Summary
Histologiske og biokemiske ændringer efter aneurisme endograft udelukkelse er stadig uklart. Vi beskriver en ny model for endograft implantation på et murint aneurisme. Gennem blodprop analyser med og uden persistente cirkulerende blod stream interface, og nye endovaskulær biomaterialer evaluering, vil denne model bidrage til bedre at forstå endovaskulær aneurisme udstødelse Sygdomsbiologi.
Abstract
Endovaskulær aneurisme udstødelse er en valideret teknik til at undgå aneurismebrud. Langsigtede resultater fremhæve teknik begrænsninger og nye aspekter af abdominalt aortaaneurisme (AAA) patofysiologi. Der er ingen abdominalt aortaaneurisme endograft udelukkelse model billig og reproducerbar, hvilket ville tillade dybe undersøgelser af AAA før og efter behandlingen. Vi hermed beskrive, hvordan at fremkalde og derefter at udelukke med en overdækket koronar stentgraft et abdominalt aortaaneurisme i en rotte. Den velkendte elastase induceret AAA model blev først rapporteret i 1990 1 i en rotte, så beskrevet i mus 2. Elastin nedbrydning fører til dilatation af aorta med inflammatorisk infiltration af bugvæggen og intra luminale trombe, der matcher med humant AAA. Endovaskulær udelukkelse med lille overdækket stentgraft udføres derefter, eksklusive eventuelle interaktioner mellem cirkulerende blod og aneurisme blodprop. Passende udstødelse og stentgraft patency erbekræftet før eutanasi af en angiografi troede venstre halspulsåre. Delvis kontrol elastase diffusion gør aneurisme form forskellig for hvert dyr. Det er vanskeligt at skabe en aneurisme, som vil give en passende længde af aorta under aneurismet for en nem stentgraft introduktion og med tilstrækkelig proksimal og distal hals for at forhindre endolækager. Masser af fejl kan føre til stentgraft introduktion, der til tider føre til aorta tåre med smerter og problemer at sy det, og endotel skade med posten op aorta trombose. Give aspirin til rotter før stentgraft implantation nedsætter fejlrate uden større blødning. Fastspænding tiden aktiverer neutrofile, endotel og blodplader, og kan interferere med biologisk analyse.
Introduction
Endovaskulære færdigheder har gjort fremskridt siden den første endovaskulær aortaaneurisme reparation (EVAR) ved at Parodi i 1991 3, næsten halvdelen af alle abdominale aneurismer behandles nu af EVAR 4.. I modsætning kirurgi efterlader EVAR tromben, at udelukke det fra systemisk blodbanen. Aneurismer er kendetegnet ved en hæmoglobinkoncentration rige flere lag trombe, en tynd medier og en fibrosed og betændt adventitia. Den afgørende rolle for proteolyse 5 i aneurismet progression er påvist tredive år siden 6, 7: aneurismesækken trombe er forbundet med en tynd aortavæg, lysering af elastin, lav densitet af glatte muskelceller i medierne, og et højt niveau af immuno -inflammatorisk adventitiale reaktion 8,9. Disse ændringer tyder på, at proteolytisk enzymatisk aktivitet forekommer i tromben, snarere end direkte i aortavæggen.
Desuden er det luminale lag af tromben rig på agglutinerede røde blodlegemer ceLLS frigiver hæmoglobin. De er primært involveret i dannelse af fibrin, blodpladeaktivering og inducere thrombin dannelse. Endelig trombe inducerer også t-PA og plasminogen fastholdelse, der er involveret i fibrinolyse og rekruttering leukocytter, primært neutrofile. Det er 12 gange mere vigtigt i blodprop end i blodet 10.. Deres tilstedeværelse er forbundet med en høj grad af matrixmetalloproteinase type 8 (MMP-8), MMP-9 og elastase: de frigiver granulære serinproteaser og pro oxidative midler fører til nedbrydning af fibrillære matrix, og i sidste ende aortavæggen briste 9,11 -13.
