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Immunology and Infection

अलगाव और अनुभवहीन सीडी 4 टी lymphocytes की Th17 भेदभाव

Published: September 26, 2013 doi: 10.3791/50765
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Cell Science, The University of Florida
* These authors contributed equally

Summary

अन्य टी सेल सबसेट से अलग प्रेरक कार्यों के साथ, Th17 कोशिकाओं केंद्रीय भड़काऊ autoimmunity में फंसाया गया है. यह इन विट्रो Th17 भेदभाव प्रोटोकॉल भोले सीडी 4 + टी lymphocytes Th17 कोशिकाओं में अंतर कर सकते हैं, और आगे औतोइम्मुिनित मेजबान प्रतिक्रिया में उनकी भूमिका की जांच करने के लिए तय है कि एक साधन प्रदान करता है.

Abstract

Th17 कोशिकाओं 17 (आईएल -17) इंटरल्यूकिन उत्पादन पाया गया है कि टी कोशिकाओं की एक विशिष्ट सबसेट हैं, और TH1, Th2, और विनियामक टी कोशिकाओं सहित अन्य टी सेल सबसेट से समारोह में मतभेद है. Th17 कोशिकाओं कई autoimmune विकारों के साथ जुड़े अति उत्साही भड़काऊ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक केंद्रीय अपराधी के रूप में उभरा है. इस विधि में हम C57BL 6 / चूहों की तिल्ली और लिम्फ नोड्स से टी lymphocytes शुद्ध, और नियंत्रण और Th17 उत्प्रेरण वातावरण के तहत शुद्ध सीडी 4 + टी कोशिकाओं को उत्तेजित. Th17 उत्प्रेरण पर्यावरण विरोधी CD3 और विरोधी CD28 एंटीबॉडी, आईएल -6, और TGF-β की उपस्थिति में उत्तेजना भी शामिल है. कम से कम 72 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद और 37 डिग्री सेल्सियस के ऊपर से पांच दिनों के लिए, कोशिकाओं बाद cytometry, qPCR, और ELISAs प्रवाह के माध्यम से आईएल -17 का उत्पादन करने की क्षमता के लिए विश्लेषण कर रहे हैं. Th17 भेदभाव सीडी 4 + CD25-टी कोशिकाओं आगे Th17 कोशिकाओं औतोइम्मुिनित मेजबान डे की शुरुआत प्रगति में खेलने उस भूमिका को स्पष्ट करने के लिए उपयोग किया जा सकता हैfense. इसके अलावा, अलग murine पीटकर / रोग मॉडल से सीडी 4 + CD25 लिम्फोसाइटों की Th17 भेदभाव सेल भाग्य plasticity की हमारी समझ के लिए योगदान कर सकते हैं.

Introduction

सीडी 4 + टी lymphocytes (टी कोशिकाओं) संक्रामक सूक्ष्मजीवों के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रणाली की मध्यस्थता रक्षा करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. इसके विपरीत, टी कोशिकाओं को भी परिचित टाइप 1 मधुमेह, प्रणालीगत एक प्रकार का वृक्ष, और रुमेटी गठिया जैसे autoimmune रोग की शुरुआत प्रगति के साथ जुड़े रहे हैं. सीडी 4 + टी lymphocytes टी सेल रिसेप्टर आत्मीय प्रतिजन / प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल द्वितीय (MHCII) अणुओं के साथ (TCR) वार्तालाप का एक संयोजन के माध्यम से सक्रिय हो जाते हैं, और B7.1/B7.2 साथ CD28 रिसेप्टर बातचीत 15 ligands. TCR उत्तेजना और CD28 सह उत्तेजना के प्रावधान के अलावा, प्रतिजन कोशिकाओं पेश भी इस तरह दिया प्रतिजन के लिए टी लिम्फोसाइट की प्रतिक्रिया निर्देशन, टी लिम्फोसाइट का भेदभाव राज्य निर्धारित करता है जो एक साइटोकाइन वातावरण प्रदान करते हैं. अलग रोगज़नक़ / प्रतिजन पेश सेल बातचीत टी एली पर ध्यान केंद्रित अलग रास्ते नीचे लिम्फोसाइटों तिरछा जो अलग साइटोकाइन वातावरण बनाने के लिए,की शुरुआत रोगज़नक़ की mination. दुर्भाग्य से, मूल रूप से रोगजनकों हमलावर उन्मूलन करने के लिए डिजाइन टी लिम्फोसाइट प्रेरक रास्ते,, ग़लती से आत्म ऊतकों 15 के खिलाफ निर्देशित किया जा सकता है. इसलिए, प्रत्येक विशिष्ट सीडी 4 + टी सेल सबसेट के भेदभाव राज्य की बेहतर समझ रोगजनकों के उन्मूलन और स्वयं के लिए सहिष्णुता के बीच संतुलन को व्यवस्थित करना कैसे के बारे में हमारी समझ के लिए महत्वपूर्ण है.

TH1, Th2, और inducible विनियामक टी सेल भेदभाव रास्ते के अलावा, भोले टी lymphocytes भी Th17 मार्ग नीचे साइटोकिन्स के द्वारा संचालित किया जा सकता है. TH1 कोशिकाओं मुकाबला intracellular रोगज़नक़ों जबकि, Th2 कोशिकाओं कोशिकी रोगजनकों समाप्त करने, और विनियामक टी कोशिकाओं (Tregs) भड़काऊ प्रतिक्रियाओं 1, 16 को कम; Th17 कोशिकाओं कोशिकी बैक्टीरिया और कवक के उन्मूलन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. Th17 कोशिकाओं आम तौर पर वंश विशेष प्रतिलेखन कारक RORγT और आईएल के उत्पादन की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित हैंमैक्रोफेज और neutrophils 1, 7 की सक्रियता को बढ़ावा देता है जो-17A,.

