Summary
الأنسجة الدهنية (AT) هو موقع على مكثفة تنشيط الخلايا المناعية والتفاعل. تقريبا جميع خلايا الجهاز المناعي موجودة في AT ويتم تغيير النسب من خلال السمنة. العزلة المناسبة، القياس الكمي، وتوصيف AT السكان الخلايا المناعية تعتبر بالغة الأهمية لفهم دورها في مرض immunometabolic.
Abstract
وقد أدى اكتشاف تسلل زيادة البلاعم في الأنسجة الدهنية (AT) من القوارض والبشر يعانون من السمنة المفرطة إلى تكثيف الاهتمام مساهمة الخلايا المناعية لمقاومة الانسولين وجهازية. العزلة والكمي لمختلف السكان الخلايا المناعية في العجاف والسمنة AT الآن تقنية تستخدم عادة في المختبرات immunometabolism، ويجب توخي الحذر الشديد حتى الآن سواء في انسجة الخلايا الوعائية والعزلة في تحليل التدفق الخلوي بحيث البيانات التي تم الحصول عليها هو موثوق بها والتأويل . في هذا الفيديو نحن لشرح كيفية اللحم المفروم، هضم، وعزل الخلايا المناعية التخصيب انسجة جزء الأوعية الدموية. وفي وقت لاحق، وتبين لنا كيفية الضامة تسمية الأجسام المضادة والخلايا الليمفاوية T وكيفية البوابة بشكل صحيح عليها في تجارب التدفق الخلوي. يتم توفير تدفق ممثل المؤامرات الخلوي من الدهون التي تغذيها الهزيل وارتفاع الدهون في الفئران السمينة التي تغذيها منخفضة. وثمة عنصر حاسم من هذا التحليل هو استخدام الأجسام المضادة التي تفعللا يتألق في القنوات حيث في الضامة هي autofluorescent بشكل طبيعي، فضلا عن استخدام ضوابط التعويض المناسب.
Introduction
تاريخيا، كان ينظر إلى الأنسجة الدهنية (AT) كجهاز تخزين خاملة من الدهون، والذي يوسع والعقود ردا على توازن الطاقة. ونحن نفهم الآن أن AT يمثل جهازا الغدد الصماء التي تفرز ديناميكية بنشاط عدد من الهرمونات التي تؤثر تأثيرا مباشرا سلوك التغذية والنظامية توازن الجلوكوز. وبالإضافة إلى ذلك، على مدى العقد الماضي كان هناك تقدير متزايد لسكان العديد من الخلايا المناعية المقيمين في AT جزء الأوعية الدموية اللحمية (صندوق التبرعات الخاص)، فضلا عن مساهمتها في AT التوازن.
القدرة على فصل AT خلية شحمية وصندوق التبرعات الخاص باستخدام هضم كولاجيناز تليها الطرد المركزي المغاير وقد وصفت لأول مرة في عام 1964 رودبيل 1. غالبا ما يتم استخدام كولاجيناز الثاني للفصل خلية شحمية وصندوق التبرعات الخاص بسبب الصيانة من مستقبلات الانسولين خلية شحمية 1. في وقت مبكر، وتجزيء الأنزيمية من AT كان يعمل في المقام الأول لدراسة الشحمcyte الأيض وعزل preadipocytes. وفي الآونة الأخيرة، وهذا الأسلوب، جنبا إلى جنب مع توافر نطاق واسع من أجهزة قياس التدفق الخلوي وعدد متزايد من المتاحة تجاريا الأجسام المضادة fluorophore مترافق، يسرت توصيف AT الخلايا المناعية.
على الرغم من وجود الخلايا المناعية في التهاب AT وقد وصفت سابقا 2، وأوراق المنوية بواسطة يسبيرج وآخرون. وشو وآخرون. نشرت في عام 2003 كانت أول لتوثيق تراكم AT الضامة (الصراف الآلي) في السمنة، والتي تفرز السيتوكينات الالتهابية وترتبط مع المقاومة AT-محددة والنظامية الأنسولين 3،4. خدم هذه الملاحظات كأساس لحقل جديد من التحقيقات التي صيغت مؤخرا، "immunometabolism،" 5 و تم متابعتها من قبل دراسات تورط مختلف السكان الخلايا المناعية، بما في ذلك الخلايا الجذعية 6، 7 الخلايا البدينة، الخلايا T 8 -10، خلايا B 11، خلايا NKT 12، 13 الحمضات، والعدلات 14،15 في تطوير البدانة ترتبط مقاومة الأنسولين.