Valgfag aneurisme indgreb har til formål at forhindre brud. EVAR efterlader både aneurisme væg og trombe intakt. Således er aneurisme perfusion af aorta sikkerheder (lumbal arterier, ringere mesenterialarterie ...), opkaldt endolækage, og er en specifik komplikation af endovaskulær behandling 14,15, undertiden fører til brud EveN med lavt tryk endolækager. I visse patienter, er der ingen stigning i aneurisme diameter 16. Interaktion mellem cirkulerende blod og aneurismal væg opretholder den nævnte intra luminale trombe biologisk aktivitet. Derfor, type V endolækager, defineret som udvidelse af aneurismesækken uden identificeret endolækage, kunne forklares ved enzymatisk aktivitet inde i aneurisme trombe.
Hverken radiologisk billeddannelse (18FDG-PET scanning, blodpladeaktivering scintigrafi, jern oxyde kontrast MRI17) eller perifere blod prøvetagning (MMP-9, blodpladeafledte mikropartikler, plasmin / anti-plasmin kompleks), der bruges til at udforske den endovaskulære indvirkning på aortaaneurismer i mennesker direkte evaluere biokemiske veje.
I vores viden, er der ingen nogen reproducerbare og billig eksperimentelle aneurisme udstødelse dyremodeller. Denne ene giver før og efter aneurisme udstødelse biologiske og histologiske ændringer, der skal udforskes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Metoder
Protokollen er blevet godkendt af Bichat-Debré Etik udvalg (N ° 2012-15/698-0074).
Den elastase perfusion model er første gang beskrevet af Anidjar i 1990 1: abdominalt aortaaneurisme er foranlediget af elastase perfusion i Wistar rotter i alderen 8 til 9 uger 250-300 g. To til fire uger senere, er en re-laparotomi udføres, og en diameter på 3 mm dækket koronar stentgraft bruges til at udelukke aneurismen. Transplantatet, indsættes gennem en distal aortotomy, er indsat under forstørret vision. To uger senere er stentgraft åbenhed bekræftes med en aortografi den venstre fælles halspulsåre før aflivning. Hele stentet aorta og omgivende væv høstes dernæst og konditioneres til analyse.
Protokol
1.. Trin 1: Abdominal aortaaneurisme Induktion (dag 0)
- Anesthetize dyret med isofluran, og ydeevnem en intra peritoneal penthobarbital injektion. 0,1 ml/100 g penthobarbitol fortyndes i 0,1 ml saline/100 g af dyrets vægt. Anæstesi er tilstrækkelig til proceduren.
- Barbere maven, og rengør huden med alkohol.
- Gør Xypho pubic hudindskæring med en klinge. Abdominal muskler lag derefter bughinden, undgå indre organer, er åbne med en saks. Placer spredere og wrap tarmene i en våd komprimere på den venstre side af dyret.
- Åbn bageste bughinden direkte over aorta, uden at rive den. Målet er at forhindre fremtidige tarm sammenvoksninger efter økonomisk dissektion.
- Ligere alle sikkerheder fra venstre nyrevene til bækkenforgreningen med kun én ligatur på oprindelsen af aorta. Hvis aorta sidder fast tarm eller vena cava, der er en stor risiko for blødning under den anden indgriben dette ofte er dødelig for rotten.
- Passere en 4-0 silke to gange rundt om aorta, 15 mm under LEFt nyrevene. Det er vigtigt at helt dissekere aorta, ca. 15 mm under den venstre nyre vene og umiddelbart proksimalt til bækkenforgreningen at tillade indsættelse af Gilbert approximator klemmer.
- Efter fastspænding aorta proksimalt lige under den venstre nyre vene, og distalt lige over bækkenforgreningen, fjerne adventitia, og udføre en lille aortotomy så proksimalt som muligt til den distale klemme. Aorta skal omhyggeligt skyllet med saltvand og en vinklet kanyle og alle resterende blod vaskes for at undgå blodprop embolisering når declamping.
- Indføre varme tilspidsede polyethylenrør (PE 10) jævnt inden i aorta, og passere 4-0 silke omkring aorta (i trin 1.6) og binde op for at sikre røret og undgå pres udvisning.
- Indsprøjtes elastase i en 10 til 13 mm længde af aorta (fra den proximale klemme til silke).
