Prima di iniziare questo protocollo sperimentale, preparare i seguenti reagenti:
- 70% di etanolo
- PBS 1X
- 1X DPBS (senza Ca e Mg) integrati con 0,5% BSA
- FACS buffer: 1X DPBS (senza Ca e Mg), 2 mM EDTA, e l'1% FCS
- Tampone ACK: 150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, e 0,1 mM Na 2 EDTA in acqua
2. Raccolta e Preparazione del tessuto adiposo
- Euthanize topi secondo procedure IACUC approvati specifici per ogni istituzione.
- Bagnare completamente il pelo con il 70% di etanolo.
- Fare un'incisione a livello del processo xifoideo (parte inferiore dello sterno) e aprire la cavità toracica per esporre il cuore, facendo attenzione a non recidere le principali vasi sanguigni.
Nota: A questo punto, è anche utile per lasciare il diaframma intatto il piùpossibile e tagliare una tacca dal lato destro della gabbia toracica per permettere al sangue di fluire e perfusato dalla cavità toracica.
- Agganciare l'atrio destro per permettere al sangue e perfusato per sfuggire al sistema circolatorio.
Nota: Quando si tratta di topi obesi, eccesso pericardico AT può avere bisogno di essere rimosso per consentire l'accesso al cuore.
- Afferrare il cuore con una pinza e inserire delicatamente un ago nel ventricolo sinistro attraverso l'apice. Perfusione lentamente il mouse con 15 ml di PBS sterile.
Nota: ridurre il tasso di perfusione se i polmoni iniziano a riempirsi ed espandersi.
- Aprire la cavità peritoneale e rimuovere i cuscinetti di grasso perigonadal con attenzione per evitare eventuali tessuti gonadici.
- Mettere cuscinetti di grasso in una pesata barca sul ghiaccio contenente 2 ml di 1X DPBS (senza Mg o Ca) integrata con 0,5% BSA, e tritare la AT in pezzi pregiati.
Nota: Limitare la quantità di AT per pesare barca a 1,2 g. Se la quantità di AT supera 1,2 g, dividerlo equamente tra due barche a pesare.
- Conservare i campioni in ghiaccio e preparare 3 ml di soluzione di collagenasi digest per AT campione costituito da 1X DPBS integrato con 0,5% BSA, 10 mM CaCl 2, e 4 mg / ml di collagenasi di tipo II.
3. Collagenasi Digestione
- Transfer per provette coniche da 50 ml versando l'omogeneizzato e risciacquo la barca pesare con 1 ml DPBS (0,5% BSA) e 3 ml di soluzione di collagenasi II digest.
- Incubare a omogeneizzato in uno shaker di rotazione (200 rpm) a 37 ° C per 20 min.
- Aggiungere 10 ml DPBS (0,5% BSA) per tubi conici e posto sul ghiaccio.
- Triturare omogeneizzato numerose volte utilizzando una pipetta sierologica 10 ml, e passare sospensioni cellulari attraverso il filtro 100 micron in un nuovo tubo da 50 ml.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 500 xg per 10 minuti a 4 & dad esempio, C.
- Decantare il surnatante e risospendere SVF pellet cellulare in 3 ml di tampone ACK per la lisi degli eritrociti contaminanti.
- Aggiungere 12 ml di tampone FACS sospensione cellulare e centrifugare a 500 xg per 10 min a 4 ° C.
- Decantare il surnatante e risospendere SVF pellet di cellule in tampone FACS.
Nota: utilizzare la dimensione del pellet cellulare come guida per quanto tampone FACS per risospendere in Se il pellet cellulare copre il fondo della provetta 50 ml conica, utilizzare 0,5-1 ml tampone FACS, altrimenti, risospendere in 0.25-0.5 ml.
