Summary
Nós descrevemos a preparação de bibliotecas de DNA com código de barras e posterior captura exon baseada em hibridização para a detecção de mutações associadas ao câncer de chave em amostras de tumor clínicos por sequenciamento paralelo em massa "próxima geração". Alvejado seqüenciamento exon oferece os benefícios de alto rendimento, baixo custo, e cobertura seqüência de profundidade, proporcionando assim alta sensibilidade para detecção de mutações de baixa frequência.
Abstract
Os esforços para detectar e investigar mutações oncogênicas chave provaram valiosos para facilitar o tratamento adequado para pacientes com câncer. O estabelecimento de alto rendimento, massivamente paralelo sequenciamento "de última geração" tem ajudado a descoberta de muitas dessas mutações. Para aumentar a utilidade clínica e de translação desta tecnologia, as plataformas devem ser de alto rendimento, custo-benefício, e compatível com parafina fixado em formalina incorporado (FFPE) amostras de tecido que podem render pequenas quantidades de DNA degradado ou danificado. Aqui, descrevemos a preparação de bibliotecas de DNA com código de barras e multiplexados seguidos de captura baseada em hibridização de exons direcionados para a detecção de mutações associadas ao câncer em tumores congelados e frescos FFPE por sequenciamento paralelo em massa. Este método permite a identificação de mutações de seqüência, copiar alterações numéricas e selecionar rearranjos estruturais envolvendo todos os genes-alvo. Alvejado seqüenciamento exon oferece tele beneficia de alto rendimento, baixo custo, e cobertura seqüência profundo, conferindo, assim, alta sensibilidade para detecção de mutações de baixa frequência.
Introduction
A identificação de eventos genéticos tumorais "driver" em oncogenes chave e genes supressores de tumor tem um papel fundamental no diagnóstico e no tratamento de muitos tipos de câncer 1. Esforços de pesquisa em larga escala utilizando sequenciamento paralelo em massa "de última geração" permitiram a identificação de muitos desses genes associados ao câncer nos últimos anos 2. No entanto, essas plataformas de sequenciamento exigem tipicamente grandes quantidades de DNA isoladas de tecidos congelados frescos, representando, assim, uma grande limitação na caracterização e análise de mutações de DNA de tecidos conservados, como a parafina fixado em formalina incorporado (FFPE) amostras tumorais. Melhoria esforços eficiente e confiável para caracterizar a informação genômica "acionáveis" a partir de amostras de tumores FFPE permitirá a análise retrospectiva de espécimes previamente inclinadas e ainda incentivar abordagens individualizadas para tratamento de câncer.
Tradicionalmente, d molecularlaboratórios iagnostic têm contado com metodologias baixo rendimento demoradas, como sequenciamento Sanger e PCR em tempo real para a mutação do DNA profiling. Mais recentemente, métodos de maior rendimento, utilizando PCR multiplexada ou genotipagem de espectrometria de massa foram desenvolvidos para investigar mutações somáticas recorrentes nos genes chave do cancro 3-5. Estas tentativas, no entanto, são limitadas na medida em que apenas predeterminados "ponto quente" mutações são ensaiadas, tornando-os inadequados para a detecção de mutações de inactivação nos genes supressores tumorais. Sequenciamento paralelo em massa oferece várias vantagens em relação a estas estratégias, incluindo a capacidade de interrogar exons inteiros de mutações comuns e raros, a capacidade de revelar classes adicionais de alterações genômicas, tais como os ganhos e perdas no número de cópias, e maior sensibilidade de detecção em amostras heterogêneas 6, 7 . Seqüenciamento do genoma inteiro representa a abordagem mais abrangente para a descoberta da mutação, embora seja relativaly caro e incorre em grandes demandas computacionais para análise e armazenamento de dados.
