Summary
Fettvävnad (AT) är en plats för intensiv aktivering av immunceller och interaktion. Nästan alla celler i immunsystemet finns i AT och deras förhållanden ändras vid fetma. Ordentlig isolering, kvantifiering och karakterisering av AT immunceller populationer är avgörande för att förstå sin roll i immunometabolic sjukdom.
Abstract
Upptäckten av ökad makrofaginfiltrering i fettvävnaden (AT) av överviktiga gnagare och människa har lett till en intensifiering av intresse för immunceller bidrag till lokal och systemisk insulinresistens. Isolering och kvantifiering av olika immunceller populationer i magra och feta AT är numera ett vanligt används tekniken i immunometabolism laboratorier, men extrem försiktighet måste vidtas både i stromal vaskulär cell isolering och i flödescytometrianalys så att de erhållna uppgifterna är tillförlitliga och tolkningsbara . I denna video visar vi hur du färs, smälta, och isolera immunceller-anrikade stromal vaskulära fraktionen. Därefter visar vi hur makrofager antikroppar etikett och T-lymfocyter och hur man korrekt port på dem i experiment flödescytometri. Representativa flödescytometri tomter från låga fett-matade magert och hög fett-matade feta möss tillhandahålls. Ett kritiskt element av denna analys är användningen av antikroppar som görinte fluorescerar i kanaler där AT makrofager är naturligt autofluorescent, liksom användningen av skälig ersättning kontroller.
Introduction
Historiskt har fettvävnad (AT) setts som en inert orgel av lipid lagring, som expanderar och dras ihop till följd energibalans. Vi förstår nu att AT representerar en dynamisk endocrineorgan som aktivt utsöndrar ett antal hormoner som direkt påverkar ätbeteende och systemisk glukoshomeostasen. Dessutom, under det senaste decenniet har det skett en ökad uppskattning för de många populationer av immunceller som bor i AT stromal vaskulära fraktion (SVF), liksom deras bidrag till AT homeostas.
Förmågan att separera AT adipocyten och SVF med ett kollagenas digest följt av differentialcentrifugering beskrevs först av Rodbell 1964 1. Kollagenas II används oftast för fettceller och SVF separation på grund av underhåll av fettceller insulinreceptorer 1. Tidigt, enzymatisk fraktionering av AT användes i första hand för att studera adipoCyte ämnesomsättning och för att isolera preadipocyter. På senare tid har denna teknik, i kombination med den allmänna tillgången till flödescytometrar och ständigt ökande antal kommersiellt tillgängliga fluoroforen-konjugerade antikroppar, underlättade karakterisering av AT immunceller.
Även förekomsten av immunceller i inflammerad på hade tidigare beskrivits 2, den sädes artiklar av Weisberg et al. och Xu et al. publicerades 2003 var de första att dokumentera ansamling av AT makrofager (bankomater) i fetma, som utsöndrar inflammatoriska cytokiner och korrelerar med AT-specifika och systemisk insulinresistens 3,4. Dessa observationer låg till grund för ett nytt fält av utredning nyligen myntade, "immunometabolism," 5 och har följts upp av studier som blandar olika immunceller populationer, inklusive dendritiska celler 6, mastceller 7, T-celler 8 -10, B-celler 11, NKT celler 12, eosinofiler 13 och neutrofiler 14,15 i utvecklingen av fetma associerad insulinresistens.
Målet med denna artikel är att ge en detaljerad beskrivning av kollagenas digest teknik som används för att isolera celler av AT SVF och för att karakterisera uttagsautomater och AT T-celler via flödescytometri. Detta protokoll har optimerats för mus, men kan tittarna nytta av att läsa en utmärkt artikel som ger omfattande detaljer om optimering av denna teknik för människa vid 16. Målgruppen för den här artikeln innehåller utredare med begränsad erfarenhet av att arbeta med musen och utföra flödescytometri. Flera praktiska överväganden för att balansera cellulär avkastning och lönsamhet med tid och resurser presenteras samt optimala flödescytometri kontroller för att karakterisera AT immunceller populationer. Förutom våra protokoll, läsarna är referred en nyligen JUPITER artikel av Basu et al. för en utmärkt diskussion om några av de tekniska aspekterna av flödescytometri att innehålla en ordentlig kontroll och ersättningar 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Reagens och tillbehör
Före initiering av denna experimentella protokoll, förbereda följande reagenser:
- 70% etanol
- 1X PBS
- 1X DPBS (utan Ca och Mg) kompletterat med 0,5% BSA
- FACS buffert: 1X DPBS (utan Ca och Mg), 2 mM EDTA, och 1% FCS
- ACK buffert: 150 mM NH4CI, 10 mM KHCO3 och 0,1 mM Na2EDTA i vatten
2. Skörd och beredning av fettvävnad
- Euthanize möss enligt IACUC-godkända förfaranden som är specifika för varje institution.