Th17 कोशिकाओं कई autoimmune विकारों में फंसा, और उनके संबद्ध कृंतक मॉडल किया गया है. उदाहरण के लिए, यह आईएल -23 (Th17 phenotype बनाए रखने के लिए आवश्यक है), जो कि प्रदर्शन किया गया है, लेकिन नहीं आईएल -12, प्रयोगात्मक autoimmune इन्सेफेलाइटिस (EAE) में केंद्रीय अपराधी था, एमएस के लिए कृंतक रोग मॉडल. यह बाद में आईएल -17 उत्पादन में कटौती EAE रोकथाम 2, 6, 17 को सहसंबद्ध होते हैं कि दिखाया गया है. इसके अलावा, Th17 कोशिकाओं गठिया और प्रणालीगत एक प्रकार का वृक्ष erythematosus (SLE) 10, 16 सहित अन्य autoimmune विकारों के साथ संबद्ध किया गया है. आईएल 23 की कमी p19 - / - चूहों Th17 कोशिकाओं की बहुत कम संख्या है दिखाया, और EAE न केवल विकसित करने के लिए प्रतिरोधी रहे थे, लेकिन यह भी कोलेजन प्रेरित गठिया, संधिशोथ 10, 18 के लिए एक मॉडल. इसके अलावा, चूहों पीछे आईएल 17A एंटीबॉडी को निष्क्रिय करने के साथ इलाजएर कोलेजन प्रेरित गठिया की शुरुआत भी संयुक्त नुकसान 18 के संकल्प है पाया गया. यह हाल ही में शोध भी टाइप 1 मधुमेह 9, 11 और आंतों में सूजन 14 में Th17 कोशिकाओं की एक सुरक्षात्मक भूमिका दिखाया गया है जैसे autoimmune रोग की प्रगति में Th17 कोशिकाओं की भूमिका की विशेषता जाना बना रहता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. इन अध्ययनों autoimmunity में Th17 भेदभाव के महत्व की पुष्टि करें.

1) कैसे ठीक आईएल -6 Treg और Th17 भेदभाव के बीच संतुलन को विनियमित करता है, और 2) सटीक तंत्र क्या कर रहे हैं: आगे की जांच पड़ताल की आवश्यकता है कि कम से कम दो हैरान करनेवाला सवाल कर रहे हैं क्योंकि इन विट्रो Th17 भेदभाव में टी सेल अनुसंधान में एक आवश्यक तरीका है आईएल -17 प्रेरित भड़काऊ विकारों के पीछे? हमारे विधि C57BL 6 / माउस के spleens और लिम्फ नोड्स से सीडी 4 + CD25-टी कोशिकाओं को रोजगार. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि यह एक अशुद्ध का उपयोग Th17 भेदभाव उत्पन्न करने के लिए संभव है, हालांकिआबादी, कम से कम एक 80% शुद्ध सीडी 4 + CD25-टी सेल की आबादी प्राप्त संदूषण की कोई चिंता नकारती और अधिक सफल Th17 भेदभाव परिणाम सुनिश्चित करता है. उचित Th17 भेदभाव को प्राप्त करने के लिए, सीडी 4 + CD25-टी कोशिकाओं क्रमशः विरोधी CD3 और विरोधी CD28, सक्रियण संकेतों प्रदान है, जो 1 और 2, की उपस्थिति में incubated हैं, और आईएल -6, और TGF-β. यह आईएल -23 अकेले Th17 भेदभाव को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है बताया गया है कि हालांकि, यह बाद में आईएल -23 Th17 सेल जनसंख्या की स्थिरता के लिए आवश्यक है कि प्रदर्शन किया गया, लेकिन आईएल -6 और TGF-β Th17 भेदभाव के लिए आवश्यक हैं 3, 18, ​​19. Murine पढ़ाई आईएल -23 रिसेप्टर वे आईएल -6 और TGF-β 13, 18 के साथ प्रेरित किया गया है के बाद ही सीडी 4 + टी कोशिकाओं पर व्यक्त की है कि पता चला है. इसके अलावा, Th17 कोशिकाओं सफलतापूर्वक के रूप में लंबे आईएल -6 और TGF-β 18, 19 में मौजूद हैं आईएल -23 अवरुद्ध एंटीबॉडी की उपस्थिति में विकास होगा. जैसे, इस Th17 भेदभाव प्रोटोकॉल Provसफलतापूर्वक Th17 भेदभाव प्रेरित करने के लिए उपयुक्त परिस्थितियों इडस. Autoimmune विकार 13 के उद्देश्य से बेहतर चिकित्सा विज्ञान के विकास के लिए अवसर मौजूद Th17 भेदभाव और आईएल -17 उत्पादन अंतर्निहित तंत्र की एक बेहतर समझ का विकास.

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Protocol

सभी पशु प्रयोग संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार आयोजित किया गया था.

1. घोला जा सकता है और मीडिया की तैयारी

  1. बाँझ पीबीएस पीएच: 7.3 (1 एल)
    0.23 जी नाह 2 पीओ 4
    1.15 जी ना 2 4 HPO
    9.0 छ NaCl
    डि पानी के साथ मात्रा को ले लो. आटोक्लेव साथ बाँझ.
  2. सेल संस्कृति मीडिया (100 मिलीलीटर)
    89 मिलीलीटर RPMI
    10 मिलीलीटर 10% FBS
    1 मिलीग्राम एंटीबायोटिक कवकनाशी (ABAM) 100 ग्राम 50 मिमी 2-mercaptoethanol (96.5 ग्राम पीबीएस में 3.5 माइक्रोग्राम शेयर 2-mercaptoethanol)
  3. बाँझ पीबीएस में FACS बफर (फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई) (फ्लो के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता है) 2% FBS
  4. iTh17 मिक्स (नमूनों की संख्या के आधार पर, सभी घोला जा सकता है और मीडिया के लिए आवश्यक मात्रा का निर्धारण)
    1.5 माइक्रोग्राम / एमएल विरोधी CD28
    20 एनजी / एमएल आईएल -6
    5 एनजी / एमएलTGF-β

2. प्रकोष्ठों निम्नलिखित शर्तों के तहत तीन प्रतियों में चढ़ाया जाएगा

  1. विरोधी CD3 बाध्य प्लेट, विरोधी CD28 (इस सक्रियण नियंत्रण मिश्रण है).
  2. iTH17: थाली विरोधी CD3 बाध्य, विरोधी CD28, आईएल -6, TGF-β.

3. प्लेट बाध्य विरोधी CD3 (10 माइक्रोग्राम / एमएल)

यह थाली बाध्य विरोधी CD3 प्लेटों की तैयारी से पहले कोशिकाओं प्लेटों के लिए जोड़ दिया जाएगा समय के लिए कम से कम 4 घंटे किया जाता है की सिफारिश की है.