Para aplicações clínicas, onde apenas uma pequena fração do genoma podem ser de interesse clínico, duas inovações específicas em tecnologia de seqüenciamento foram transformadora. Primeiro, através baseada em hibridização captura exon, pode-se isolar o DNA correspondente a genes-chave associados ao câncer de profiling mutação alvejado 8. Em segundo lugar, através da ligadura de códigos de barras molecular (ou seja, seqüências de DNA 6-8 nucleotídeos de comprimento), pode-se reunir centenas de amostras por sequenciamento de correr e aproveitar plenamente a capacidade cada vez maior de instrumentos de seqüenciamento de massivamente paralelo 10. Quando combinadas, estas inovações permitem que os tumores de ser perfilado para menor custo e com maior rendimento, com menores exigências computacionais 11. Além disso, através da redistribuição de cobertura de sequência com apenas os genes mais importantes para a aplicação particular, pode-se Achieve maior profundidade seqüenciamento de maior sensibilidade de detecção de eventos de baixa freqüência do alelo.
Aqui nós descrevemos nosso ensaio IMPACT (Integrated Mutação Profiling de Metas Câncer acionável), que utiliza a captura de código de barras no exon piscinas biblioteca seqüência por hibridização com oligonucleotídeos personalizados para capturar todos os exons codificadores de proteínas e selecione íntrons de 279 genes-chave associados ao câncer (Tabela 1 ). Esta estratégia permite a identificação de mutações, indels, alterações no número de cópias e selecione rearranjos estruturais envolvendo estes 279 genes. O nosso método é compatível com o DNA isolado a partir de ambos os tecidos congelados frescos e FFPE, bem como aspirados por agulhas finas e outros espécimes citológicos.
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Protocol
1. ADN e de preparação dos reagentes
Nota: Este protocolo descreve o processamento simultâneo e análise de 24 amostras de tumor (por exemplo, 12 / pares normais), mas pode ser adaptado para lotes mais pequenos e maiores. As amostras de DNA pode derivar de FFPE ou tecido fresco congelado, espécimes citológicos, ou sangue. Tipicamente, tanto do tumor e tecido normal a partir do mesmo paciente será perfilado em conjunto, a fim de distinguir as mutações somáticas de polimorfismos hereditários. O protocolo começa imediatamente após a extração de DNA.
- Aliquota 50-250 ng (250 ng recomendado) do ADN extraído por amostra, diluídos em 1x Tris-EDTA (pH 8,0) tampão para um volume final de 50 ul, em Covaris tubos separados de fundo redondo.
- Distorcer o DNA no instrumento Covaris E220 nas seguintes configurações de cisalhamento: 360 SEC em 10 fator de serviço, 175 PIP, e 200 ciclos por explosão.
- Descongele AMPure XP Contas (Tabela 2) à temperatura ambiente. Descongele tudo buffers e enzimas no gelo antes de a etapa adequada.
2. Módulo Repair End - Preparação Biblioteca
- Preparar a mistura de mestre reparação fim em um tubo de microcentrífuga estéril usando os seguintes volumes por amostra: 10 ml de 10x NEBNext Fim Reação Repair Buffer (Tabela 2), 5 jul NEBNext Fim Reparação Mix enzima (Tabela 2), 35 mL estéril nuclease livre H 2 O.
- Alíquota de 50 ul de cada um de DNA cortado em poços separados de uma placa de 96 poços. Adicionam-se 50 ul da mistura principal de reparação extremidade preparada para cada reacção. Incubar em um termociclador durante 30 min a 20 ° C.
3. Reparação Mensagem Final Clean-up
- Adicionar volume de 2x (200 mL) de AMPure XP Contas (Tabela 2) para cada amostra e pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes usando uma pipeta multicanal. Incubar à temperatura ambiente durante 15 min.
- Coloque no suporte magnético (Tabela 2
- Retire com cuidado e descarte claro sobrenadante tomando cuidado para não perturbar as esferas. Algum líquido pode permanecer nos poços.