الهدف من هذه المقالة هو أن تقدم وصفا مفصلا لتقنية هضم كولاجيناز تستخدم لعزل خلايا AT صندوق التبرعات الخاص لتوصيف وأجهزة الصراف الآلي وAT خلايا T عن طريق التدفق الخلوي. وقد تم تحسين هذا البروتوكول للماوس AT، ومع ذلك، يمكن أن تستفيد من المشاهدين قراءة مقال ممتاز تقديم تفاصيل مستفيضة حول الاستفادة المثلى من هذه التقنية للإنسان في 16. الجمهور المستهدف من هذه المادة يتضمن محققين من ذوي الخبرة المحدودة والعاملة مع الماوس AT وأداء التدفق الخلوي. وتعرض العديد من الاعتبارات العملية لتحقيق التوازن بين العائد الخلوية وقدرتها على البقاء مع الوقت والموارد، فضلا عن الضوابط المثلى التدفق الخلوي لوصف AT السكان الخلايا المناعية. بالإضافة إلى بروتوكول لدينا، والقراء هي referrإد إلى المادة إن الرب مؤخرا من قبل باسو وآخرون. لمناقشة ممتازة لبعض الجوانب الفنية من التدفق الخلوي لتشمل الضوابط المناسبة والتعويضات 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الكواشف واللوازم
قبل الشروع في هذا البروتوكول التجريبي، وإعداد الكواشف التالية:
- 70٪ من الإيثانول
- 1X PBS
- 1X DPBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) تستكمل مع 0.5٪ BSA
- FACS العازلة: 1X DPBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم)، 2 مم EDTA، و 1٪ FCS
- العازلة ACK: 150 ملي NH 4 الكلورين، 10 ملي KHCO 3، و 0.1 ملي نا 2 EDTA في الماء
2. الحصاد وإعداد الأنسجة الدهنية
- الموت ببطء الفئران وفقا للإجراءات التي وافق عليها IACUC الخاصة بكل مؤسسة.
- تبلل تماما الفراء مع الايثانول 70٪.
- إجراء شق على مستوى عملية الخنجري (الجزء السفلي من عظمة القص) وفتح التجويف الصدري لفضح القلب، مع الحرص على عدم قطع أي الأوعية الدموية الرئيسية.
ملاحظة: عند هذه النقطة، بل هو أيضا مفيدة لترك الحجاب الحاجز سليمة بقدر ممكن وخفض خدش للخروج من الجانب الأيمن من القفص الصدري للسماح الدم وسائل الإرواء في التدفق من التجويف الصدري.
- مقطع الأذين الأيمن للسماح الدم وسائل الإرواء للهروب من نظام الدورة الدموية.
ملاحظة: عندما يكون التعامل مع الفئران السمينة، التامور الزائدة AT قد تحتاج إلى إزالة للسماح بالوصول إلى القلب.
- فهم القلب مع ملقط وإدراج بلطف إبرة في البطين الأيسر من خلال قمة. يروي ببطء الماوس مع 15 مل العقيمة PBS.
ملاحظة: تخفيض معدل نضح إذا بدأت الرئتين لملء والتوسع.
- فتح التجويف البريتوني وإزالة منصات الدهون perigonadal باستخدام الحرص على تجنب أي أنسجة الغدد التناسلية.
- وضع منصات الدهون في وزن قارب على الجليد تحتوي على 2 مل 1X DPBS (بدون المغنيسيوم أو الكالسيوم) تستكمل مع 0.5٪ BSA، واللحم المفروم في الدقيقة القطع الجميلة.
الحمار = "jove_content"> ملاحظة: الحد من كمية AT لكل وزن القارب إلى 1.2 غرام. اذا كان المبلغ من AT يتجاوز 1.2 غرام، تقسيمها بالتساوي بين اثنين من وزن القوارب.