- I campioni su ghiaccio e preparare 1:10 aliquote di diluizione di ogni campione per il conteggio delle cellule di miscelazione 40 microlitri di buffer FACS, 50 soluzione blu tripano microlitri (0,2%), e 10 microlitri di sospensione cellulare.
- Contare le cellule vitali sulla base di blu tripano esclusione e diluire sospensioni di cellule ad una concentrazione finale di 5-10 x 10 6 cellule / ml.
4. La colorazione degli antigeni di superficie
Nota: Per fare un esempio, nel quantificare la percentuale di sportelli automatici in base a F4/80 e CD11b, i seguenti compensi e controlli FMO dovrà essere preparato:
- Avviare l'elaborazione (cellule)
- DAPI o ioduro di propidio (PI) macchia singole (cellule, non aggiungono colorante vitalità fino al punto 5.1)
- F4/80 APC (cellule o sfere di compensazione) singoli macchia
- CD11b FITC cellule o singole macchia (sfere di compensazione)
- FMO 1 (celle): Rat IgG2a κ isotipo di controllo APC + CD11b FITC + colorante vitalità (aggiunto a passo 5.1)
- FMO 2 (celle): F4/80 APC + Rat IgG2b κ isotipo di controllo FITC + colorante vitalità (aggiunto a passo 5.1)
- Aggiungi anticorpi primari fluoroforo-coniugato e / o controlli isotipo alla concentrazione adeguata (vedi Tabella di reagenti e materiali).
- Proteggere i campioni dalla luce e incubare a 4 ° C per 30 min.
- Aggiungere 2 ml di tampone FACS sospensione cellulare e centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Decantare il surnatante e risospendere SVF pellet di cellule in 2 ml di tampone FACS.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere SVF pellet cellulare in ≥ 400 microlitri di buffer FACS.
- Trasferire campioni da 12 x 75 mm in polistirolo tubi fondo sferico dotato di un 35 top tube colino cellula micron.
- Proteggere dalla luce e conservare i campioni a 4 ° C fino al momento dell'analisi FACS.
Nota: Per risultati ottimali cellule devono essere analizzati immeadiately, tuttavia, l'analisi FACS con questo protocollo è stato condotto con successo su cellule marcate memorizzati nel tampone FACS per 1-2 ore a 4 ° C. Se le cellule devono essere fissati per aumentare il tempo di conservazione, cellule marcate possono essere fissate con paraformaldeide al 2% a 4 ° C per 24 ore prima dell'analisi FACS. Aziende anticorpi suggeriscono che le cellule marcate possono essere conservati fino a una settimana, ma questo non è stato testato nel contesto di questa procedura.
5. FACS analisi
- Prima di analisi FACS, aggiungere colorante vitalità di campioni e controlli adeguati per consentire la discriminazione delle cellule vive / morte.
Nota: Numerose coloranti vitalità sono commercialmente disponibili, ma DAPI e PI sono raccomandati seconda della eccitazione / emissione profiles degli anticorpi fluoroforo-coniugati utilizzati. DAPI e propidio ioduro vengono aggiunti a ciascun campione ad una concentrazione finale di 0,2 mg / ml.
- Utilizzare un campione di controllo negativo senza macchia, preferibilmente cellule isolate dal tessuto stesso, come i campioni sperimentali, per regolare side scatter (SSC) e forward scatter (FSC) in modo che la popolazione cellulare (s) di interesse sono in scala.
Nota: Per l'analisi delle cellule AT SVF, si consiglia di SSC viene visualizzato in una scala logaritmica contro FSC in una scala lineare. L'uso di una scala logaritmica per SSC è particolarmente importante quando si analizzano ATM, che sono spesso molto grandi e granulare.
- Disegnare un cancello diffusione luminosa iniziale in base al tipo di cellula (s) da analizzare, e regolare il tubo fotomoltiplicatore (PMT) guadagno in modo che le cellule non colorate sono all'estrema sinistra di un istogramma solo parametro (approssimativamente centrato su 10 2) per i canali appropriati. </ Li>
Nota: Si raccomanda di linfociti e macrofagi (o altre cellule mieloidi) essere analizzati separatamente a causa di differenze di autofluorescenza.