- Com os tubos na posição, adicionar cuidadosamente 200 mL de etanol preparada de fresco de 80% a cada amostra e incubar a placa a temperatura ambiente durante 30 seg. Cuidadosamente, remover o etanol, com uma pipeta.
- Repetir passo 5, para um total de duas lavagens de etanol. Certifique-se de todo o etanol foi removido. Retirar do suporte magnético e deixar secar a temperatura ambiente durante 5 min.
- Ressuspender contas secas, com 44,5 mL estéril H 2 O. Gentilmente, volume inteiro pipeta cima e para baixo 10x misturando bem. Assegurar grânulos já não estão ligados ao lado do poço.
- Incubar grânulos em suspensão à TA, durante 2 min. Coloque em suporte magnético por 5 minutos até que a amostra parece clara.
- Gentilmente transferir 42 mL de sobrenadante claro que contém a amostra de um novo poço.
O procedimento pode ser interrompido com segurança nesta ruaep e as amostras armazenadas a -20 ° C durante 7 dias. Para reiniciar, descongelar amostras congeladas no gelo antes de prosseguir.
4. Preparação Biblioteca - dA-tailing Módulo
- Preparar a mistura de mestre dA-Tailing num tubo de microcentrífuga estéril, usando os seguintes volumes por exemplo: 5 ul de 10x NEBNext Reacção dA-Tailing Buffer (Quadro 2), 3 ul (3'-5 '-exo) Fragmento Klenow (Tabela 2 ).
- Adicionar 8 mL da mistura principal preparado dA-Tailing a cada cavidade contendo 42 ul de DNA reparado nas extremidades. Incubar em um termociclador durante 30 min a 37 ° C.
- Execute um post dA-tailing limpeza: Repita os passos 3,1-3,8 usando volume de 2x (100 mL) de contas, mas ressuspender em H 2 O estéril para um volume final de 33,75 mL.
O procedimento pode ser interrompido de forma segura a este passo, e as amostras armazenadas a -20 ° C durante 7 dias. Para reiniciar, descongelar amostras congeladas no gelo antes de prosseguir. </ Li>
5. Preparação Biblioteca - Adaptador Ligadura Módulo
- Preparar a mistura de mestre ligadura num tubo de microcentrífuga estéril, usando os seguintes volumes por amostra: 10 ul de 5x NEBNext rápida ligadura de tampão de reacção (New England Biolabs, Tabela 2), 5 ul de DNA ligase de T4 rápida (Tabela 2).
- Adicionam-se 15 ul da mistura principal Ligadura para cada poço contendo o ADN dA-cauda.
- Adicionar 1,25 mL da apropriada uM NEXTflex adaptador de código de barras 25 (Tabela 2) para cada poço. Cada amostra deve receber uma placa com código de barras separado. Incubar em um termociclador durante 15 min a 20 ° C.
- Realizar um adaptador de pós ligadura limpeza: Repita os passos de 3,1-3,8 usando volume de 1x (50 mL) de contas, mas ressuspender em H 2 O estéril para um volume final de 50 ul.
- Repita os passos de 3,1-3,8 para um segundo volume 1x (50 mL) de limpeza, mas ressuspender em H 2 O estéril a umvolume final de 23 ul.
O procedimento pode ser interrompido de forma segura a este passo, e as amostras armazenadas a -20 ° C durante 7 dias. Para reiniciar, descongelar amostras congeladas no gelo antes de prosseguir.
6. Ampliação da Biblioteca
- Preparar a mistura de mestre KAPA HiFi num tubo de microcentrífuga estéril, usando os seguintes volumes por amostra: 25 ul 2x KAPA HiFi HS RM (Tabela 2), 1 ul de cada uma de 100 uM Iniciador 1 e iniciador 2 (Tabela 3).
- Adicionar 27 ul da mistura de base para cada uma das cavidades contendo o produto de ligação. Definir pipeta a 50 ul e gentilmente pipeta todo o volume para cima e para baixo 10x.