- الحفاظ على عينات من على الجليد وإعداد 3 مل كولاجيناز حل هضم في AT عينة تتكون من 1X DPBS تستكمل مع 0.5٪ BSA، 10 مم CaCl 2، و 4 ملغ / مل كولاجيناز، من النوع الثاني.
3. الهضم كولاجيناز
- نقل AT إلى 50 مل أنابيب مخروطية بواسطة صب جناسة والشطف وزن القارب مع DPBS 1 مل (0.5٪ BSA) و 3 مل كولاجيناز الثاني حل هضم.
- احتضان عند جناسة في شاكر التناوب (200 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- إضافة 10 مل DPBS (0.5٪ BSA) إلى أنابيب مخروطية ومكان على الجليد.
- يسحن جناسة مرات عديدة باستخدام 10 مل ماصة المصلية، وتمرير الايقاف الخلية من خلال 100 ميكرون مرشح في لأنبوب جديد 50 مل المخروطية.
- أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية في 500 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 والتطويرعلى سبيل المثال؛ C.
- صب طاف و resuspend SVF الخلية بيليه في 3 مل العازلة ACK إلى ليز تلويث الكريات الحمراء.
- إضافة 12 مل FACS العازلة وتعليق خلية الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- صب طاف و resuspend SVF بيليه الخلية في نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة.
ملاحظة: استخدام حجم الخلية بيليه كدليل لمدى FACS العازلة ل resuspend فيه. إذا كان يغطي الخلية بيليه الجزء السفلي من مل المخروطية أنبوب 50، استخدم 0.5-1 مل FACS العازلة، وإلا، في resuspend 0.25-0.5 مل.
- مكان العينات على الجليد وإعداد مأخوذة تخفيف 01:10 من كل عينة لفرز الخلايا عن طريق خلط 40 ميكرولتر العازلة FACS، 50 ميكرولتر حل الأزرق التريبان (0.2٪)، و 10 ميكرولتر التعليق الخلية.
- عد خلايا قابلة للحياة على أساس التريبان الأزرق الإقصاء وتمييع تعليق خلية إلى تركيز النهائي من 5-10 × 10 6 خلية / مل.
4. تلطيخ المضادات سطح الخلية
ملاحظة: وكمثال على ذلك، عندما سوف قياس نسبة من أجهزة الصراف الآلي على أساس F4/80 وCD11b، التعويضات التالية والضوابط FMO ابد أن نكون مستعدين:
- غير ملوثين (خلايا)
- دابي أو يوديد propidium (PI) وصمة عار واحد (الخلايا؛ لا تضيف صبغة جدوى حتى الخطوة 5.1)
- F4/80 APC (خلايا أو الخرز التعويض) واحد وصمة عار
- CD11b FITC الخلايا أو واحد وصمة عار (حبات التعويض)
- FMO 1 (خلايا): الجرذ IgG2a κ نمط إسوي السيطرة APC + CD11b FITC + صبغ الجدوى (المضافة في الخطوة 5.1)
- FMO 2 (خلايا): F4/80 APC + الجرذ و IgG2b κ نمط إسوي السيطرة FITC + صبغ الجدوى (المضافة في الخطوة 5.1)
- إضافة الأجسام المضادة الأولية fluorophore مترافق و / أو ضوابط نمط إسوي في التركيز المناسب (انظر الجدول من الكواشف والمواد).
- حماية العينات من الضوء واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إضافة 2 مل FACS العازلة وتعليق خلية الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- صب طاف و resuspend SVF الخلية بيليه في 2 مل FACS العازلة.
- أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، و resuspend بيليه خلية في صندوق التبرعات الخاص ≥ 400 FACS ميكرولتر العازلة.
- نقل العينات إلى 12 × 75 مم البوليسترين أنابيب أسفل جولة مجهزة 35 ميكرومتر الخلية مصفاة قمم أنبوب.
- يحفظ بعيدا عن الضوء، وعينات تخزينها في 4 درجات مئوية حتى تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية.
ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ينبغي تحليل الخلايا immeadiately، ومع ذلك، تم إجراء تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية مع هذا البروتوكول بنجاح على الخلايا المسمى المخزنة في نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة لمدة 1-2 ساعة عند 4 درجات مئوية. إذا كان بحاجة إلى الخلايا لتكون ثابتة لزيادة وقت التخزين، ويمكن أن تكون ثابتة الخلايا المسمى مع بارافورمالدهيد 2٪ في 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة قبل التحليل FACS. الشركات الأجسام المضادة تشير إلى أن الخلايا المسمى يمكن تخزينها لمدة تصل إلى أسبوع واحد، ولكن هذا لم يتم اختباره في سياق هذا الإجراء.
5. تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية
- قبل تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية، إضافة إلى عينات صبغ الجدوى والضوابط المناسبة للسماح لايف / الميت تمييز الخلية.
ملاحظة: تتوفر تجاريا العديد من الأصباغ جدوى، ولكن ينصح دابي وPI اعتمادا على الإثارة / الانبعاثات الأستاذديزيل من الأجسام المضادة، مترافق fluorophore المستخدمة. تضاف دابي ويوديد propidium إلى كل عينة في تركيز النهائي من 0.2 ملغ / مل.
- استخدام عينة السيطرة السلبية غير ملوثين، ويفضل خلايا معزولة من نفس الأنسجة والعينات التجريبية، لضبط الجانب مبعثر (SSC) ومبعثر إلى الأمام (FSC) بحيث يتسنى للسكان الخلية (ق) من الفائدة هي على نطاق واسع.
ملاحظة: بالنسبة لتحليل AT الخلايا صندوق التبرعات الخاص، فمن المستحسن أن SSC يتم عرضها في نطاق السجل مقابل FSC في مقياس خطي. استخدام نطاق وسجل لSSC أهمية خاصة عند تحليل أجهزة الصراف الآلي، والتي غالبا ما تكون كبيرة جدا ومحبب.
- رسم ضوء بوابة مبعثر الأولي يعتمد على نوع الخلية (الخلايا) التي يجري تحليلها، وضبط أنبوب مضخم (PMT) مكسب بحيث الخلايا غير ملوثين هي في أقصى اليسار من الرسم البياني-معلمة واحدة (تركز على ما يقرب من 10 2) للقنوات المناسبة. </ لى>
ملاحظة: من المستحسن أن الخلايا الليمفاوية والضامة (أو خلايا الدم النخاعي أخرى) يتم تحليلها بشكل منفصل بسبب وجود خلافات في تألق ذاتي.
- استخدام عناصر التحكم الملون واحد أو الضد التقاط حبات تعويضات لأداء التعويض متعددة الألوان.
ملاحظة: من المستحسن استخدام الخرز التعويض، ولكن لا بد من ضمان التوافق من كل الأجسام المضادة. على سبيل المثال، والخرز التعويض قد لا عبر تتفاعل مع الأجسام المضادة أرنب، وفي هذه الحالة يطلب من خلايا منعزلة للحصول على سيطرة وصمة عار واحد المناسبة.
- تعيين غيتس التجريبي القائم على ضوابط FMO معدلة.
- ضبط تدفق عداد الكريات لجمع العدد المناسب من الأحداث على أساس انتشار السكان من الاهتمام وتسجيل البيانات التجريبية.