- Genomblött pälsen med 70% etanol.
- Gör ett snitt i nivå med xiphoid process (nedre delen av bröstbenet) och öppna brösthålan att exponera hjärtat, noga med att inte bryta några större blodkärl.
Anmärkning: Vid denna punkt, är det också användbart att lämna membranet intakt så mycket sommöjligt och för att skära en skåra ur den högra sidan av bröstkorgen att medge blod och perfusat att strömma ut från brösthålan.
- Kläm höger förmak att medge blod och perfusat fly cirkulationssystemet.
Obs: När man arbetar med överviktiga möss, överskott perikardiska AT kan behöva tas bort för att möjliggöra åtkomst till hjärtat.
- Ta tag i hjärtat med pincett och försiktigt in en nål i vänster kammare genom spetsen. Sakta BEGJUTA musen med 15 ml steril PBS.
Notera: Minska hastigheten för perfusionen om lungorna börjar fylla och expandera.
- Öppna bukhålan och ta bort perigonadal fettkuddarna med omsorg för att undvika gonadala vävnader.
- Placera Fettkuddarna i en väga båt på is innehållande 2 ml 1X DPBS (utan Mg eller Ca) kompletterat med 0,5% BSA, och finhacka AT i fina bitar.
Anm: Begränsa mängden AT per väger båten till 1,2 g. Om mängden AT överstiger 1,2 g, dela upp det jämnt mellan två väger båtar.
- Förvara vid prover på is och förbereda 3 ml kollagenas uppslutningslösningen per AT urval bestående av 1X DPBS kompletterat med 0,5% BSA, 10 mM CaCl2, och 4 mg / ml kollagenas, typ II.
Tre. Kollagenas Digestion
- Överlåtelsen till 50 ml koniska rör genom att hälla homogenatet och skölja väger båten med 1 ml DPBS (0,5% BSA) och 3 ml kollagenas II uppslutningslösningen.
- Inkubera vid homogenatet i en roterande skakapparat (200 rpm) vid 37 ° C i 20 minuter.
- Tillsätt 10 ml DPBS (0,5% BSA) till koniska rör och placera på is.
- Finfördela homogenatet flera gånger med en 10 ml serologisk pipett, och passera cellsuspensioner genom 100 nm filter i en ny 50 ml koniska rör.
- Centrifugera cellsuspension vid 500 xg under 10 minuter vid 4 & dt.ex.; C.
- Dekantera supernatanten och suspendera SVF cellpelleten i 3 ml ACK buffert att lysera förorenande erytrocyter.
- Tillsätt 12 ml FACS-buffert och centrifugera cellsuspensionen vid 500 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
- Dekantera supernatanten och suspendera SVF cellpelleten i FACS buffert.
Obs: Använd cellens storlek pelleten som en guide för hur mycket FACS buffert för att suspendera i. Om cellpelletten täcker botten på 50 ml koniska rör, använd 0,5-1 ml FACS buffert, annars återsuspendera i 0,25-0,5 ml.
- Placera proverna på is och förbereda 1:10 utspädning alikvoter av varje prov för cellräkning genom att blanda 40 | il FACS-buffert, 50 | il lösning av trypanblått (0,2%), och 10 | il cellsuspension.
- Räkna livskraftiga celler baserade på trypanblåttuteslutning och späd cellsuspensioner till en slutlig koncentration av 5-10 x 10 6 celler / ml.