- Colocar no termociclador para os seguintes ciclos de PCR: desnaturação inicial de 45 segundos a 98 ° C, 10 ciclos de 15 seg a 98 ° C, 30 seg a 60 ° C, 30 seg a 72 ° C, e extensão final de 1 min a 72 ° C.
- Realizar uma pós amplificação limpeza: Repita os passos de 3,1-3,8 usando1x o volume (50 mL) de AMPure XP grânulos, e voltar a suspender em água estéril para um volume final de 30 ul.
- Quantificar a concentração de cada biblioteca usando Qubit Ampla Gama Ensaio (Life Technologies, Tabela 2) de acordo com as instruções do fabricante.
7. Roche Nimblegen SeqCap EZ Biblioteca Hibridização, Wash, e amplificação
- Descongele bloqueadores de oligonucleotídeos universais e índice (Tabela 3), SeqCap EZ Biblioteca, e componentes de captura Nimblegen (DNA COT, tampão de hibridação 2x, e hibridação componente A, Tabela 2) no gelo. Todos os bloqueadores de oligonucleótidos são armazenados em stocks de trabalho de 1 mM. Nossa SeqCap EZ Library é um conjunto de design personalizado de sondas de captura, abrangendo todos os exons codificadores de proteínas de 279 genes associados ao câncer, embora possam ser utilizados outros projetos personalizados e de catálogo.
- Prepare uma piscina 1 mM de bloqueadores índice de oligonucleotídeos correspondentes ao código de barras específico anúnciosequências Aptor usados na preparação de biblioteca. Combine 1 ml de cada bloqueador, e vortex.
- Em uma nova estéril de 1,5 mL de microcentrífuga de tubo, adicionam-se 5 ul de DNA COT 1mg/ml, 2 ul de 1 mM bloqueador universal e 2 ul da piscina mM de bloqueadores índice de oligonucleótidos 1.
- Piscina 24 bibliotecas com código de barras em uma única reação. Adicionar um total de 1-3 ug de reunidas, biblioteca sequência de código de barras (preparado anteriormente) à mistura de captura. Para 24 amostras, é recomendado 100 ng por amostra. Ao reunir os tumores e as amostras normais correspondentes, é recomendável adicionar mais biblioteca de tumor (por exemplo, 100 ng por tumor e 50 ng por normal) de modo que eles são sequenciados para uma maior profundidade de cobertura.
- Feche a tampa do tubo e fazer 15-20 furos na parte superior da tampa com um 18-20 G ou agulha menor. Speed Vac a amostra de ADN da biblioteca / COT / oligos amplificados num concentrador de vácuo o DNA em alta temperatura (60 ° C).
- Uma vez completamente seco para baixo, hidratar com 7,5 l de 2x hybriditampão zação e 3 l de hibridização componente A. O tubo agora deve conter o seguinte: 5 mg COT DNA, mg variável biblioteca amostra amplificada, 1000 pmol de Universal e Índice Oligos, tampão 7,5 mL 2x hibridização, 3 componente mL hibridização A em um volume total de 10,5 mL.
- Cobrir os orifícios na tampa, com um pequeno pedaço de fita de laboratório. Vortex a amostra por 10 segundos e centrifugar a velocidade máxima por 10 segundos.
- Incubar a amostra a 95 ° C durante 10 minutos para desnaturar o ADN, seguido de centrifugação à velocidade máxima durante 10 segundos à temperatura ambiente.
- Em um novo 0,2 ml PCR tubo tira, preparar 2,25 mL alíquota de SeqCap EZ sondas de captura Biblioteca e 2,25 mL de estéril nuclease livre H 2 O e adicionar o conteúdo do passo 7.7. Pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10x.
- Incubar no termociclador a 47 ° C durante 48-96 horas. Definir e manter a temperatura da tampa do termociclador a 57 ° C.