- Utilizzare singoli controlli macchiati o anticorpo di cattura sfere di compensazione per eseguire la compensazione multi-colore.
Nota: Si consiglia l'uso di sfere di compensazione, tuttavia, la compatibilità di ogni anticorpo deve essere garantita. Ad esempio, sfere di compensazione potrebbero non cross-reagiscono con anticorpi di coniglio, nel qual caso le cellule isolate sono tenuti ad ottenere un adeguato controllo singolo macchia.
- Impostare cancelli sperimentali basati sui controlli modificati FMO.
- Impostare il citometro di flusso per raccogliere il numero appropriato di eventi basati sulla prevalenza della popolazione di interesse e registrare i dati sperimentali.
- Esportare i file FCS di dati per l'analisi offline. Ci sono numerosi programmi disponibili per il flusso cytometrl'analisi dei dati y. Si consiglia Cytobank, una piattaforma web-based che permette investigatores per memorizzare e analizzare i dati e generare dati da qualsiasi computer con accesso a internet 18. Inoltre, Cytobank offre la possibilità di rendere pubblici i dati accessibili o limitare l'accesso a collaboratori.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Collagenasi digestione di AT seguito da centrifugazione differenziale è stato utilizzato per isolare il SVF da cuscinetti di grasso dell'epididimo di topi maschi C57BL/6J alimentato un basso contenuto di grassi (10% kcal dai grassi) o ad alto contenuto di grassi (60% kcal dai grassi) dieta (LFD e HFD , rispettivamente) per 16 settimane. Cellule del SVF furono poi etichettati con anticorpi primari fluoroforo-coniugato a quantificare la percentuale di vitale ATM (Figura 1) e AT cellule T (figura 2) tramite analisi FACS. Gating iniziale, compresa la dispersione della luce, la discriminazione farsetto, e cancelli vitalità sono rappresentati nelle Figure 1A e 2A. Va sottolineato che la luce cancello dispersione iniziale nella Figura 2A è limitata alla popolazione linfocitaria per evitare comprese cellule mieloidi autofluorescenti. Un esempio di utilizzo modificato FMO controlli per impostare porte sperimentali è raffigurato in Figura 1B. In questo esempio, il F4/80 (colonna di sinistra) e gli anticorpi CD11b (colonna di destra) vengono sostituiti con adeguati controlli isotipo per tenere conto di rilegatura autofluorescenza e non specifici. Cancelli Quadrant allora sono disegnati per identificare praticabile sportelli automatici (F4/80 + CD11b +). Gating per CD4 + e CD8 + AT cellule T è mostrato in figura 2B. Praticabile AT linfociti sono prima gated per TCRβ (colonna di sinistra). Successivamente, le cellule TCRβ + AT T sono gated per CD4 e CD8 (colonna di destra).