4. Färgning av cellyteantigener
Obs: Som ett exempel, när kommer kvantifiera andelen uttagsautomater baserat på F4/80 och CD11b, följande ersättning och FMO kontroller måste förberedas:
- Obehandlat (celler)
- DAPI eller propidiumjodid (PI) enstaka fläck (celler, inte lägga livskraft färgämne förrän steg 5.1)
- F4/80 APC enstaka fläck (celler eller pärlor ersättning)
- CD11b FITC enstaka fläck (celler ellerersättning pärlor)
- FMO 1 (celler): Rat IgG2a κ isotypkontroll APC + CD11b FITC + livskraft färgämne (tillsatt i steg 5.1)
- FMO 2 (celler): F4/80 APC + Rat IgG2b κ isotypkontroll FITC + livskraft färgämne (tillsatt i steg 5.1)
- Lägg fluoroforen-konjugerade primära antikroppar och / eller isotypkontroller vid lämplig koncentration (se tabell av reagenser och material).
- Skydda proverna från ljus och inkubera vid 4 ° C under 30 min.
- Tillsätt 2 ml FACS-buffert och centrifugera cellsuspensionen vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Dekantera supernatanten och suspendera SVF cellpelleten i 2 ml FACS buffert.
- Centrifugera cellsuspensionen 500 xg under 5 min vid 4 ° C, och återsuspendera SVF cellpelleten i ≥ 400 | il FACS-buffert.
- Överför proverna till 12 x 75 runda mm polystyren botten rör utrustad med en 35 sil ìm cell tube tops.
- Skydda mot ljus, och proverna förvaras vid 4 ° C tills FACS-analys.
Anmärkning: För optimala resultat celler bör analyseras immeadiately, men har FACS-analys med detta protokoll med framgång genomförts på märkta celler lagrade i FACS-buffert under 1-2 timmar vid 4 ° C. Om celler behöver rättas till för att öka lagringstiden, kan märkta celler fixeras med 2% paraformaldehyd vid 4 ° C under 24 h före FACS-analys. Antikropp företag tyder på att märkta celler kan lagras i upp till en vecka, men detta har inte testats inom ramen för detta förfarande.
Fem. FACS-analys
- Före FACS-analys, lägga livskraft färgämne till prover och lämpliga kontroller för att möjliggöra levande / döda celler diskriminering.
Obs: Ett flertal viabilitet färgämnen är kommersiellt tillgängliga, men DAPI och PI rekommenderas beroende på excitation / emission profiles av fluoroforen-konjugerade antikroppar som används. DAPI och Propidiumjodid tillsätts varje prov vid en slutlig koncentration av 0,2 mg / ml.
- Använd en ofärgade negativt kontrollprov, företrädesvis celler isoleras från samma vävnad som de experimentella proverna, för att justera sidospridning (SSC) och framåtspridning (FSC), så att cellpopulationen (er) av intresse är på skalan.
Obs: För analys av AT SVF celler, rekommenderas det att SSC ska visas i en logaritmisk skala kontra FSC i en linjär skala. Användningen av en log-skala för SSC är speciellt viktiga när man analyserar uttagsautomater, som ofta är mycket stora och granulat.
- Rita en första grind ljusspridning baserad på typen av cell (er) som analyseras, och justera fotomultiplikatorrör (PMT) vinst så att de ofärgade cellerna är längst till vänster av en single-parameter histogram (ungefär centrerad på 10 2) för lämpliga kanaler. </ Li>
Obs: Det rekommenderas att lymfocyter och makrofager (eller andra myeloidceller) analyseras separat på grund av skillnader i autofluorescens.
- Använd enkla färgade kontroller eller antikroppar fånga pärlor ersättning för att utföra flera färger ersättning.
Obs: Användningen av ersättning pärlor rekommenderas, men måste förenlighet varje antikropp säkerställas. Exempelvis kan ersättning pärlor korsreagerar inte med kanin-antikroppar, i vilket fall isolerade celler krävs för att erhålla en lämplig enda fläck kontroll.
- Ställ experimentella grindar baserade på modifierade FMO kontroller.
- Ställ in flödescytometern för att samla in det lämpliga antalet händelser som baseras på förekomsten av den intressanta populationen och registrera experimentella data.