- Folbaixos passos no Capítulo 6 do Manual do Usuário do SR NimbleGen SeqCap EX Biblioteca v3.0 (Tabela 2) para a lavagem e recuperação do DNA capturado.
- Segue passos no capítulo 7 do protocolo Roche NimbleGen para amplificação do DNA capturados com as seguintes modificações:
- Use 2x KAPA HiFi Polimerase (Tabela 2) em vez de Phusion High-Fidelity PCR Master Mix
- Utilizar 100 uM Iniciador 1 e iniciador 2 listadas na Tabela 3.
- Executar os seguintes condições de PCR: desnaturação inicial a 98 ° C durante 30 seg, 11 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 segundos, e extensão final a 72 ° C durante 5 min . Manter a 4 ° C.
- Quantificar a concentração de DNA amplificado capturado usando Qubit alta sensibilidade do ensaio (Tabela 2) de acordo com as instruções do fabricante.
- Analisar a qualidade do DNA capturado usando Agilent Biochip de ADN analisador HS (Tabela 2) de acordo com as instruções do fabricante.
- O rendimento de PCR deve ser de pelo menos 100 ng (gama 100-1000 ng).
- O comprimento médio de fragmento deveria ser entre 150-400 pares de bases.
8. Illumina Hi-Seq Seqüenciamento
- Diluir o DNA capturado ampliado para duas horas e coloque a amostra em uma única pista de uma célula de fluxo Illumina HiSeq 2000. Seqüência emparelhado-end par 75 de base lê de acordo com as instruções do fabricante. Em nossa experiência, uma pista é suficiente para produzir uma cobertura única seqüência de 500 700x por amostra através de 279 genes para uma piscina de 24 amostras.
- Software Illumina (Análise Real Time) irá converter imagens de alta resolução para intensidades de cluster para basear chamadas e índices de qualidade. Use casava demultiplex dados de acordo com a identidade de código de barras e gerar arquivos FASTQ individuais para cada amostra.
9. Dados Analysis
- Seqüências adaptadoras guarnição da extremidade 3 'da seqüência lê arquivos FASTQ usando Cutadapt ( http://code.google.com/p/cutadapt/ ). O comprimento mínimo de sobreposição (-O) é 3, com uma taxa de erro (-e) de 1%. O comprimento base mínima para a retenção de emparelhado lê após o corte é 25.
- Alinhe seqüência lê a Referência hg19 genoma humano utilizando a ferramenta de Burrows-Wheeler Alinhador (BWA) 12. Execute as etapas de pós-processamento, incluindo a marcação duplicada, realinhamento seqüência múltipla local, e recalibração índice de qualidade de base usando a Análise de Genoma Toolkit (GATK) de acordo com as suas melhores práticas padrão ( http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic? name = melhores práticas ) 13. Ao traçar o perfil de várias amostras do mesmo paciente (por exemplo, tumor combinados e normais), realinhamento seqüência múltipla local deve ser desemMED em conjunto. A saída dessas etapas de pós-processamento é um arquivo BAM separado para cada amostra, que contém todas as seqüências, qualidade e informação de alinhamento e pode ser carregado diretamente na Integrative Genomics Viewer (IGV) para visualização de leituras e seqüência de variantes 14.
- Calcular as métricas de desempenho de seqüência usando ferramentas Picard ( http://picard.sourceforge.net/ ). Métricas informativos incluem taxa de alinhamento, distribuição de tamanho de fragmento, GC-content viés cobertura associada, captura de especificidade no alvo, PCR duplicar taxa, a complexidade da biblioteca, e significa a cobertura alvo. Os valores representativos são apresentados na Figura 1. As freqüências alélicas em locais polimorfismo comum calculados usando DepthOfCoverage de GATK são usados para monitorar a contaminação por DNA independentes e para garantir que amostras pareadas veio dos mesmos pacientes.