  1. वेल्स के लिए 30 μl विरोधी CD3 नया 96 अच्छी तरह से यू नीचे MicroTest टिशू कल्चर प्लेट के (विरोधी CD3 बाँझ पीबीएस में पतला है), और कुओं की वर्दी कवरेज सुनिश्चित करने के लिए थाली के पक्षों को टैप करें. यह प्लेट के लिए घोला जा सकता है और कोशिकाओं को जोड़ने के लिए समय है, जब तक ठण्डा तो 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, और.

4. माउस विच्छेदन

  1. इस प्रोटोकॉल C57BL 6 / mic के उपयोग पर आधारित हैई, 3-8 उम्र के महीने, और जैक्सन प्रयोगशाला (बार हार्बर, इ) से खरीदा.
  2. सीओ 2 asphyxiation का उपयोग माउस बलिदान, और बाद में गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के साथ मौत की पुष्टि.
  3. 70% इथेनॉल के साथ चूहों विच्छेदन उपकरण और चीरा क्षेत्र जीवाणुरहित और विच्छेदन शुरू करते हैं.
  4. उदर देखने से, मूत्रमार्ग खोलने के लिए पूर्वकाल है कि त्वचा को पकड़ो और ठोड़ी क्षेत्र तक पहुँचने तक कैंची से उदर midline काटने लगते हैं. सावधानियों आंसू या पेरिटोनियल दीवार के अंदरूनी हिस्से में कटौती करने के लिए नहीं ले लो.
  5. त्वचा पर वापस खींचो और हटाने के दौरान लिम्फ नोड्स के लिए सहज पहुँच अनुमति देने के लिए नीचे पिन.
  6. एकत्र लिम्फ नोड्स और spleens सभी संदंश के साथ हटा दिया, और बफर (लिम्फ नोड और तिल्ली हटाने चित्र के लिए आंकड़े 2 और 3 को देखें) Miltenyi बायोटेक से खरीदा रनिंग autoMACS के 5 मिलीलीटर युक्त एक बाँझ पेट्री डिश में रखा जाएगा.
    1. हैं कि कक्षा लिम्फ नोड्स निकालेंप्रत्येक माउस का कवच की मांसपेशियों के पीछे कांख (बगल) के पास पाया.
    2. प्रत्येक बगल के निकट स्थित संयोजी ऊतक में स्थित हैं कि बाहु लिम्फ नोड्स निकालें.
    3. प्रत्येक माउस की गर्दन में पाया सतही ग्रीवा लिम्फ नोड्स निकालें.
    4. 3 रक्त वाहिकाओं के संयोजन के रूप में कूल्हे क्षेत्र में स्थित हैं जो वंक्षण लिम्फ नोड्स निकालें.
    5. पेरिटोनियल अस्तर ऊपर उदर midline के माध्यम से कट mesenteric लिम्फ नोड्स, का उपयोग करने के लिए. Mesenteric लिम्फ नोड्स आंतों एक साथ रखती है कि संयोजी ऊतक में पाया जाता है. वे आम तौर पर 4-8 नोड्स के एक स्ट्रिंग में पाए जाते हैं, और एक "मोती की स्ट्रिंग" के रूप में प्रकट हो सकता है. पूरे स्ट्रिंग बाहर खींचने के लिए सुनिश्चित करें.
    6. तिल्ली पेट और आंतों के पीछे, पेट क्षेत्र में स्थित है. अग्न्याशय से इसे खींच और detaching से हटा दें.
  7. 2 पाले सेओढ़ लिया माइक्रोस्कोप स्लाइड्स का उपयोग कर एक बाँझ हुड के तहत अंगों पीस. लिम्फ नोड्स या तिल्ली पर रखेंविघटित जब तक दूसरा स्लाइड के तुहिनाच्छादित पक्ष के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड, और रगड़ के तुहिनाच्छादित ओर. सभी लिम्फ नोड्स और तिल्ली की गई जमीन है जब तक दोहराएँ.

नोट: रक्त यह मुश्किल autoMACS बफर में शेष लिम्फ नोड्स को देखने के लिए कर देगा, क्योंकि यह लिम्फ नोड्स के साथ शुरू और तिल्ली के साथ खत्म करने की सिफारिश की है.

  1. एक एकल कक्ष निलंबन में जमीन अंगों को फिल्टर करने के लिए, 40 माइक्रोन नायलॉन का एक टुकड़ा से अधिक सामग्री कई बार तह, और एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के शीर्ष में रखकर शुरू करते हैं. नायलॉन सामग्री लगभग 3 एक्स 3 अंदर होना चाहिए
  2. बफर और जमीन अंगों रनिंग autoMACS के 5 एमएल निकालना एक 5 मिलीलीटर सिरिंज और 21 जी सुई का प्रयोग करें. मुड़ा हुआ नायलॉन सामग्री में धीरे बांटना. सुई के साथ सामग्री puncturing से बचने के लिए ध्यान रखना.

नोट: एकल कक्ष निलंबन हासिल हो जाने के बाद, समाधान visib कोई साथ एक पीला, सुसंगत समाधान के रूप में प्रकट होना चाहिएठोस ऊतक की Le टुकड़े. ठोस, फिर से महाप्राण रहते हैं और एक नया 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखा नायलॉन का एक नया मुड़ा हुआ टुकड़ा के माध्यम से बांटना है.

  1. जब उपयोग में नहीं है हमेशा बर्फ पर कोशिकाओं रहते हैं.

5. सेल जुदाई

  1. इष्टतम परिणामों के लिए, एमएसीएस सीडी 4 + CD25 + विनियामक टी सेल अलगाव किट, माउस का उपयोग autoMACS प्रो विभाजक सेल के माध्यम से कम से कम एक 80% शुद्ध सीडी 4 + CD25 सेल जनसंख्या प्राप्त करते हैं. सीडी 4 + CD25 सेल आबादी के नकारात्मक बनाए रखने के लिए प्रोटोकॉल Miltenyi बायोटेक के माध्यम से प्राप्त किया जाता है.