- Exportera FCS datafiler för offline analys. Det finns många program tillgängliga för strömning cytometry dataanalys. Vi rekommenderar Cytobank, en webbaserad plattform som tillåter investigatores att lagra och analysera data och generera siffror från vilken dator som helst med internetuppkoppling 18. Dessutom erbjuder Cytobank möjligheten att göra data allmänt tillgängliga eller begränsa tillgången till kollaboratörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kollagenas digerering av AT följt av differentiell centrifugering användes för att isolera SVF från epididymala fettkuddar av manliga C57BL/6J-möss matas en låg fetthalt (10% kcal från fett) eller hög fetthalt (60% kcal från fett) diet (LFD och HFD , respektive) för 16 veckor. Celler av SVF märktes sedan med fluorofor-konjugerade primära antikroppar för att kvantifiera andelen livskraftiga uttagsautomater (figur 1) och AT T-celler (figur 2) via FACS-analys. Initial slussning, inklusive ljusspridning, dublett diskriminering, och grindar livsduglighet är avbildad i figurerna 1A och 2A. Det bör understrykas att den ursprungliga ljusspridning grind i figur 2A är begränsad till lymfocytpopulationen för att undvika inklusive autofluorescerande myeloidceller. Ett exempel på användning av modifierad FMO kontroller för att fastställa experimentella grindar visas i figur 1B. I detta exempel, den F4/80 (vänstra kolumnen) och CD11b (höger kolumn) antikroppar ersätts med lämpliga isotypkontroller att redovisa autofluorescens och icke-specifik bindning. Quadrant grindar dras sedan för att identifiera livskraftiga uttagsautomater (F4/80 + CD11b +). Gating för CD4 + och CD8 + AT T-celler visas i fig. 2B. Livskraftiga AT lymfocyter är första gated för TCRp (vänstra kolumnen). Därefter TCRp + AT T-celler är gated för CD4 och CD8 (höger kolumn).
Figur 1. Fettvävnad makrofager. The SVF isolerades från epididymis AT av manliga C57BL/6J-möss matas en låg fetthalt eller fettrik diet under 16 veckor med användning av kollagenas digest protokollet. Efter anskaffligen var SVF färgades cellerna för F4/80 och CD11b och FACS-analys utfördes med användning av en flödescytometer för att identifiera uttagsautomater. (A) Initial ljusspridning och grindar livskraft. (B) Modifierad FMO styr införliva isotyp antikroppar för F4/80 och CD11b användes för att rikta kvadrant grindar. (C) Jämförelse av andelen F4/80 + CD11b + uttagsautomater från AT med låg fetthalt och hög fett livnärde möss. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Fettvävnad T-celler. Den SVF isolerades från epididymal adiposvävnad av manliga C57BL/6J-möss matas en låg fetthalt eller fettrik diet under 16 veckor med tHan kollagenas digest protokollet. Därefter fick SVF färgades cellerna för TCRp, CD4, och CD8a och FACS-analys utfördes med användning av en flödescytometer att karakterisera AT T-celler. (A) Initial ljusspridning och grindar livskraft. (BC) Jämförelse av andelen TCRp + T-celler (vänstra kolumnen) och av CD4 + och CD8 + T-celler (höger kolumn) från AT av (B) låg fetthalt och (C) fettrik livnärde möss. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ökat intresse för rollen av immunsystemet i de metaboliska konsekvenserna av fetma har lett till den utbredda användningen av flödescytometri för att karakterisera immunceller i AT. Även om den exakta protokollet kommer att variera mellan laboratorier baserat på sina egna erfarenheter och tillgänglig utrustning, de kritiska stegen inkluderar kollagenasdigestion, differentiell centrifugering, och cellytantigen märkning. Målet med denna artikel är att ge ett detaljerat protokoll och praktisk vägledning för isolering av AT SVF till utredarna med begränsad erfarenhet av att arbeta med AT och / eller utförande av flödescytometri.