As seguintes análises computacionais dependem da presença de correspondênciaAs amostras tumorais e normais para a detecção de alterações genéticas somáticas. Tumores não coincidentes também podem ser analisados utilizando-se uma amostra de controlo normal, separada, mas mais mutações somáticas não pode ser facilmente distinguida de variantes de sequências de herdadas. - Chame variantes de um único nucleotídeo somáticas (SNVS) para cada par de tumor do normal usando uma chamada mutação somática, como muTect 15, SomaticSniper 16 ou Strelka 17. Usamos muTect com critérios de filtragem modificados, permitindo variantes com baixo (não zero) contagens de alelos na amostra normal, desde que a frequência do alelo é pelo menos 5 vezes maior do tumor. Variantes recorrentemente chamados em um painel de DNAs normais são removidos como artefatos sistemáticas prováveis de seqüenciamento ou alinhamento. Cada SNV passando filtros é, então, cuidadosamente revistos usando IGV.
- Chame indels somáticos para cada par tumor normal utilizando algoritmos como SomaticIndelDetector 13, Dindel 18 ou 19 SOAPindel
- Extrapolar cópia status de número a partir da cobertura de seqüência em exons alvo. Para cada amostra individual, realizar uma normalização Loess de cobertura média seqüência para todos os exons alvo, regressão sobre percentual GC. Ajustar os valores de cobertura unnormalized subtraindo o ajuste loess e adicionando a cobertura média de toda a amostra. Calcule a razão da cobertura seqüência normalizada em todos os exons alvo para pares tumorais normal. Na ausência de uma amostra normal combinado e / ou para diminuir o ruído, outro diplóide pareados por sexopodem ser utilizados controlos normais que faltam variantes do número de cópia da linha germinativa. Determine os ganhos no número de cópias somáticas e perdas com base em aumentos ou diminuições no índice de cobertura.
- Chamar rearranjos envolvendo somáticas genes do cancro, onde, pelo menos, um ponto de interrupção genómico cai dentro ou próximo de um intervalo alvo do genoma. Algoritmos sugeridos incluem GASV 20, Breakdancer 21, CREST 22, e Dranger 23. Intrachromosomal inversões, duplicações e deleções, em tandem podem ser distinguidos com base na posição relativa e a orientação de apoiar lê em pares discordantes. Todos os rearranjos candidatos devem ser revistos manualmente usando IGV. Recomendamos validação experimental por PCR e seqüenciamento Sanger através dos pontos de interrupção de rearranjo putativos.
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Representative Results
Uma piscina de 24 bibliotecas de seqüência com código de barras (12 pares de tumor do normal) foi capturado usando sondas correspondentes a todos os exons codificadores de proteínas de 279 genes do cancro e sequenciados como 2 x 75 pb lê em uma única pista de uma célula de fluxo HiSeq 2000. Tumor e bibliotecas normais foram reunidas na proporção de 2:1. Métricas de desempenho das amostras para um conjunto de amostras de ADN de tumor congeladas são mostrados na Figura 1, incluindo a taxa de alinhamento, distribuição de tamanho de fragmento, a captura de especificidade no alvo, e significa que a cobertura pretendida. Exemplo mutações somáticas, inserções, eliminações e alterações no número de cópias são mostradas nas Figuras 2-4.
Figura 1. Figuras representativas das métricas de desempenho seqüência. a) densidade de agrupamento e taxa de alinhamento, b) significa cobertura alvo,
Figura 2. Integrative Genomics Viewer (IGV) imagem mostrando especificidade da cobertura seqüência de exons de EGFR em câncer de pulmão (em cima) e tecido normal combinado (em baixo). Barras cinza representam seqüência única lê. À direita, uma mutação T> G heterozigótica está presente em 24% dos lê no tumor e 0% de leituras no normal, indicando que é uma substituição de aminoácido L858R somática. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Figura 3. Exemplos de indels em um par tumor normal câncer colorretal:.. A) inserção frameshift somática em APC b) exclusão frameshift somática de 7 pares de bases de TP53 Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 4. Alterações no número de cópias em um par tumor do normal. Cada ponto de dados representa um único exon de 279 genes-alvo. Copiar ganhos e perdas numéricas são inferidos a partir de aumentos e diminuições na cobertura seqüência tumor. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Quadro 1: Características Probe Design for alvo de captura.