Figura 1. Macrofagi tessuto adiposo. L'SVF è stato isolato dal dell'epididimo AT di topi maschi C57BL/6J alimentati con una dieta a basso contenuto di grassi e alto contenuto di grassi per 16 settimane utilizzando il protocollo collagenasi digest. Successivamenteguenza, le cellule sono state colorate per SVF F4/80 e CD11b e analisi FACS è stata eseguita utilizzando un citofluorimetro per identificare gli sportelli automatici. (A) la dispersione della luce iniziale e cancelli vitalità. (B) Modificata FMO controlla incorporando anticorpi isotipo per F4/80 e CD11b sono stati usati per allineare quadrante cancelli. (C) Confronto tra la percentuale di F4/80 + CD11b + bancomat dalle AT di grassi topi basso contenuto di grassi e ad alto nutriti. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. T cellule del tessuto adiposo. L'SVF è stato isolato dal tessuto adiposo dell'epididimo di topi maschi C57BL/6J alimentati con una bassa percentuale di grassi o ad alto contenuto di grassi dieta per 16 settimane con tegli collagenasi protocollo digest. Successivamente, le cellule sono state colorate per SVF TCRβ, CD4, e CD8a e analisi FACS è stata eseguita usando un citometro a flusso per caratterizzare AT cellule T. (A) la dispersione della luce iniziale e cancelli vitalità. (BC) Confronto tra la percentuale di TCRβ + cellule T (colonna di sinistra) e di CD4 + e CD8 + cellule T (colonna di destra) dalla AT di (B) a basso contenuto di grassi e (C) alta topi nutriti con grassi. Clicca qui per ingrandire la figura .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Crescente interesse per il ruolo del sistema immunitario nelle conseguenze metaboliche dell'obesità ha portato all'uso diffuso di citometria a flusso per caratterizzare cellule immunitarie del AT. Anche se il protocollo esatto varierà tra laboratori sulla base della loro esperienza e le attrezzature disponibili, i passaggi critici includono collagenasi digestione, centrifugazione differenziale, e la cellula antigene di superficie di etichettatura. Lo scopo del presente articolo è di fornire un protocollo dettagliato e guida pratica per l'isolamento del AT SVF di investigatori con poca esperienza di lavoro con AT e / o l'esecuzione di citometria a flusso.
Come con qualsiasi tecnica sperimentale, ci sono numerose varianti che possono o non possono avere un impatto significativo il risultato desiderato. Sulla base della nostra esperienza, il protocollo qui dettagliata rappresenta il compromesso più efficace tra il tempo, le risorse, la resa cellulare e la vitalità cellulare. Per esempio, abbiamo scoperto che aumentando ildurata della collagenasi II digestione a ben 60 min a concentrazioni simili di collagenasi ha un impatto trascurabile sul rendimento cellulare; quindi, utilizziamo una digestione 20 min in modo da ridurre la durata dell'esposizione collagenasi. Collagenasi II è la collagenasi più comunemente usato per digestioni tessuto adiposo. Una descrizione di tutte le diverse collagenasi ed i loro usi primari può essere trovato sul sito di Sigma. Le rese cellulari dal protocollo di cui sopra sono 2-3 x 10 6 e 4-5 x 10 6 cellule / G a partire da topi alimentati con una bassa percentuale di grassi (10% kcal dai grassi) e di grassi (60% kcal dai grassi) per la dieta di 16 settimane, rispettivamente. Oltre a collagenasi digerire tempi diversi, ci sono una serie di potenziali modifiche al protocollo corrente a seconda del modello sperimentale utilizzato, compreso il trattamento dietetico. In primo luogo, quando la raccolta AT da topi alimentati con una dieta arricchita di acidi grassi saturi o colesterolo, evitare di tenere i campioni sul ghiaccio prima della macinazione, perché la AT si solidificano e fare macinazione difficile. Secondo, il nostro protocollo include una fase di lisi degli eritrociti (3.6); tuttavia, una perfusione iniziale successo spesso rende inutile questo passaggio. Terzo, bisogna fare attenzione