- Indgyde 725 ul af elastase løsning er d ved konstant hastighed-rate i 30 min. Det er vigtigt nøje at survey injektionen: under infusion, bør aorta udvider med 140-150% af sit normale diameter.
- Ved afslutningen af infusionen, fjernes kateteret skylles elastase med saltvand, klippe silke og luk aortotomy med omkring 3 sting i 10-0 prolene. Fjern kablerne: distal derefter proximal. Care skal tages for at undgå trans-aorta sutur. Med et par praksis og i betragtning af den lille længde af aortotomy er aorta trombose ekstremt sjældne.
- Luk bugvæggen med en kontinuerlig resorberbar sutur, og huden med afbrudte ikke absorberbare suturer. Sprøjt en 5 mg / kg dosis af carprofen subkutant for at undgå smerter. Returnere rotterne til deres bur og give standard rotte laboratorium foder og vand ad libitum.
2.. Trin 2: Abdominal aortaaneurisme Udelukkelse med en koronar PTFE (Polytetrafluoroethylene) Omfattet Stentgraft (dag 15-30)
- Forud for operationen, fortyndes Aspirin 1.000 mg i 1 liter vand. Daily water indtagelse blev estimeret på 10-12 ml/100 g / legemsvægt om dagen.
- Efter anæstesi som tidligere beskrevet, udføre en re-laparotomi omhyggeligt undgå potentielle indre organer adhærerende til bugvæggen. Aneurisme blev defineret af en stigning på 50% i det mindste af aorta sammenlignet proksimale aorta diameter målt under direkte udsyn. Baseret på vores erfaringer, succes rate er 90%, herunder tidlige dødsfald, hovedsagelig på grund aorta burst (upublicerede data)
- Dissekere aorta ved aortaforgreningen og også ved den proximale hals. Aneurisme skulle opstå nogle få millimeter under den venstre nyre vene, hvilket giver en tilfredsstillende længde mellem den distale hals og den distale klemme til indsætning af kateteret, og sutur aorta.
Stentgraft Længden afhænger af aneurisme størrelse. Både proksimale og distale halse bør være dækket af mindst 2 millimeter. - Wrap en dobbelt løkke silke omkring den proximale hals. Klem den proksimale aorta over aneurismen og below venstre nyrearterie, og distalt over aortaforgreningen.
- Udfør en stor aortotomy lige over den tidligere aortotomy at undgå at rive aortavæggen ved indførelsen af stentgraft. Skyl ikke aorta for at bevare integriteten af de trombe. Skub stentgraft mod den proximale klemme. Fjern klemmen er og kontrollere spændingen i silke at tillade graft progression. Tilpas spændingen omkring leverer kateter for at tillade stentgraft progression, indtil den proximale kant af stentgraft når proksimale hals, men også dette vil forhindre massive blødning efter proksimal klemme fjernelse. Ballonen og den proximale ende af den leverende kateteret kan dække de renale arterier, men ikke stentgraft som skal indsættes under de renale arterier.
- Implementer den stentgraft under direkte visuel kontrol ved hjælp af en inflation sprøjte ved 8 atm tryk. Punktere ballonen samtidig stramme silke og fjerne ballonen akslen.
- Vask stentgraft med saltvand. Placer en klemme lige under den distale del af aneurisme, og tæt aorta med afbrudte 10-0 PROLENE suturer.
- Lukke såret, injicere carprofen subkutant og lad dyrene tilbage til deres bur. Giv standard laboratorie chow og vand ad libitum.
3.. Trin 3: Kontrol af Stentgraft Åbenhed (dag 30)
15 dage efter stentgraft indsættelse, udføre en arteriografi at kontrollere graft patency
- Efter anæstesi, udføre en tværgående albue til albue incision. Den venstre fælles halspulsåren er placeret under submandibulære og sublinguale kirtler og under sternocleidomastoideus muskel. 2 cm længde eksponering anbefales.
- Ligere arterien distalt med en silke 4-0. Efter proximal fastspænding, indsætte et 18G kateter retrogradt og sikres med en silke 4-0 passerede to gange rundt om halspulsåren og bundet. En tilstrækkelig længde tillader indsætning og fastgørelse af kateteret værederfor proximale klemme fjernes. Hvis det er svært at afsløre 2cm af arterie, røret, fastspændt efter fyldt med saltvand kan skubbes proksimalt samtidig fjerne den proximale klemme.