- تصدير ملفات البيانات FCS للتحليل غير متصل. وهناك العديد من البرامج المتاحة لتدفق cytometrتحليل البيانات ذ. نوصي Cytobank، منصة على شبكة الإنترنت التي تسمح investigatores لتخزين وتحليل البيانات وتوليد الأرقام من أي جهاز كمبيوتر مع الوصول إلى الإنترنت 18. بالإضافة إلى ذلك، Cytobank يوفر القدرة على جعل الوصول إليها الجمهور البيانات أو تقييد الوصول إلى المتعاونين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد استخدم الهضم كولاجيناز من AT تليها الطرد المركزي المغاير لعزل صندوق التبرعات الخاص من منصات الدهون بربخي من الفئران C57BL/6J ذكر تغذية قليلة الدهون (10٪ سعر حراري من الدهون)، أو ارتفاع الدهون (60٪ سعر حراري من الدهون) النظام الغذائي (LFD وHFD ، على التوالي) لمدة 16 أسبوعا. ثم تم تسمية الخلايا من صندوق التبرعات الخاص مع الأجسام المضادة الأولية fluorophore مترافق لقياس نسبة من أجهزة الصراف الآلي قابلة للحياة (الشكل 1)، وعلى خلايا T (الشكل 2) عن طريق تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. وصفت النابضة الأولية، بما في ذلك مبعثر ضوء والتمييز صدرة، وبوابات الجدوى في أرقام 1A 2A و. وينبغي التأكيد على أن بوابة مبعثر ضوء الأولي في الشكل 2A يقتصر على السكان لمفاوية من أجل تجنب بما في ذلك خلايا الدم النخاعي autofluorescent. مثال باستخدام معدلة FMO ضوابط لتعيين غيتس التجريبية وصفت في الشكل 1B. في هذا المثال، F4/80 (يتم استبدال العمود الأيسر) وCD11b (العمود الأيمن) الأجسام المضادة مع الضوابط المناسبة لنمط إسوي حساب للربط تألق ذاتي وغير محددة. ثم يتم رسمها بوابات رباعي لتحديد مجدية أجهزة الصراف الآلي (F4/80 + CD11b +). ويرد النابضة لCD4 + و CD8 + T AT الخلايا في الشكل 2B. قابلا للتطبيق في الخلايا الليمفاوية هي بوابات الأول لTCRβ (العمود الأيسر). وفي وقت لاحق، والخلايا TCRβ + AT T هي بوابات للCD4 و CD8 (العمود الأيمن).
الشكل 1. الضامة الأنسجة الدهنية. تم عزل صندوق التبرعات الخاص من بربخي AT من الفئران C57BL/6J ذكر يتغذى من الدهون أو عالية نظام غذائي منخفض الدهون لمدة 16 أسبوعا باستخدام بروتوكول هضم كولاجيناز. الالحقةquently، كانت ملطخة الخلايا صندوق التبرعات الخاص لF4/80 وCD11b وأجري تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام تدفق عداد الكريات لتحديد جهاز صراف آلي. (A) مبعثر ضوء الأولية وبوابات جدوى. (B) تسيطر معدلة FMO دمج الأجسام المضادة نمط إسوي لF4/80 وCD11b كانت تستخدم لمحاذاة رباعي بوابات. (C) مقارنة بين نسبة F4/80 + + CD11b أجهزة الصراف الآلي من AT من الاسعار المنخفضة الدهون وعالية الفئران التي غذيت الدهون. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 2. خلايا T الأنسجة الدهنية. تم عزل صندوق التبرعات الخاص من الأنسجة الدهنية بربخي من الفئران C57BL/6J ذكر تغذية قليل الدسم أو حمية عالية الدهون لمدة 16 أسبوعا باستخدام Tانه كولاجيناز هضم البروتوكول. وفي وقت لاحق، وكانت ملطخة الخلايا صندوق التبرعات الخاص لTCRβ، CD4، وأجريت CD8a وتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام تدفق عداد الكريات لتوصيف AT خلايا T. (A) مبعثر ضوء الأولية وبوابات جدوى. (BC) مقارنة بين نسبة TCRβ + الخلايا التائية (العمود الأيسر) وCD4 + و CD8 + الخلايا التائية (العمود الأيمن) من AT من (B) قليل الدسم و (C) الفئران عالية تغذية الدهون. اضغط هنا لل عرض أكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أدى الاهتمام المتزايد في دور الجهاز المناعي في العواقب الأيضية من السمنة إلى الاستخدام الواسع النطاق للالتدفق الخلوي لتحديد خصائص الخلايا المناعية من AT. على الرغم من أن بروتوكول الدقيقة تختلف بين المختبرات على أساس الخبرة الخاصة بهم والمعدات المتاحة، وتشمل الخطوات الحاسمة الهضم كولاجيناز، الطرد المركزي التفاضلي، وسطح الخلية وضع العلامات مستضد. الهدف من هذه المادة هو توفير بروتوكول مفصلة ودليل عملي للعزلة AT صندوق التبرعات الخاص للمحققين لديهم خبرة محدودة تعمل مع AT و / أو أداء التدفق الخلوي.