Som med alla experimentell teknik, det finns många variationer som kan eller inte kan avsevärt påverkar det önskade resultatet. Baserat på vår erfarenhet, utgör protokollet detaljerade häri den mest effektiva avvägningen mellan tid, resurser, cellulär avkastning, och cellviabiliteten. Till exempel har vi funnit att en ökning avvaraktighet kollagenas II uppslutning till så mycket som 60 minuter vid liknande koncentrationer av kollagenas har en försumbar effekt på cellulär avkastning, alltså, vi använder en 20 min matsmältning för att minska längden på kollagenas exponering. Kollagenas II är den mest använda kollagenas för digereringar fettvävnad. En beskrivning av alla de olika koUagenaser och deras primära användningsområden kan hittas på Sigmas hemsida. Typiska cellulära utbyten från ovanstående protokoll är 2-3 x 10 6 och 4-5 x 10 6 celler / G från möss som utfodrats en låg fetthalt (10% kcal från fett) och hög fetthalt (60% kcal från fett) kost för 16 veckor, respektive. Förutom att variera kollagenas smälta gånger, det finns ett antal potentiella ändringar av nuvarande protokollet beroende på den experimentella modellen som används, inklusive kostbehandling. Först, när skörden på från möss som utfodrats en diet berikat för kolesterol eller mättade fettsyror, undvika att hålla proverna på is före mals eftersom AT kommer att stelna och göra malning svårt. Andra innehåller våra protokoll ett erytrocytlys steg (3,6), men en lyckad initial perfusion ofta gör detta steg onödigt. Tredje, försiktighet måste vidtas för att inte lägga till mer än 10 mM CaCl2 till kollagenas uppslutningslösningen (5 mM slutlig koncentration); större kalciumkoncentrationer kan resultera i bildningen av en kalciumfosfatfällning. Om detta fällning bildas efter den initiala centrifugeringen steg (3,5), tillsätt två tvättsteg med 20 ml FACS-buffert (innehållande EDTA) före erytrocytlys steget för att avlägsna fällningen. Fjärde, rekommenderar vi att utredarna använder minst en hel perigonadal fett pad vid avstängning av SVF. Vi gör denna rekommendation inte på grund av begränsningar i cellulär avkastning, men eftersom olika cellpopulationer visa olika regionala fördelningar 19. Således kan resultaten vara partisk när endast en del av den perigonadal fett pad är ossed att isolera immunceller som bor i AT. Om hela fett pad är större än 1,2 gram, dela fettvävnaden längdled från rostralt till caudal ändar. Om delas i hälften detta sätt bör varje halva en representativ population av celler och bör i allmänhet vara mindre än 1,2 gram. Men i det fallet att det är fortfarande mer än 1,2 gram, rekommenderar vi utför kollagenas spjälkningar av 1.2 gram segment i separata rör, och sedan kombinera alla de SVF cellerna för flödescytometri. Dessutom, för lutar möss, kan det vara nödvändigt att kombinera fettkuddar från två eller tre möss för att erhålla tillräckligt med SVF celler för flödescytometrisk analys. Behovet av ytterligare möss skall redovisas vid utformningen av experiment. Slutligen är ett annat sätt att visa data antalet celler per gram vävnad. Om celldensitet önskas skall AT vägas före malning och matsmältning.
I fråga om att karakterisera AT SVF celler via flödescytometri, tvåpunkter bör betonas. Först bör alla fluoroforen-konjugerade primära antikroppar validerats för användning med AT SVF celler och korrekt titreras. Även om vi visade ersättning med pärlor, hade vi titreras tidigare dessa antikroppar med AT SVF. Vid karaktärisering av makrofager, rekommenderar vi mot användning av tandem färgämnen (t.ex. PE-Cy7), eftersom vi har haft blandade resultat när det gäller icke-specifik bindning av uttagsautomater vid användning av antikroppar konjugerade med dessa färgämnen. Dessutom bör fluoroforer såsom PE och FITC endast användas efter noggrann titrering såsom beskrivits ovan. En lista med specifika antikroppar som vi vanligen används för att karakterisera AT SVF celler tillsammans med rekommenderade halter kan hittas i i tabell 1. Andra, eftersom bankomater uppvisar starka autofluorescens och ett antal antikroppar visar en låg nivå av icke-specifik bindning när den används vid en hög koncentration, rekommenderar vi användning av modifierad FMO kontroller för att fastställa experimentella grindar.FMO kontroller genereras genom färgning av ett uppsättning av kontrollprov med alla utom en av de antikroppar som används för att märka experimentprover 20. Vi har ändrat FMO kontroller i våra protokoll för att ersätta en av antikropparna med en lämplig fluorofor-konjugerad isotypkontroll snarare än att bara ta bort det. I praktiken kan det vara acceptabelt att avstå FMO kontroller för antikroppar som ger exceptionell separation mellan positiva och negativa populationer. Utöver dessa kontroller, kommer du att notera att före slussning på antikropparna, vi förval för lymfocyt-och makrofag populationer baserat på framåt och sidospridning. Detta kommer att eliminera upptäcka autofluorescerande makrofager vid analys lymfocytpopulationer med fluoroforer såsom FITC och tandem färgämnen.