- Injicere kontrast gennem kateteret under direkte fluoroskopi. Udfør en stentgraft angiografisk styring til både bekræfte fravær af endolækage der kan resultere i en uhensigtsmæssig indsættelsen af stentgraft, og bekræft stentgraft patency. Dette trin er vigtigt, fordi det store antal sikkerhedsstillelse fartøjer tillade en tilstrækkelig ben perfusion selv med en thrombosed stentgraft. Vi forsøger ikke at udføre duplex ultralyd: Vi postulerer, at stentgraft stålkonstruktion forhindrer korrekt vurdering af stentgraft patency og endolækager.
- Sacrifice rotten ved afblødning i henhold til anbefalingerne 18, og aneurisme, er stentgraft, trombe og aortavæggen høstes til histologiske eller biokemiske undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aneurisme er fastgjort i en paraformaldehydet 4% opløsning i løbet af 24 timer, og derefter ind i en phosphatbufret saltvandsopløsning indtil fiksering i en harpiks blok. Vi bruger en HPS (Hæmatoxylin Phloxin Safran) (Figur 1) farvning, viser healing proliferative celler omkring PTFE (Figur 2). Mesenchymceller derefter karakteriseret ved α-actin-farvning (figur 3).
Figur 1. HPS farvning af aneurismet efter udelukkelse af en 3 mm i diameter dækket stentgraft.
Figur 2. Zoom ind på figur 1 viser en helbredende proces.
d/50740/50740fig3.jpg "alt =" Figur 3 "fo: src =" / files/ftp_upload/50740/50740fig3highres.jpg "fo: content-width =" 4.5in "/>
Figur 3. Histologisk karakterisering af helingsprocessen. Mesenkymceller er brun farvet af α-actin-farvning. PTFE afgrænses ved den røde linje A:. X40, B: x20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
To modeller af AAA er allerede blevet beskrevet i vores lab: xenograft 19 og elastase inducerede modeller 1 Elastase model er den mest ligner menneskelige aortaaneurismer:. En stor omkredsen intraluminal blodprop derefter udelukkes ved endovaskulær aneurisme reparation.
Endolækager er en sædvanlig komplikation af EVAR 14,15. Masser af spørgsmål forbliver uløste: AAA brud er blevet beskrevet med lave endolækager, og undertiden uden aneurismesækken udvidelsen 16. Endolækage er en meget almindelig komplikation efter EVAR, at opretholde en grænseflade mellem cirkulerende blodceller og aneurisme trombosedannelse. Type V endolækager, også kaldet endotension, ikke kun kan forklare aneurismevækst af sig selv 20. Enzymatiske aktivitet kunne være en del af denne komplikation. Animal experimentations, med dækket og udækket stentgraft: opretholdelse af en grænseflade mellem trombe og cirkulerende blod, er nødvendig for at belyse pathobiollogi af disse komplikationer.
Faktisk har kun dækket stentgrafts blevet indsat på vores model. Mange måder at forskning er planlagt til at blive udforsket: implantere ikke omfattet endografts, test af flow divertion materialer berige blodprop aktivitet ved Porphyromonas gingivalis injektioner 21.. Denne model af endovaskulær udelukkelse af en aorta aneurisme er den første beskrevet i litteraturen i små dyr. Vi mener at det er en stor hjælp for en bedre forståelse af udelukkede aneurisme remodeling 22.. Aneurisme stentgraft udelukkelser allerede offentliggøres på større dyr, men med en lavere reproducerbarhed, svært at indse, og tidskrævende 4,5. Rotte elastase aneurisme model er billig og muligt med et par praksis, og med en lav dødelighed 23.
Den største begrænsning i denne model var den høje frekvens af tillukning af blodkar. Den stentgraft eller aorta let thrombose, grundet possible intima skader i løbet stentgraft indføring og blodpropper inde i stentgraft efter indsættelsen. Vask omhyggeligt stentgraft er virkelig vigtigt, før syning aorta. Forebyggende oral aspirin administration startet 5 dage før den anden operation til slutningen af protokollen faldt betydeligt trombose rate, uden signifikant per og post operative blødninger.