كما هو الحال مع أي تقنية تجريبية، وهناك العديد من الاختلافات التي قد أو قد لا تؤثر بشكل كبير على النتيجة المرجوة. بناء على خبرتنا، مفصلة البروتوكول هنا يمثل المقايضة الأكثر كفاءة بين الوقت والموارد والعائد الخلوية، وبقاء الخلية. على سبيل المثال، وجدنا أن زيادةمدة كولاجيناز الثاني الهضم إلى ما يصل إلى 60 دقيقة في تركيزات مماثلة من كولاجيناز له تأثير يذكر على العائد الخلوية، وبالتالي، علينا الاستفادة من 20 دقيقة الهضم من أجل الحد من طول التعرض كولاجيناز. كولاجيناز الثاني هو كولاجيناز الأكثر استخداما للالهضم الأنسجة الدهنية. وصف كل من collagenases مختلفة واستخداماتها الأساسية ويمكن الاطلاع على موقع سيغما. غلة الخلوية نموذجية من البروتوكول أعلاه هي 2-3 × 10 6 و 4-5 × 10 6 خلية / غرام عند من الفئران تغذت على ومنخفض الدهون (10٪ سعر حراري من الدهون) وارتفاع الدهون (60٪ سعر حراري من الدهون) نظام غذائي لل 16 أسابيع، على التوالي. وبالإضافة إلى ذلك بدرجات كولاجيناز الأوقات دايجست، وهناك عدد من التعديلات المحتملة في البروتوكول الحالي اعتمادا على النموذج التجريبي المستخدمة، بما في ذلك العلاج الغذائية. الأولى، عندما حصاد AT من الفئران تغذت على وجبات المخصب لالأحماض الدهنية المشبعة أو الكوليسترول، وتجنب حفظ العينات على الجليد قبل تنميق لأن AT سوف يصلب وجعل من الصعب تنميق. ثانيا، يتضمن بروتوكول لدينا خطوة تحلل كرات الدم الحمراء (3.6)، ومع ذلك، ونضح الأولي الناجحة كثيرا ما يجعل هذه الخطوة غير ضرورية. يجب أن تؤخذ ثالث، الحرص على عدم إضافة أكثر من 10 مم CaCl 2 إلى حل هضم كولاجيناز (5 ملي تركيز النهائي)؛ قد ينتج تركيزات أكبر الكالسيوم في تشكيل راسب فوسفات الكالسيوم. إذا يشكل هذا الراسب بعد الخطوة الطرد المركزي الأولي (3.5)، إضافة إلى اثنين من غسل الخطوات مع 20 مل FACS العازلة (التي تحتوي على EDTA) قبل الخطوة تحلل كرات الدم الحمراء لإزالة راسب. الرابعة، من المستحسن أن المحققين استخدام وسادة كامل واحد على الأقل الدهون perigonadal عندما عزل صندوق التبرعات الخاص. يمكننا أن نجعل هذه التوصية ليس بسبب قيود في العائد الخلوية، ولكن لمختلف السكان الخلية عرض توزيعات إقليمية مختلفة 19. وبالتالي، قد يكون متحيزا النتائج عند سوى جزء من لوحة الدهون perigonadal هو لناإد لعزل الخلايا المناعية المقيمين في AT. إذا لوحة الدهون بأكمله أكبر من 1.2 غرام، تقسيم الأنسجة الدهنية طوليا من منقاري لغايات الذيلية. إذا قسمت إلى نصفين بهذه الطريقة، يجب على كل نصف السكان توفير ممثل من الخلايا ويجب أن تكون عموما أقل من 1.2 غرام. ومع ذلك، في حالة أن هذا لا يزال أكثر من 1.2 غرام، نوصي أداء الهضم كولاجيناز من 1.2 غرام في قطاعات أنابيب منفصلة، ومن ثم الجمع بين كافة الخلايا صندوق التبرعات الخاص للالتدفق الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، بالنسبة للفئران الخالية من الدهون، قد يكون من الضروري الجمع بين منصات الدهون من 2 أو 3 الفئران للحصول على ما يكفي من خلايا صندوق التبرعات الخاص لتحليل تدفق cytometric. ينبغي أخذها في الاعتبار الحاجة إلى الفئران إضافية لعند تصميم التجارب. وأخيرا، هناك طريقة أخرى لعرض البيانات هو عدد الخلايا في كل غرام من الأنسجة. إذا كان المطلوب كثافة الخلية، وAT يجب أن يكون وزنه قبل تنميق والهضم.