6. Th17 भेदभाव

  1. AutoMACS प्रो सेल सेपरेटर के साथ अलगाव के बाद सीडी 4 + CD25 सेल आबादी लीजिए.
  2. एक hemocytometer का उपयोग trypan नीले रंग के साथ एक 1:1000 अनुपात में पतला कोशिकाओं की गणना.
  3. एकाग्रता कोशिकाओं की गिनती से निर्धारित किया गया है, सेल संस्कृति मीडिया में 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल सेल निलंबन पतला.
  4. 4 घंटा बाद विरोधी CD3 बाध्य थाली के साथ 96 अच्छी तरह प्लेटें बाहर ले जाओ.
  5. पीबीएस के 200 μl के साथ विरोधी CD3 लेपित कुओं को धो लें. 2 बार दोहराएँ.
    1. धोने के लिए विरोधी CD3 लिपटे वेल्स को बाँझ पीबीएस के 200 μl जोड़ने और बर्बादी कंटेनर में पीबीएस हटा दें.
  6. तीन प्रतियों में वेल्स को iTh17 मिश्रण या सक्रियण नियंत्रण मिश्रण के 100 μl (प्वाइंट # 2 देखें) जोड़ें.
  7. प्रत्येक अच्छी तरह से Th17 मिश्रण या सक्रियण नियंत्रण मिश्रण या तो रखा गया है, जिसमें को कोशिकाओं के 100 μl जोड़ें.
  8. कम से कम 72 घंटे के लिए या 5 दिनों के लिए कोशिकाओं को सेते (Th17 भेदभाव 72 घंटे के बाद या 5 दिनों के बाद प्राप्त किया जा सकता है.)
  9. Th17 भेदभाव intracellular धुंधला और प्रवाह cytometric विश्लेषण, एलिसा, या qPCR द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है

7. सेल सक्रियण (केवल आवश्यक Intracellular धुंधला के लिए)

  1. 72 घंटा या 5 दिन या तो के अंत में इन्क्यूबेटरों से 96 अच्छी तरह प्लेटें निकालें
    1. याद है कि Th17 differentiatioN 72 घंटा या 5 दिन या तो के बाद हासिल किया जा सकता है.
  2. प्रत्येक हालत (जैसे सक्रियण नियंत्रण या iTh17) के लिए, एक 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली में से एक कुएँ में तीन प्रतियों में हैं कि कोशिकाओं को हस्तांतरण. 96 अच्छी तरह से यू नीचे संस्कृति थाली में तीन प्रतियों में किया जा रहा करने के लिए विरोध के रूप में एक शर्त के लिए कोशिकाओं को अब, 24 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में से एक कुएं में जमा किया गया है.
  3. 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली में एक अच्छी तरह से कुल मात्रा अब 600 μl है. अच्छी तरह से सेल संस्कृति मीडिया के साथ 1 मिलीलीटर प्रत्येक की मात्रा बढ़ाएं.
  4. (1 माइक्रोन) ionomycin, पीएमए (phorbol myristate एसीटेट) (50 एनजी / एमएल) जोड़ें, और बीएफए (Brefeldin-ए) (10 माइक्रोग्राम / एमएल) सूचीबद्ध सांद्रता में 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली में अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए.
  5. 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.

8. Intracellular धुंधला

  1. प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए वांछित बाह्य और intracellular मार्कर के साथ दाग कोशिकाओं. उपस्थिति ओ का पता लगाने के लिएच आईएल -17, intracellular धुंधला विरोधी आईएल 17A एंटीबॉडी के साथ किया जाता है. अनुशंसित बाह्य सतह मार्कर सीडी 4, सीडी 8, और CD25 शामिल हैं.
    1. आईएल -17 Intracellular धुंधला के लिए बी.डी. बायोसाइंस से Intracellular Cytokine धुंधला स्टार्टर किट माउस का प्रयोग करें.
    2. प्रत्येक नमूना के लिए, गोली कोशिकाओं, सतह पर तैरनेवाला हटाने, और 200 μl FACS बफर (पीबीएस में 2% FBS) में resuspend सेल गोली.
    3. थाली cytometry 96 सेल प्रवाह को resuspended कोशिकाओं स्थानांतरण.
    4. 1,200 rpm पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं नीचे स्पिन और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
    5. 1,200 rpm पर 5 मिनट के लिए 200 μl पीबीएस FACS बफर, अपकेंद्रित्र जोड़ें, और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
    6. FACS के 100 μl में Resuspend कोशिकाओं बफर और बाह्य एंटीबॉडी के 100 μl (अब) मिश्रण (बाह्य अब मिश्रण FACS बफर में किया जाता है) लागू होते हैं. पन्नी के साथ कवर आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
    7. कदम 8.1.4 दोहराएँ.
    8. दोहराएँ कदम 8.1.5 2x.
    9. बी.डी. Cytofix / Cytoperm बफर के 100 μl में कोशिकाओं Resuspend. Incubपन्नी के साथ कवर आरटी पर 20 मिनट के लिए खा लिया.
    10. 1x बी.डी. पेर्म / धो बफर के 100 μl जोड़ें, 1200 rpm पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. दोहराएँ.
    11. Intracellular अब मिश्रण की 50 μl जोड़ें. पन्नी के साथ कवर किया, आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते (intracellular अब मिश्रण 1x बी.डी. पेर्म / धो में किया जाता है).
    12. कदम 8.1.10 दोहराएँ.
    13. बी.डी. धुंधला बफर के 200 μl में कोशिकाओं Resuspend.
    14. 200 μl बी.डी. धुंधला बफर (अंतिम मात्रा 400 μl है) युक्त ट्यूब प्रवाह cytometry में resuspended कोशिकाओं रखें.
    15. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर नमूनों पढ़ा जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं जब तक.

9. प्रवाह cytometric विश्लेषण

  1. गेट लाइव सेल की आबादी.
  2. लाइव सेल की आबादी से, सीडी 4 + सीडी 8-आबादी पर गेट.
  3. सीडी 4 + सीडी 8-आबादी से, आईएल 17A + आबादी पर गेट.
    1. हमारे पिछले प्रयोगात्मक परिणामों के आधार पर, आईएल 17A + आबादी के लिए 100% CD25 + हो जाएगा.

* कुल निरपेक्ष कोशिकाओं की गिनती नमूना triplicates पूलिंग के बाद प्राप्त किया गया
** सीडी 4 + CD25 + आईएल 17A + कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या लाइव गेट प्रतिशत और वंश विशेष मार्कर, सीडी 4, CD25, और आईएल 17A असर कुल कोशिकाओं के प्रतिशत के आधार पर कोशिकाओं की कुल संख्या बढ़ रूप से निर्धारित किया गया था फ्लो द्वारा निर्धारित की.