Fastspænding induceret blod Stasė aktiverer blodplader, endothelium aktivatorer og neutrofile 24.. Efter 30 minutter 25, neutrofiler og monocyt er allerede aktiveret, kravle og binding til normale endotel, som igen forårsager beskadigelse af endotelet. For en erfaren operatør, total fastspænding varighed spænder fra 15 til 20 min. Vi udforske ikke konsekvenserne af iskæmi på blodprop. Men det er umuligt at implementere stentgraft uden aorta fastspænding. Neutrophil og blodplader aktivering inducerer systemiske ændringer, men kort tid muslingping begrænset, og desværre umuligt at forhindre. Alligevel mener vi, disse ændringer har en begrænset effekt på den biologiske analyse. I betragtning af alle modeller og deres begrænsninger 26, 27, er dette en den første til at åbne dyre eksperimenter efter AAA udstødelse ved stentgrafts.
Nylige undersøgelser viser en betydelig aneurismevækst procent efter endovaskulær i mennesker 28. En præcis analyse af de forskellige stadier af blodprop tilbagetrækning, hypotese valideringer og endograft materiale evaluering kan udføres på denne model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Jeg har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Christine Guesdon (Abbott) for de gaver de Stentgrafts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Wistar rats | aged from 8 to 9 weeks. Weight range from 350 to 400 g | ||
| Instruments | |||
| Isoflurane anesthesic system | 4,5% at the beginning, then 2% | ||
| Penthobarbital | Ceva sante animale, Libourne, France | ||
| Dissection stereomicroscope | |||
| Steriles gloves | |||
| Microsurgical Steriles instruments | Moria, Antony, France | Needle holder, Forceps, Scissors,Gilbert approximator o 3 Micro clamps | |
| N °40 Silk string | |||
| Prolen 9-0 and 10-0 | Ethicon, Johnson Johnson, Auneau, France | ||
| Heat-tapered polyethylene tubing | PE 10 | ||
| Syringe infusion pump | |||
| Porcine pancreatic elastase | Sigma, St. Louis, Mo., USA | 550 μl of salin is mixed with 175 μl of elastase | |
| Indeflator | |||
| 9 to 16 mm length, 3 mm diameter coronary PTFE covered stentgraft | Abbott, Abbott Park, Illinois, USA | ||
| C-Arm –C 9800 | GE Medical Systems, Milwaukee, WI | ||
| Aspegic 1000 mg | Aspirin, Sanofi-Aventis, Paris, France | ||
| Reagent | |||
| Aerane isoflurane 100ML | Baxter | Aerane | |
| Penthobarbital | Centravet | 053pen203 | |
| Silk Suture 4-0 | Fine Science | 18020-40 | |
| Microsurgical steriles instruments | Moria | 9980-9983-9987-204/A-204/D-8148-4877A-4878A | |
| Prolen 9-0 and 10-0 | Ethicon | W2829 – NS2850 | |
| Heat tapered Polyethylene tubing : PE 10 | Bioseb | MRE-010 | |
| Infusion pump | World precision instrument | AL-1000 | |
| Porcine pancreatic elastase | Sigma | E1250-100MG | |
| Indeflator | Longreal | KY025 25 100 | |
| Aspegic 1000mg (Aspirin) | Sanofi-Aventis | 3400931898191 | |
| C-Arm –C 9800 | General electric. | OEC 9800 | |
| Stentgraft : Jostent | Abbott | 210CG1230 210CG1630 |
|
References
- Anidjar, S., et al.
- Azuma, J., Asagami, T., Dalman, R., Tsao, P. S. Creation of murine experimental abdominal aortic aneurysms with elastase. J. Vis. Exp. (29), e1280 (2009).
- Parodi, J. C., Palmaz, J. C., Barone, H. D. Transfemoral intraluminal graft implantation for abdominal aortic aneurysms. Ann. Vasc. Surg. 5, 491-499 (1991).
- The Vascular Society of Great Britain and Ireland. The nationalvascular database report, 2009. Lees, T., Stansby, G. , (2012).