Även om detaljerade protokoll är utanför ramen för denna artikel, tjänar isoleringen beskriven som ett viktigt första steg för ett flertal tekniker som syftar till känneterizing immunceller som bor i AT. Exempelvis kan ovanstående isolering och färgningsprotokollet användas för att underlätta sortering av specifika populationer från vilka mRNA kan isoleras för att analysera genuttryck. Dessutom kan enkla ändringar av protokollet göras för att möjliggöra ex vivo-behandling av uttagsautomater. Sådana ändringar bör använda sterila tekniker för att erhålla SVF, som sedan skulle tvättas två gånger och återsuspenderas i ett lämpligt cellodlingsmedier. Hellre än att lägga fluoroforen-konjugerade antikroppar för att färga cellyteantigener kan SVF läggas till icke-behandlade vävnadskulturplattor att anrika bankomater via plastisk vidhäftning (även om detta inte kan hävdas vara en ren population som fibroblaster och preadipocyter kan också ansluta ). Detta åstadkommes genom odling av SVF för 2-4 h vid 37 ° C följt av två tvättsteg för att avlägsna icke vidhäftande celler. Uttagsautomater kan sedan behandlas därefter och skördas med en EDTA-baserad cell dissociation sålution för flödescytometri eller lyserades i Trizol eller RIPA-buffert för isolering av RNA eller protein. Oavsett nedströms ansökan, fortsätter kollagenas digest tekniken för isolering adipocyter och celler SVF först beskrivits av Rodbell 1964 1 att vara ett ovärderligt verktyg för karakterisering av AT immunceller och deras bidrag till de metabola konsekvenserna av fetma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
JSO stöds av en NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), är AK stöds av en Postdoktorsstipendium från American Diabetes Association (7-10-MI-05), och AHH stöds av en amerikansk Heart Beslutad Association Investigator Award (12EIA8270000). Flödescytometri utfördes i VMC Flödescytometri delade resursen. Den VMC Flödescytometri delad resurs stöds av Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| collagenase | Sigma | C6885-5G | |
| propidium iodide solution | Sigma | P4864-10 ml | |
| stable stack 20 microliter | Rainin | SS-L10 | |
| 20 microliter filter tips | Rainin | SRL10F | |
| stable stack 250 microliter tips | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 microliter tips | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 microliter filter tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 microliter Filter Tips | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn strainers | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| medium weigh dish | Fisherbrand | 02-202B | |
| aluminum foil | Fisherbrand | 1213100 | |
| mincing scissors | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 14-959-49A | |
| filter top FACS tubes | BD Falcon | 352235 | |
| 10 ml pipette case 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 5 ml syringe | BD Falcon | 309646 | |
| V Bottom Plates | Costar | 07-200-107 | |
| transfer bulb pipette | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Adhesive mat | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Cell Culture Centrifuge | Sorvall | 75253839 | |
| Adapters | Sorvall | 75003723 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells |
| Rat anti-mouse F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321 |
| Rat anti-mouse CD11b | eBioscience | 11-0112 | Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031 |
| Armenian Hamster anti-mouse CD11c | eBioscience | 12-0114 | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88 |
| Goat anti-mouse MGL1/2 | R&D Systems | FAB4297P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Goat anti-mouse CD206 | R&D Systems | FAB2535P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Rat anti-mouse CCR2 | R&D Systems | FAB5538P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P |
| Armenian Hamster anti-mouse TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956 |
| Rat anti-mouse CD8a | BD Biosciences | 552877 | Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784 |
| Rat anti-mouse CD4 | BD Biosciences | 557956 | Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963 |
Table 1. List of Materials and Reagents. |
|||
References
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
- Weisberg, S. P., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).
- Xu, H., et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).
- Mathis, D., Shoelson, S. E.
- Stefanovic-Racic, M., et al. Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver. Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).
- Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).
- Feuerer, M., et al. Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters. Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).
- Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).
- Winer, S., et al. Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy. Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).
- Wu, L., et al. Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. , 1143-1152 (2012).
- Wu, D., et al. Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis. Science. 332, 243-247 (2011).
- Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).
- Talukdar, S., et al. Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase. Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).
- Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).
- Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45, 194-205 (2001).