a non aggiungere più di 10 mM CaCl 2 per la soluzione di analisi collagenasi (5 mM concentrazione finale); maggiori concentrazioni di calcio può provocare la formazione di un precipitato di fosfato di calcio. Se questo precipitato si forma a seguito della fase di centrifugazione iniziale (3.5), aggiungere due fasi di lavaggio con 20 ml di tampone FACS (contenente EDTA) prima della fase di lisi degli eritrociti per rimuovere il precipitato. In quarto luogo, si raccomanda che gli investigatori utilizzano almeno un intero cuscinetto adiposo perigonadal quando isolando il SVF. Noi facciamo questa raccomandazione non a causa di limitazioni nella resa cellulare, ma perché varie popolazioni cellulari visualizziamo diverse distribuzioni regionali 19. Così, i risultati possono essere influenzati quando solo una porzione del cuscinetto adiposo perigonadal è used isolare le cellule immunitarie che risiedono nel AT. Se l'intero cuscinetto di grasso è maggiore di 1,2 grammi, dividere il tessuto adiposo longitudinalmente dal rostrale estremità caudale. Se diviso a metà questo modo, ogni metà dovrebbe fornire una popolazione di cellule rappresentante e deve generalmente essere inferiore a 1,2 grammi. Tuttavia, nel caso che questo è ancora più di 1,2 grammi, si consiglia di eseguire digestioni collagenasi di 1.2 grammi segmenti in tubi separati, e combinando tutte le celle SVF per la citometria di flusso. Inoltre, per i topi magri, può essere necessario combinare cuscinetti adiposi da 2 o 3 topi per ottenere cellule SVF sufficienti per l'analisi citofluorimetrica. La necessità di topi aggiuntivi deve essere contabilizzata nella progettazione di esperimenti. Infine, un altro modo per visualizzare i dati è il numero di cellule per grammo di tessuto. Se si desidera la densità cellulare, la AT dovrebbero essere pesati prima della macinazione e la digestione.
Per quanto riguarda la caratterizzazione AT cellule SVF tramite citometria a flusso, duepunti devono essere enfatizzati. In primo luogo, tutti gli anticorpi primari fluoroforo-coniugati devono essere convalidati per l'utilizzo con AT cellule SVF e adeguatamente titolati. Sebbene abbiamo dimostrato la compensazione con perline, precedentemente avevamo titolato questi anticorpi con AT SVF. Quando caratterizzare i macrofagi, noi sconsigliamo l'uso di coloranti tandem (ad esempio PE-Cy7), come abbiamo avuto risultati contrastanti rispetto al legame non specifico degli sportelli automatici utilizzando anticorpi coniugati a questi coloranti. Inoltre, fluorofori come PE e FITC devono essere utilizzati solo dopo un'attenta titolazione come descritto sopra. Una lista di anticorpi specifici che comunemente usata per caratterizzare cellule AT SVF con concentrazioni raccomandate possono essere trovato nel previsto nella tabella 1. In secondo luogo, perché gli sportelli automatici mostra forte autofluorescenza e un certo numero di anticorpi mostrano un basso livello di legame non specifico quando viene utilizzato ad una concentrazione elevata, si consiglia l'uso di modifica FMO controlli per impostare porte sperimentali.Controlli FMO sono generati colorando un insieme di campioni di controllo con tutti ma uno degli anticorpi utilizzati per etichettare campioni sperimentali 20. Abbiamo modificato i controlli FMO nel nostro protocollo di sostituire uno degli anticorpi con un controllo isotipo fluoroforo-coniugato appropriato piuttosto che semplicemente la rimozione. In pratica, può essere accettabile per rinunciare controlli FMO per gli anticorpi che forniscono un'eccezionale separazione tra le popolazioni positive e negative. Oltre a questi controlli, si nota che prima di gating sugli anticorpi, abbiamo preselezione per linfociti e macrofagi popolazioni sulla base di scatter in avanti e laterale. Ciò elimina la rilevazione di macrofagi autofluorescenti nell'analisi popolazioni linfocitarie con fluorofori quali FITC e tandem coloranti.