10. qPCR और एलिसा

  1. जगह कोशिकाओं 5-10 मिनट के लिए 13,000 rpm पर एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब और अपकेंद्रित्र में प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए इस्तेमाल नहीं. Centrifugation के बाद सेल गोली में पाया कोशिकाओं qPCR विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. qPCR विश्लेषण पीटीसी-200 Peltier थर्मल cycler (BioRad) का उपयोग किया गया था.
  2. ELISAs के लिए centrifuged ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला लीजिए. आईएल 17A ELISAs एंटीबॉडी जोड़ी TC11-18H10 (कब्जा, सूची संख्या 555,068) का उपयोग किया जाता है और TC11-8H4 बायोटिन (पहचान, सूची संख्या 555067) बी.डी. बायोसाइंसेज से खरीदे गए थे. आईएल 17A एलिसा स्टेशनndards eBioscience (सूची संख्या 14-8171-80) से प्राप्त किया गया.
  3. सतह पर तैरनेवाला हटाने के बाद, (बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर शाही सेना निकासी, सीडीएनए संश्लेषण, और qPCR, या दुकान के लिए तुरंत उपयोग) 175 μl शाही सेना lysis बफर में qPCR के लिए प्रयोग की जाने वाली शेष कोशिकाओं resuspend.
    1. आईएल 17A और actin (हाउस कीपिंग जीन) के लिए प्राइमर दृश्यों के लिए तालिका II का संदर्भ लें

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Representative Results

इस Th17 भेदभाव प्रोटोकॉल तिल्ली के हटाने और कक्षा, बाहु, mesenteric, गर्भाशय ग्रीवा, और वंक्षण लिम्फ नोड्स के साथ शुरू होता है. प्रत्येक के स्थानों का प्रतिनिधित्व के आंकड़े 2 और 3 में पाया जा सकता है. आंकड़े 1 और 5 दोनों इस प्रोटोकॉल में वर्णित तरीकों का एक दृश्य प्रतिनिधित्व प्रदान करते हैं.

इस Th17 प्रोटोकॉल सीडी 4 + CD25-टी लिम्फोसाइट आबादी से भेदभाव पर केंद्रित है. यह autoMACS प्रो सेल जुदाई जमा कुल लिम्फ नोड और तिल्ली (चित्रा 4) से हमारे वांछित सीडी 4 + CD25-आबादी को समृद्ध कैसे कुशलतापूर्वक नोट करना महत्वपूर्ण है. unfractionated जमा लिम्फ नोड और splenocytes, और autoMACS से पृथक भिन्न प्रवाह cytometric विश्लेषण (चित्रा 4) के बाद antiCD4 और antiCD25 एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे. चित्रा -4 ए सीडी 4 + CD25 + का प्रतिशत के एक प्रतिनिधि के प्रोफाइल से पता चलता हैऔर सीडी 4 फ्लो द्वारा unfractionated जमा लिम्फ नोड्स और तिल्ली में मौजूद + CD25 लिम्फोसाइटों. अलगाव की प्रक्रिया भी अतिरिक्त प्रयोगों (चित्रा 4 बी) में इस्तेमाल किया जा सकता है जो C57BL 6 / चूहों से एक समृद्ध सीडी 4 + CD25 + Treg आबादी प्रदान करता है. चित्रा 4C 84% सीडी 4 + CD25-टी कोशिकाओं है कि एक बड़ी आबादी के साथ हमारे वांछित सेल संवर्धन से पता चलता है, सीडी 4 + CD25 + Tregs के विशाल बहुमत निकाल दिया साथ. हम लगातार समृद्ध सीडी 4 + में मौजूद है कि एक छोटे गैर lymphoid सेल की आबादी है CD25-, लेकिन यह भेदभाव प्रक्रिया (चित्रा 4C) के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है. हमारी समृद्ध सीडी 4 + CD25-टी सेल की आबादी एक अधिक सफल Th17 भेदभाव को आश्वस्त करने में मदद करता है.

चित्रा 5 हमारे Th17 भेदभाव प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध दिखाता है. हमारी समृद्ध सीडी 4 + CD25-आबादी Th17 फर्क परिस्थितियों में incubated है या तो (विरोधी CD3, विरोधी CD28, आईएल -6, और TGF-β) या नियंत्रण (विरोधी CD3, विरोधी CD28). यह जबकि CD25 + टी लिम्फोसाइट झुकेंगे 5 दिन, Th17 उत्प्रेरण परिस्थितियों में ऊष्मायन के लिए विरोधी CD3, विरोधी CD28 के साथ सीडी 4 + CD25-टी लिम्फोसाइट की ऊष्मायन IL17 सीडी 4 + CD25 + लिम्फोसाइटों उत्पादन का एक सबसेट झुकेंगे कि चित्रा 6 में देखा जा सकता है. ITh17 शर्तों के तहत 5 दिन ऊष्मायन के बाद पूर्ण सेल नंबर पैदावार + सीडी 4 + CD25 + आईएल 17A के उदाहरण के लिए 1 टेबल को देखें.

Th17 भेदभाव स्थिति आगे मात्रात्मक पीसीआर और एलिसा के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है. नियंत्रण या Th17 उत्प्रेरण परिस्थितियों में incubated समृद्ध सीडी 4 + CD25-टी लिम्फोसाइट से 7 प्रस्तुत डेटा चित्रा. Th17 परिस्थितियों में incubated सीडी 4 + CD25-टी लिम्फोसाइट qPCR (चित्रा 7A) और एलिसा (चित्रा 7B) के माध्यम से पता लगाया जा सकता है जो IL17A, ऊपर से विनियमित. Th17 विशिष्ट प्रतिलेखन कारक RORγT भी Th17 उत्प्रेरण परिस्थितियों में incubated सीडी 4 + CD25-टी कोशिकाओं द्वारा upregulated है, और thr पता लगाया जा सकता हैough qPCR (चित्रा 7A).