| Total de exons | 4535 |
| Total de íntrons | 14 |
| SNPs * | 1042 |
| Território-alvo total | 879.966 pares de bases |
| Território total da sonda | 1.400.415 pares de bases |
Tabela 2. Reagentes e Kits.
| NomeReagente / Material | Companhia | Número de Catálogo |
| Módulo Repair NEBNext Fim | New England Biolabs | E6050L |
| NEBNext dA-tailing Módulo | New England Biolabs | E6053L |
| NEBNext Rápido Ligadura Módulo | New England Biolabs | E6056L |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | |
| NEXTflex PCR-Free códigos de barras - 24 | Bioo Científica | 514103 |
| Kit HiFi Biblioteca Amplificação | Kapa Biosystems | KK2612 |
| COT DNA humano, Fluorometric Grau | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 |
| NimbleGen SeqCap EZ hibridação e kit Wash | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 |
| Iscas SeqCap EZ Biblioteca | Roche NimbleGen | |
| Kit QIAquick PCR Purification | Qiagen | 28104 |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Kit de Ensaio | Life Technologies | Q32850 |
| Qubit dsDNA de alta sensibilidade (HS) Kit de Ensaio | Life Technologies | Q32851 |
| Kit Agilent DNA HS | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | |
| Covaris E220 | Covaris | |
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
Tabela 3. Índice Oligo Bloqueio e Primers seqüências.
| TS-HE Bloqueador Universal | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Índice 1 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Índice 3 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Índice 4 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE índice 5 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Índice 6 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE índice 7 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Índice 8 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE índice 9 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 10 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 11 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 12 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 13 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 14 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 15 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE índice 16 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 18 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 19 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 20 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 21 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 22 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 23 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 25 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE índice 27 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| Iniciador 1 | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-3 ' |
| Iniciador 2 | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3 ' |
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Discussion
Nosso ensaio IMPACTO produz uma alta taxa de alinhamento, de alta taxa de on-alvo, cobertura alvo elevado e alta sensibilidade para detecção de mutações, indels e copiar alterações numéricas. Nós demonstramos a capacidade de nosso ensaio IMPACTO a seqüência de DNA de ambos fresco congelado e arquivados amostras FFPE de entrada de baixa DNA. Ao realizar o seqüenciamento exon alvo de genes-chave associados ao câncer, pode-se atingir a cobertura seqüência muito profundo para os exons desses genes mais críticos, maximizando, assim, a capacidade de detectar mutações de baixa frequência. O uso de código de barras e multiplexação permite maior rendimento, menor custo por amostra, e os valores de entrada mais baixos de DNA.
Uma vantagem da abordagem específica é que é possível optimizar a sondas de captura de tal modo que todos os exões estão cobertas de modo uniforme e suficiente para a detecção de mutações. Como mostrado na Tabela 1, a concepção abrange 4535 exões em 279 genes. Após melhorias iterativos paranossa concepção, uma experiência de sequenciação típica produz mais do que 2% de exões em menos de 20% de cobertura da mediana para toda a amostra. Assim, para um tumor sequenciado a 500x cobertura sequência (uma estimativa conservadora, como mostrado na Figura 1),> 98% de exões será coberto por> 100x profundidade, garantindo uma elevada sensibilidade para a identificação de mutações de baixa frequência. Esta uniformidade de cobertura pode ser atribuído principalmente à flexibilidade do sistema Nimblegen SeqCap, em que as sondas podem ser sintetizados com diferentes comprimentos, em regiões de composição de nucleótidos diferente. Temos também utilizado com sucesso oligonucleotídeos biotinilados sintetizados individualmente de Integrated DNA Technologies (IDT) para adicionar novos conteúdos para o nosso painel e para aumentar a cobertura de regiões que são difíceis de capturar e / ou sequência. Por também capturar selecione íntrons de genes recorrentemente reorganizados, somos capazes de identificar rearranjos estruturais produzindo genes de fusão, mesmo quando apenas uma fusion parceiro é capturado.