في ما يخص توصيف AT الخلايا صندوق التبرعات الخاص عن طريق التدفق الخلوي، واثنينوينبغي التأكيد على نقطة. أولا، ينبغي التحقق من صحة جميع الأجسام المضادة الأولية fluorophore مترافق للاستخدام مع AT الخلايا صندوق التبرعات الخاص ومعاير بشكل صحيح. على الرغم من أننا أظهرت التعويض مع الخرز، وكنا قد سبق معاير هذه الأجسام المضادة مع AT صندوق التبرعات الخاص. عندما تميز الضامة، ونحن نوصي بعدم استخدام الأصباغ جنبا إلى جنب (على سبيل المثال PE-Cy7)، كما كان لدينا نتائج متباينة فيما يتعلق غير محددة وملزمة من أجهزة الصراف الآلي عند استخدام الأجسام المضادة مترافق لهذه الأصباغ. وبالإضافة إلى ذلك، fluorophores مثل البولي ايثيلين وFITC يجب استخدامه فقط بعد المعايرة حذرا كما هو موضح أعلاه. قائمة الأجسام المضادة المحددة التي تستخدم عادة لوصف AT الخلايا صندوق التبرعات الخاص جنبا إلى جنب مع التركيزات الموصى بها ويمكن العثور عليها في المقدمة في الجدول 1. ثانيا، لأن أجهزة الصراف الآلي المعرض تألق ذاتي قوي وعدد من الأجسام المضادة عرض انخفاض مستوى غير محددة وملزمة عند استخدامها بتركيز عالية، ونحن نوصي باستخدام معدلة FMO ضوابط لتعيين غيتس التجريبية.يتم إنشاء ضوابط FMO بواسطة تلطيخ مجموعة من عينات السيطرة ولكن مع كل واحد من الأجسام المضادة المستخدمة لتسمية العينات التجريبية 20. لقد عدلت ضوابط FMO في بروتوكول لدينا ليحل محل واحد من الأجسام المضادة مع عنصر تحكم نمط إسوي fluorophore مترافق المناسبة بدلا من مجرد إزالته. في الممارسة العملية، فإنه قد يكون مقبولا إلى التخلي عن الضوابط FMO عن الأجسام المضادة التي توفر استثنائية الفصل بين السكان الإيجابية والسلبية. وبالإضافة إلى هذه الضوابط، سوف نلاحظ أنه قبل تبوب على الأجسام المضادة، ونحن تحديد مسبق لمفاوية والبلاعم السكان على أساس مبعثر إلى الأمام والجانب. هذا سيقضي على الكشف عن الضامة autofluorescent عند تحليل السكان اللمفاويات مع fluorophores مثل FITC والأصباغ جنبا إلى جنب.