चित्रा 1
चित्रा 1. Th17 भेदभाव योजनाबद्ध. 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में विरोधी CD3 पीबीएस में पतला (10 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ यू तली 96 अच्छी तरह से थाली के 1. कोट कुओं. 2. प्लेस थाली थाली incubating है, यह माउस से लिम्फ नोड्स (एल एन) और तिल्ली काटना. अंगों पीस और एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए फिल्टर. सीडी 4 + CD25 + विनियामक टी सेल अलगाव किट और Miltenyi autoMACS प्रो विभाजक का उपयोग सीडी 4 + CD25-टी कोशिकाओं को अलग. सीडी 4 + CD25 कोशिकाओं 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल पतला होना चाहिए. 3. एक बार 96 अच्छी तरह से थाली की 4 घंटा ऊष्मायन पूरा हो गया है, पीबीएस (200 μl / अच्छी तरह से) 3x. 4 के साथ कुओं धो लो. 100 μl सीडी 4 + जोड़ें CD25-टी कोशिकाओं को (पंजाब) विरोधी CD3 लेपित कुओं. 5 थाली बाध्य. 100 μl विरोधी CD28 या 100 μl iTh17 Coc जोड़ेंktail (antiCD28, TGF-β, और आईएल -6). 6. 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 या 5 दिनों के लिए थाली सेते निम्नलिखित ऊष्मायन intracellular धुंधला हो जाना, qPCR, और / या एलिसा द्वारा भेदभाव का आकलन करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. एलएन विच्छेदन गाइड. ए) 1 बाहु लिम्फ नोड 1 कक्षा लिम्फ नोड. सी) mesenteric लिम्फ नोड्स में स्थित हैं कवच की मांसपेशियों के पीछे, प्रत्येक बगल में पाया जा सकता है माउस. बी के प्रत्येक कांख (बगल) के पास स्थित संयोजी ऊतक) में पाया जा सकता है आंतों की संयोजी ऊतक. वे मोती की एक स्ट्रिंग के समान है. डी) 4 सतही ग्रीवा लिम्फ नोड्स माउस की गर्दन में पाए जाते हैं. ई) 2 वंक्षण लिम्फ नोड्स (प्रत्येक पक्ष पर 1) 3 रक्त वाहिकाओं को पूरा जहां स्थान पर कूल्हे क्षेत्र में स्थित किया जा सकता है .

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चित्रा 3. विच्छेदन गाइड तिल्ली. माउस spleens पेट और आंतों के पीछे शरीर के बाईं ओर पर पाए जाते हैं. बस खींच और संदंश के साथ अलग से हटा दें.

चित्रा 4
चित्रा 4. जमा एलएन से कक्ष भिन्न है और तिल्ली कोशिकाओं से पहले और autoMACS प्रो जुदाई. ए) एलएन और तिल्ली कोशिकाओं के बाद पूर्व जुदाई आधारभूत सेल आबादी की स्थापना के लिए, पूर्व vivo, दाग रहे थे. के बाद जुदाई, सीडी 4 + CD25 + (बी) और सीडी 4 + CD25-(सी) भिन्न क्रमशः, सीडी 4 + CD25 + और ​​सीडी 4 + CD25-टी लिम्फोसाइट आबादी की शुद्धता का आकलन करने के दाग थे. सभी नमूनों सीडी 4 + और CD25 + एंटीबॉडी के साथ दाग और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया.

"के लिए: रखने together.within पृष्ठ =" jove_content हमेशा "> चित्रा 5
चित्रा 5. Th17 भेदभाव. अप करने के लिए 5 दिनों के लिए कोशिकाओं को सेते हैं. Intracellular धुंधला और qPCR के लिए फसल की कोशिकाओं, एलिसा के लिए फसल supernatants.

चित्रा 6
चित्रा 6. Th17 भेदभाव फ्लो से आकलन किया. सीडी 4 + CD25-टी लिम्फोसाइट थाली बाध्य विरोधी CD3 की उपस्थिति में incubated रहे थे, विरोधी CD28, आईएल -6, और TGF-β (iTh17) या विरोधी CD3 थाली बाध्य और विरोधी CD28 लड़की (नियंत्रण) के लिए 5 दिन. कोशिकाओं तो 37 डिग्री सेल्सियस में 4 घंटे के लिए पीएमए और Ionomycin साथ सक्रिय थे सक्रियण के बाद, कोशिकाओं Th17 भेदभाव का आकलन करने के लिए विरोधी सीडी 4, विरोधी सीडी 8, विरोधी CD25, और प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए विरोधी आईएल 17A एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे. iTh17 = Th17 उत्प्रेरण सीonditions.

चित्रा 7
चित्रा 7. C57BL 6 / चूहों से qPCR और एलिसा. लिम्फोसाइटों द्वारा मूल्यांकन Th17 भेदभाव हल किया गया और सीडी 4 + CD25-टी कोशिकाओं थाली बाध्य विरोधी CD3 (10 माइक्रोग्राम / एमएल), विरोधी CD28 (1.5 माइक्रोग्राम / एमएल की उपस्थिति में incubated रहे थे ), आईएल -6 (20 एनजी / एमएल), और TGF-β (5 एनजी / एमएल) या विरोधी CD3 थाली बाध्य और विरोधी CD28 लड़की (नियंत्रण) 5 दिनों के लिए. ए) कोशिकाओं तो RORγT का आकलन करने के लिए काटा गया और qPCR. बी के माध्यम से आईएल 17A संदेश अभिव्यक्ति) Supernatants एलिसा द्वारा आईएल 17A प्रोटीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए काटा गया.

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Discussion

यहाँ हम इन विट्रो Th17 भेदभाव को प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया है. टी के भेदभाव मानव रोगजनकों 13 की प्रभावी उन्मूलन के लिए महत्वपूर्ण है Th17 सबसेट में लिम्फोसाइटों के रूप में Th17 भेदभाव का अध्ययन, महत्वपूर्ण है. इसके विपरीत, IL17 उत्पादन autoimmune रोग प्रगति 13 के साथ संबद्ध किया गया है. यह प्रतिरक्षा विनियमन और autoimmunity के कई अलग murine मॉडल को लागू किया जा सकता है के रूप में Th17 भेदभाव की विधि कई अनुसंधान सेटिंग के लिए लागू है. इस विधि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया व्यवस्थित करना आईएल 17A का उत्पादन और प्रतिलेखन कारक RORγT की अभिव्यक्ति द्वारा इस प्रोटोकॉल में चिह्नित एक Th17 सेल में अंतर करने के लिए टी lymphocytes की क्षमता,,, के बारे में सवालों के जवाब देने में मदद करता है. इसके अलावा, यह Th17 कोशिकाओं को भी IL17F, Il22, और जीएम-CSF 8, 12 के उत्पादन से पहचाना जा सकता है कि दूसरों के द्वारा दिखाया गया है. इस प्रोटोकॉल अन्य के संबंध में महत्वपूर्ण हैयह बेहतर टी लिम्फोसाइट प्रेरक कार्यों प्रतिरक्षा प्रणाली आपरेशन से संबंधित हैं कैसे समझने के क्रम में उन प्रोटोकॉल के पूरक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है क्योंकि इस तरह के Th1 या Th2 भेदभाव के रूप में जाना टी लिम्फोसाइट भेदभाव प्रोटोकॉल,,.