Anche se i protocolli dettagliati sono oltre la portata di questo articolo, la tecnica di isolamento di cui serve come un primo passo importante per numerose tecniche finalizzate a carattereterizing cellule immunitarie che risiedono nel AT. Per esempio, l'isolamento sopra e protocollo di colorazione possono essere utilizzati per facilitare smistamento di specifiche popolazioni da cui mRNA può essere isolato per analizzare l'espressione genica. Inoltre, semplici modifiche al protocollo può essere fatto per permettere trattamento ex vivo delle ATM. Tali modifiche includerebbero utilizzando tecniche sterili avere la SVF, che sarebbe poi lavato due volte e risospese in un appropriato terreno di coltura cellulare. Piuttosto che l'aggiunta di anticorpi fluoroforo-coniugato a macchia antigeni di superficie cellulare, la SVF può essere aggiunto a piastre di coltura di tessuti non trattati per arricchire per bancomat tramite l'adesione di plastica (anche se questo non può essere affermato di essere una popolazione pura come fibroblasti e preadipocytes anche in grado di aderire ). Questo si ottiene coltivando la SVF per 2-4 ore a 37 ° C, seguita da due passaggi di lavaggio per rimuovere le cellule non aderenti. ATM può quindi essere trattato di conseguenza e di raccolta con una dissociazione delle cellule EDTA-based in modoluzione citometria di flusso o lisate in tampone RIPA Trizol o per l'isolamento di RNA o proteina, rispettivamente. Qualunque sia l'applicazione a valle, la tecnica digest collagenasi per isolamento adipociti e cellule SVF prima descritti da Rodbell nel 1964 1 continua ad essere uno strumento prezioso per la caratterizzazione di AT cellule del sistema immunitario e il loro contributo alle conseguenze metaboliche dell'obesità.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
OCS è supportato da un NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), AK è sostenuto da una borsa di studio post-dottorato dalla American Diabetes Association (7-10-MI-05), e AHH è supportato da un American Heart Association Investigator Award Fondata (12EIA8270000). Esperimenti di citometria a flusso sono stati eseguiti nel VMC Citometria a Flusso risorsa condivisa. Il VMC Citometria a Flusso risorsa condivisa è supportata dalla Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| collagenase | Sigma | C6885-5G | |
| propidium iodide solution | Sigma | P4864-10 ml | |
| stable stack 20 microliter | Rainin | SS-L10 | |
| 20 microliter filter tips | Rainin | SRL10F | |
| stable stack 250 microliter tips | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 microliter tips | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 microliter filter tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 microliter Filter Tips | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn strainers | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| medium weigh dish | Fisherbrand | 02-202B | |
| aluminum foil | Fisherbrand | 1213100 | |
| mincing scissors | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 14-959-49A | |
| filter top FACS tubes | BD Falcon | 352235 | |
| 10 ml pipette case 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 5 ml syringe | BD Falcon | 309646 | |
| V Bottom Plates | Costar | 07-200-107 | |
| transfer bulb pipette | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Adhesive mat | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Cell Culture Centrifuge | Sorvall | 75253839 | |
| Adapters | Sorvall | 75003723 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells |
| Rat anti-mouse F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321 |
| Rat anti-mouse CD11b | eBioscience | 11-0112 | Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031 |
| Armenian Hamster anti-mouse CD11c | eBioscience | 12-0114 | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88 |
| Goat anti-mouse MGL1/2 | R&D Systems | FAB4297P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Goat anti-mouse CD206 | R&D Systems | FAB2535P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Rat anti-mouse CCR2 | R&D Systems | FAB5538P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P |
| Armenian Hamster anti-mouse TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956 |
| Rat anti-mouse CD8a | BD Biosciences | 552877 | Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784 |
| Rat anti-mouse CD4 | BD Biosciences | 557956 | Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963 |
Table 1. List of Materials and Reagents. |
|||
References
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
- Weisberg, S. P., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).
- Xu, H., et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).
- Mathis, D., Shoelson, S. E.
- Stefanovic-Racic, M., et al. Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver. Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).
- Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).
- Feuerer, M., et al. Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters. Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).
- Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).
- Winer, S., et al. Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy. Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).
- Wu, L., et al. Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. , 1143-1152 (2012).
- Wu, D., et al. Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis. Science. 332, 243-247 (2011).
- Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).
- Talukdar, S., et al. Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase. Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).
- Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).
- Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45, 194-205 (2001).