- Sakalihasan, N., Limet, R., Defawe, O. D.
- Busuttil, R. W., Abou-Zamzam, A. M., Machleder, H. I. Collagenase activity of the human aorta. A comparison of patients with and without abdominal aortic aneurysms. Arch. Surg. 115, 1373-1378 (1980).
- Michel, J. B. Contrasting outcomes of atheroma evolution: intimal accumulation versus medial destruction. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 21, 1389-1392 (2001).
- Vorp, D. A., et al. Association of intraluminal thrombus in abdominal aortic aneurysm with local hypoxia and wall weakening. J. Vasc. Surg. 34, 291-299 (2001).
- Kazi, M., et al. Influence of intraluminal thrombus on structural and cellular composition of abdominal aortic aneurysm wall. J. Vasc. Surg. 38, 1283-1292 (2003).
- Kuijper, P. H., et al. Neutrophil adhesion to fibrinogen and fibrin under flow conditions is diminished by activation and L-selectin shedding. Blood. 89, 2131-2138 (1997).
- Touat, Z., et al. Renewal of mural thrombus releases plasma markers and is involved in aortic abdominal aneurysm evolution. Am. J. Pathol. 168, 1022-1030 (2006).
- Fontaine, V., et al. Role of leukocyte elastase in preventing cellular re-colonization of the mural thrombus. Am. J. Pathol. 164, 2077-2087 (2004).
- Sakalihasan, N., Delvenne, P., Nusgens, B. V., Limet, R., Lapiere, C. M. Activated forms of MMP2 and MMP9 in abdominal aortic aneurysms. J. Vasc. Surg. 24, 127-133 (1996).
- Alsac, J. M., et al. The significance of endoleaks in thoracic endovascular aneurysm repair. Ann. Vasc. Surg. 25, 345-351 (2011).
- Buth, J., Harris, P. L., van Marrewijk, C., Fransen, G. The significance and management of different types of endoleaks. Semin. Vasc. Surg. 16, 95-102 (2003).
- Fransen, G. A., et al. Rupture of infra-renal aortic aneurysm after endovascular repair: a series from EUROSTAR registry. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 26, 487-493 (2003).
- van der Vaart, M. G., et al. Application of PET/SPECT imaging in vascular disease. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 35, 507-513 (2008).
- Close, B., et al. Recommendations for euthanasia of experimental animals: Part 2. DGXT of the European Commission. Lab. Anim. 31, 1-32 (1997).
- Allaire, E., Guettier, C., Bruneval, P., Plissonnier, D., Michel, J. B. Cell-free arterial grafts: morphologic characteristics of aortic isografts, allografts, and xenografts in rats. J. Vasc. Surg. 19, 446-456 (1994).
- Gawenda, M., Jaschke, G., Winter, S., Wassmer, G., Brunkwall, J. Endotension as a result of pressure transmission through the graft following endovascular aneurysm repair--an in vitro study. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 26, 501-505 (2003).
- Delbosc, S., et al. Porphyromonas gingivalis Participates in Pathogenesis of Human Abdominal Aortic Aneurysm by Neutrophil Activation. Proof of Concept in Rats. PLoS One. 6, e18679 (2011).
- Trollope, A., Moxon, J. V., Moran, C. S., Golledge, J. Animal models of abdominal aortic aneurysm and their role in furthering management of human disease. Cardiovasc Pathol. 20, 114-123 (2011).
- Yamaguchi, T., et al. Factors influencing mortality in the rat elastase-induced-aneurysm model. J. Surg. Res. 94, 81-83 (2000).
- von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J. Exp. Med. 209, 819-835 (2012).
- Smith, P. D. Neutrophil activation and mediators of inflammation in chronic venous insufficiency. J. Vasc. Res. 36, Suppl 1. 24-36 (1999).
- Zaragoza, C., et al.
- Kuivaniemi, H., Elmore, J. R. Opportunities in abdominal aortic aneurysm research: epidemiology, genetics, and pathophysiology. Ann. Vasc. Surg. 26 (12), 862-870 (2012).
- Schanzer, A., et al. Predictors of abdominal aortic aneurysm sac enlargement after endovascular repair. Circulation. 123, 2848-2855 (2011).