इन प्रयोगों का आयोजन करने पर विचार करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. Th17 भेदभाव एक अशुद्ध सीडी 4 + CD25-आबादी के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन सबसे प्रभावी और विश्वसनीय परिणामों के लिए, कम से कम 80% शुद्धता की एक सीडी 4 + CD25-आबादी वांछित है. हमारे विधि उनके autoMACS प्रो सेल सेपरेटर के लिए Miltenyi बायोटेक द्वारा प्रदान प्रोटोकॉल का इस्तेमाल करता. autoMACS सीडी 4 + CD25 + विनियामक टी सेल अलगाव किट, माउस सीडी 4 + CD25 सेल आबादी के नकारात्मक चयन के लिए प्रयोग किया जाता है. नकारात्मक चयन संभावित एंटीबॉडी बातचीत से बदल नहीं किया गया है कि भोले कोशिकाओं के उपयोग के लिए अनुमति देता है.

प्रवाह cytometric विश्लेषण में कुछ कोशिका की सतह मार्कर का उपयोग एपी की शुद्धता की पुष्टि कर सकते हैंopulation. वे आसानी से वांछित सीडी 4 + CD25-आबादी की पहचान कर सकते हैं के रूप में सिफारिश की सतह मार्करों सीडी 4, सीडी 8, और CD25 हैं. B220 और CD11b क्रमशः, बी सेल और बृहतभक्षककोशिका संदूषण के लिए परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम चाहते हैं कि इस एकाग्रता पैदावार इष्टतम भेदभाव मिल गया है के रूप में नमूने लगातार 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल पतला भी सिफारिश की है. अतीत में हम अक्सर बहुत अधिक या बहुत कम थे कि सेल सांद्रता सेलुलर विस्तार और (जैसे विषम आईएल 17A उत्पादन के रूप में) पक्षपाती परिणाम परेशान था कि मिल गया है.

यह जब उपयोग में नहीं है हर समय बर्फ पर नमूने रखने के लिए याद रखना भी जरूरी है. सेल व्यवहार्यता सकारात्मक Th17 भेदभाव को प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण कारक है. इस trypan नीले dilutions का उपयोग सेल गिनती के माध्यम से इसकी पुष्टि की जा सकती है. इस प्रोटोकॉल तुहिनाच्छादित खुर्दबीन स्लाइड के साथ लिम्फ नोड्स और तिल्ली पीस द्वारा मार्गदर्शन ऊतक homogenization रोजगार, क्योंकि यह एक समय लेने वाली तरीका हो सकता है. एक डिजाइन मोdification एक वैकल्पिक विकल्प के रूप में स्वत: ऊतक dissociators का उपयोग करने के लिए है.

वांछित Th17 भेदभाव नहीं हासिल की है कि घटना में विचार किया जाना चाहिए कि कई मुसीबत शूटिंग सुझाव दिए गए हैं. Th17 भेदभाव की हद तक सच ठीक से मापा जा सकता है तो सबसे पहले, नियंत्रण भी ध्यान से विचार किया जाना चाहिए. आम तौर पर हम केवल विरोधी CD3 और विरोधी CD28 उत्तेजना प्राप्त सीडी 4 + टी lymphocytes के लिए इन परिणामों की तुलना द्वारा Th17 भेदभाव की सीमा निर्धारित. इसके अलावा सीडी 4 + टी lymphocytes आदेश के अंतर में सक्रिय करने की जरूरत है कि याद है. एक भी नेत्रहीन नष्ट / सक्रिय टी कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए खुर्दबीन के नीचे संवर्धित कोशिकाओं का निरीक्षण करना चाहिए. सक्रिय टी कोशिकाओं नेत्रहीन प्रेरित नहीं किया गया है कि कोशिकाओं की तुलना में बड़ा काफी दिखाई देते हैं. क्लोनल विस्तार भी एक टी सेल क्लोन से प्राप्त किया गया है जो कोशिकाओं को नष्ट दिखाई समूहों के माध्यम से देखा जा सकता है. सेल सक्रियण भी Verifi हो सकता हैसीडी 4 + CD25 + सक्रिय कोशिकाओं 4 की पहचान करने के लिए विरोधी सीडी 4 और विरोधी CD25 एंटीबॉडी का उपयोग प्रवाह cytometric विश्लेषण के उपयोग के माध्यम से एड

हालांकि यह Th17 भेदभाव मंजूरी और BALB / ग चूहों 5, 11, 20 सहित अन्य माउस उपभेदों में प्राप्त किया जा सकता है पता चलता है कि डेटा प्रकाशित भी इस प्रोटोकॉल C57BL 6 / चूहों के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया है कि उल्लेख करना महत्वपूर्ण है. यह समग्र आवृत्ति और भेदभाव के दौर से गुजर सीडी 4 + टी lymphocytes की पूर्ण संख्या सहित Th17 भेदभाव,, 20 (जैसे माउस तनाव के रूप में) आनुवांशिक कारक, और (जैसे कॉलोनी स्थान) पर्यावरणीय कारकों 5 पर निर्भर है और अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है कि ध्यान दिया जाना चाहिए.