Esta abordagem de seqüenciamento alvo realmente possui duas limitações principais da capacidade de detectar alterações genéticas "driver" em tumores. Em primeiro lugar, só uma fracção do genoma é interrogado. Seqüenciamento alvejado é, por natureza, limitado. Como novos genes de cancro surgem a partir genómica esforços sistemáticos, eles podem ser rapidamente adicionados a um painel de captura, mas mutações funcionalmente importantes podem ser perdidas, que seria detectado pelo genoma inteiro ou exome sequenciação todo. Em segundo lugar, é limitada a alterações baseadas em DNA. A detecção de transcritos expressos de maneira aberrante, novas isoformas de emenda, e fusões de genes requer RNA-Seq ou técnicas similares 24. Alterações epigenéticas, tais como modificações da cromatina e metilação do DNA também podem desempenhar papéis-chave na tumorigênese e progressão do tumor. Como as tecnologias de seqüenciamento de continuar a melhorar, pode-se vislumbrar estratégias integradas empregando seqüenciamento do genoma inteiro, RNA-Seq e approa complementarches para caracterizar de forma abrangente a genética e epigenética make-up de tumores individuais numa base de rotina 25. Como estratégias integradas completas estão atualmente em termos de custos e computacionalmente proibitivo, seqüenciamento alvo apresenta uma alternativa prática para capturar as características genômicas mais salientes para aplicações clínicas e de translação.
Nosso protocolo assume que os tumores são sequenciados ao lado de tecido normal combinado feita a partir do mesmo paciente. O efeito deste controlo é o normal para determinar se as variantes da sequência detectada no tumor são herdadas ou adquiridas somaticamente. Na ausência de um normal, combinado, pode-se inferir que as variantes que ocorrem em hotspots de mutação (ou seja, sítios de mutações somáticas recorrentes em outros tipos de câncer) são susceptíveis de ser somática. Além disso, a análise dos ganhos e perdas de número de cópias pode ser realizada com uma amostra normal de diplóides não geneticamente compatíveis. Para todas as outras alterações genéticas novas, a simulous análise de tecido normal combinado simplifica a interpretação dos dados resultantes de mutação e é altamente recomendado.
O protocolo de impacto descritos aqui demonstra consistência e desempenho de alta qualidade para amostras congeladas. Temos observado variabilidade ocasional quando se trabalha com amostras FFPE, no entanto. Dependendo da idade e da qualidade da amostra de FFPE, o ADN pode ser severamente degradada ou quimicamente modificado, e como resultado, pode tornar difícil a sequenciação e análise 26. Dito isto, nós encontramos essas condições experimentais para ser confiável para a grande maioria das amostras de FFPE. Temos também aplicado com sucesso este protocolo para caracterizar outros espécimes clinicamente relevantes, tais como biópsias, punção aspirativa por agulha fina, e espécimes citológicos. É por esta razão, a flexibilidade para acomodar diferentes tipos de amostras de qualidade variável, quantidade, e heterogeneidade, que este método está a impactar o diagnósticotratamento de pacientes com câncer d na arena clínica.
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Disclosures
Dr. Berger recebeu honorários de consultoria e financiamento para pesquisa da Fundação de Medicina, uma empresa de diagnóstico de câncer.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Agnes Viale eo MSKCC Genomics Laboratory Núcleo para assistência técnica. Este protocolo foi desenvolvido com o apoio do Centro de Pesquisa do Câncer Geoffrey Beene e da Fundação Agricultor Familiar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
| NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056L | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
| NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
| NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
References
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