على الرغم من بروتوكولات وإجراءات تفصيلية هي خارج نطاق هذه المقالة، تقنية عزل صفه بمثابة خطوة أولى مهمة لتقنيات عديدة ترمي إلى characterizing الخلايا المناعية المقيمين في AT. على سبيل المثال، عزل أعلاه وبروتوكول تلطيخ يمكن استخدامها لتسهيل الفرز من فئات معينة من السكان من الذي مرنا يمكن أن تكون معزولة لتحليل التعبير الجيني. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تعديلات بسيطة على بروتوكول للسماح العلاج فيفو السابقين من أجهزة الصراف الآلي. وتشمل هذه التعديلات باستخدام تقنيات العقيمة للحصول على صندوق التبرعات الخاص، التي من شأنها ثم يتم غسلها مرتين ومعلق في وسائل الإعلام ثقافة الخلية المناسبة. بدلا من إضافة الأجسام المضادة fluorophore مترافق إلى وصمة عار مستضدات سطح الخلية، يمكن إضافة صندوق التبرعات الخاص لغير المعالجة لوحات زراعة الأنسجة لإثراء لأجهزة الصراف الآلي عبر الالتزام البلاستيك (على الرغم من هذا لا يمكن الادعاء أن يكون السكان نقية كما الليفية وpreadipocytes يمكن أيضا الانضمام ). ويتم إنجاز ذلك عن طريق زراعة صندوق التبرعات الخاص لمدة 2-4 ساعة عند 37 درجة مئوية تليها اثنين غسل خطوات لإزالة الخلايا غير ملتصقة. ويمكن بعد ذلك أن يعامل وفقا لأجهزة الصراف الآلي وتحصد باستخدام تفارق الخلية المستندة إلى EDTA ذلكlution عن التدفق الخلوي أو هي lysed في Trizol أو RIPA العازلة لعزل الحمض النووي الريبي أو البروتين، على التوالي. بغض النظر عن التطبيق المصب، تواصل تقنية هضم كولاجيناز لعزل الخلايا الشحمية والخلايا SVF وصف لأول مرة من قبل رودبيل في عام 1964 1 أن تكون أداة لا تقدر بثمن لتوصيف AT الخلايا المناعية ومساهمتها في العواقب الأيضية من السمنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة JSO روث L. كيرشتاين NRSA (F32 DK091040)، معتمد من قبل AK زمالة ما بعد الدكتوراه من جمعية السكري الأمريكية (7-10-MI-05)، ومعتمد من قبل آه جمعية القلب الأمريكية تأسست جائزة الباحث (12EIA8270000). وقد أجريت تجارب التدفق الخلوي في التدفق الخلوي VMC مورد مشترك. يتم اعتماد التدفق الخلوي VMC مورد مشترك من قبل الجهاز الهضمي مركز بحوث أمراض فاندربيلت (DK058404).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| collagenase | Sigma | C6885-5G | |
| propidium iodide solution | Sigma | P4864-10 ml | |
| stable stack 20 microliter | Rainin | SS-L10 | |
| 20 microliter filter tips | Rainin | SRL10F | |
| stable stack 250 microliter tips | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 microliter tips | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 microliter filter tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 microliter Filter Tips | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn strainers | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| medium weigh dish | Fisherbrand | 02-202B | |
| aluminum foil | Fisherbrand | 1213100 | |
| mincing scissors | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 14-959-49A | |
| filter top FACS tubes | BD Falcon | 352235 | |
| 10 ml pipette case 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 5 ml syringe | BD Falcon | 309646 | |
| V Bottom Plates | Costar | 07-200-107 | |
| transfer bulb pipette | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Adhesive mat | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Cell Culture Centrifuge | Sorvall | 75253839 | |
| Adapters | Sorvall | 75003723 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells |
| Rat anti-mouse F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321 |
| Rat anti-mouse CD11b | eBioscience | 11-0112 | Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031 |
| Armenian Hamster anti-mouse CD11c | eBioscience | 12-0114 | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88 |
| Goat anti-mouse MGL1/2 | R&D Systems | FAB4297P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Goat anti-mouse CD206 | R&D Systems | FAB2535P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Rat anti-mouse CCR2 | R&D Systems | FAB5538P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P |
| Armenian Hamster anti-mouse TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956 |
| Rat anti-mouse CD8a | BD Biosciences | 552877 | Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784 |
| Rat anti-mouse CD4 | BD Biosciences | 557956 | Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963 |
Table 1. List of Materials and Reagents. |
|||
References
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
- Weisberg, S. P., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).
- Xu, H., et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).
- Mathis, D., Shoelson, S. E.
- Stefanovic-Racic, M., et al. Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver. Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).
- Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).
- Feuerer, M., et al. Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters. Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).
- Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).
- Winer, S., et al. Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy. Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).
- Wu, L., et al. Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. , 1143-1152 (2012).
- Wu, D., et al. Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis. Science. 332, 243-247 (2011).
- Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).
- Talukdar, S., et al. Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase. Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).
- Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).
- Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45, 194-205 (2001).