इस Th17 भेदभाव प्रोटोकॉल आगे Th17 सबसेट में कोशिकाओं के समारोह के बारे में सवालों के जवाब देने के लिए एक अमूल्य साधन के रूप में सेवा कर सकते हैं. Th17 भेदभाव का हमारा तरीका कई महत्वपूर्ण लाभ है. जैसा कि पहले से उपयोग में उल्लेख किया हैएक न्यूनतम 80% शुद्ध सीडी 4 की + CD25 सेल आबादी अधिक सुसंगत और प्रभावी भेदभाव परिणाम प्रदान करता है. AutoMACS प्रो सेल विभाजक के उपयोग के माध्यम से अलगाव की आसानी के लिए एक अतिरिक्त लाभ है. इसके अलावा इष्टतम साइटोकाइन और सक्रियण संकेतों का उपयोग अंतर करने में जो उपयुक्त वातावरण के साथ टी कोशिकाओं प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल के लिए भविष्य के प्रभाव Th17 कोशिकाओं और आईएल 17A का उत्पादन autoimmunity की शुरुआत प्रगति में शामिल कर रहे हैं जिसके द्वारा यंत्रवत साधन का निर्धारण शामिल है.

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Disclosures

घोषित करने के लिए कोई खुलासे.

Acknowledgments

इस काम फ्लोरिडा TL1 TR000066 और UL1 TR000064, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, एक बी.डी. बायोसाइंसेज अभिकर्मक अनुदान से पैरेंट अनुदान R01AI056152 से एक विविधता के पूरक के विश्वविद्यालय के लिए एनआईएच / NCATS नैदानिक ​​और translational विज्ञान पुरस्कार, और विश्वविद्यालय के हिस्से में समर्थित है फ्लोरिडा की.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Sterile Polyestrene Petri Dish Fisher Scientific 0875713A 60 mm x 15 mm
autoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Premium Microscope Slides, Frosted Fisher Scientific 12-544-3 3" x 1"1 mm
5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle BD Biosciences 309632
Corning 15 ml Centrifuge Tubes Sigma-Aldrich CLS430791
Nylon 40 microns Miami Aquaculture Nylon 40/26
Microtest tissue culture plate 96 well U bottom BD Biosciences 35-3077
Corning Costar 24 well cell culture plates Sigma-Aldrich CL3524
Eppendorf Tubes 1.5 ml Fisher Scientific 05-408-129
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e BD Biosciences 553057
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 BD Biosciences 553294
Mouse IL-6 Recombinant Protein eBioscience 14-8061-62
TGFbeta R&D Systems 240-B-002
Trypan blue solution 0.4 % Sigma-Aldrich 66H2364
Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 BD Biosciences 558107
APC Rat Anti-Mouse CD8a BD Biosciences 553035
PE Conjugated Anti-mouse CD25 eBioscience E01155-516
Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 BD Biosciences 560820
Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse BD Biosciences 51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse Miltenyi Biotec 130-091-221
ABAM Cellgro 30-004-CI
RPMI Corning, Cellgro 10-040-CM
B 2-Mercapt–thanol MP Biomedical 194834 Hazardous
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)
Ionomycin Calcium Salt Sigma-Aldrich 13909-1ML Hazardous
Brefeldin A (BFA) MP Biomedicals 159027
ELISA IL-17A Capture mAb BD Biosciences 555068
ELISA IL-17A Detection mAb BD Biosciences 555067
ELISA IL-17A Standard eBioscience 14-8171-80
IL-2 ELISA Kit BD Biosciences 555148
TMB Substrate Reagent Set BD Biosciences 555214
Equipment
autoMACS Pro Cell Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
Sorvall Legend RT+ Centrifuge ThermoScientific
Napco series 8000 WJ CO2 Incubator ThermoScientific
PTC-200 Peltier Thermal Cycler Biorad

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References

  1. Chen, Z., Lin, F., et al. Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17. International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).
  2. Cua, D. J., Sherlock, J., et al. Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain. Nature. 421, 742-748 (2003).
  3. El-Behi, M., Rostami, A., et al. Current views on the roles of Th17 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalitis. J. Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
  4. Inaba, K., Kroide, S., et al. Properties of memory T lymphocytes isolated from the mixed leukocyte reaction. Proc Natl Acad Sci. 82, 7686-7690 (1985).
  5. L, I. vanovF. rutosR., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 16, 337-349 (2008).
  6. Jager, L. D., Dabelic, R., et al. The Kinase Inhibitory Region of SOCS-1 is Sufficient to Inhibit T helper-17 Function in Experimental Allergic Encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 232, 08-18 (2011).
  7. Kimura, A., Kishimoto, T. IL-6: regulator of Treg/Th17 balance. Eur. J. Immunol. 40, 1830-1835 (2010).
  8. Korn, T., Bettelli, E., et al. IL-17 and Th17 Cells. Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).
  9. Kriegel, M. A., Seflk, E., et al. Naturally transmitted segmented filamentous bacteria segregate with diabetes protection in nonobese diabetic mice. PNAS. 108, 11548-11553 (2011).
  10. Langrish, C. L., Chen, Y., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J. Exp. Med. 201, 233-240 (2005).
  11. Lau, K., Benitez, P., et al. Inhibition of type 1 diabetes by a Lactobacillus johnsonii mediated Th17 bias. J. Immunol. 186, 3538-3546 (2011).
  12. Lee, Y., Awasthi, A., et al. Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells. Nat Immunol. 13, 991-999 (2012).
  13. Litmann, D. R., Rudensky, A. Y. Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation. Cell. 140, 845-858 (2010).
  14. O'Connor, W. Jr, Kamanaka, M., et al. A protective function for interleukin 17A in T cell-mediated intestinal inflammation. Nat Immunol. 10, 603-609 (2009).
  15. Picca, C. C., Larkin, J., et al. Role of TCR specificity in CD4+CD25+ regulatory T cell selection. Immunol Rev. 212, 74-85 (2006).
  16. Shah, K., Lee, W. W., et al. Disregulated balance of Th17 and Th1 cells in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research & Therapy. 12, R53 (2010).
  17. Sospedra, M., Martin, R. Immunology of Multiple Sclerosis. Annu. Rev. Immunol. 23, 683-747 (2005).
  18. Stockringer, B., Veldhoen, M. Differentiation and function of Th17 T cells. Current Opinion in Immunology. 19, 281-286 (2007).
  19. Veldhoen, M., Hocking, R. J., et al. TGFβ in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24, 179-189 (2006).
  20. Zou, Y., Zhang, H., et al. Strain-dependent production of interleukin-17/interferon-γ and matrix remodeling-associated genes in experimental Candida albicans keratitis. Mol Vis. 18, 1215-1225 (2012).

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Bedoya, S. K., Wilson, T. D.,… More

Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin III, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naïve CD4 T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (79), e50765, doi:10.3791/50765 (2013).

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