Summary
С эффекторных функций, отличных от других клеточных подмножеств Т, клетки Th17 были централизованно вовлечен в воспалительный аутоиммунными. Это пробирке протокол в Th17 дифференциация предоставляет средства для определения, является ли наивные CD4 + Т-лимфоциты могут дифференцироваться в клеток Th17, и для дальнейшего изучения их роли в аутоиммунных и ответа хозяина.
Abstract
Th17 клетки особым подмножество Т-клеток, как было обнаружено, продуцируют интерлейкин 17 (IL-17), и отличаются в зависимости от других клеточных подмножеств т с Th1, Th2 и регуляторных Т-клеток. Клетки Th17 появились в качестве центрального виновника в переусердствовать воспалительных иммунных реакций, связанных с многих аутоиммунных расстройств. В этом методе мы очистить Т-лимфоцитов из селезенки и лимфатических узлов мышей C57BL / 6, а также стимулировать очищенные CD4 + Т-клеток под контролем и Th17-индуцирующих средах. Th17-индуцирующей среда включает в себя стимуляцию в присутствии анти-CD3 и анти-CD28 антителами, IL-6 и TGF-β. После инкубации в течение по крайней мере 72 часов и на срок до пяти дней при 37 ° С, клетки затем анализировали на способность производить IL-17 через проточной цитометрии, КПЦР и ИФА. Th17 дифференцированными CD4 + CD25-Т-клетки могут быть использованы для дальнейшего выяснения роли, что Th17-клетки играют в возникновении и прогрессировании аутоиммунных и принимающей деFense. Кроме того, Th17 дифференциация CD4 + CD25-лимфоцитов из различных моделей мышей нокаутом / болезни может способствовать нашему пониманию клеточных судеб пластичности.
Introduction
CD4 + Т-лимфоциты (Т-клетки) играют важнейшую роль в иммунной системы опосредованного защиты от инфекционных микроорганизмов. С другой стороны, Т-клетки также тесно связана с наступлением и развитием аутоиммунных заболеваний, таких как диабет типа 1, системная красная волчанка и ревматоидный артрит. CD4 + Т-лимфоциты активируются путем сочетания Т-клеточного рецептора (TCR) взаимодействия с антигеном / главного комплекса гистосовместимости II (MHCII) молекул, а также взаимодействия рецепторов CD28 с B7.1/B7.2 лигандами 15. В дополнение к предоставлению TCR стимуляции и CD28 совместной стимуляции, антиген-представляющих клеток также обеспечивают цитокинов среды, которая определяет дифференциации состояние Т-лимфоцит, тем самым направляя реакцию Т-лимфоцитов в к данному антигену. Отдельное патоген / антиген-представляющих клеток взаимодействия создают различных средах цитокинов, которые исказить Т-лимфоцитов вниз различные пути, направленные на Элиной подсветкой инициирующего патогена. К сожалению, T-лимфоцитов эффекторные пути, первоначально направленные на искоренение вторжение болезнетворных микроорганизмов, может быть ошибочно направлена против самостоятельной тканей 15. Таким образом, более глубокое понимание состояния дифференцировки каждого отдельного CD4 + Т-клеток подмножество имеет решающее значение для нашего понимания того, как модулировать баланс между уничтожения патогенных и терпимости к себе.
В дополнение к Th1, Th2, и индуцируемой клеточной дифференцировки путей регуляторных Т, наивные Т-лимфоциты также может приводиться в действие цитокинов вниз по пути Th17. В то время как Th1 клеток боевых внутриклеточных патогенов, Th2 клетки устранить внеклеточных патогенов, и регуляторные Т-клетки (Tregs) минимизировать воспалительные реакции 1, 16; Th17-клетки играют важную роль в ликвидации внеклеточных бактерий и грибков. Th17 клетки обычно обозначается экспрессии специфических клонов фактора транскрипции RORγT и производства IL-17A, который способствует активации макрофагов и нейтрофилов 1, 7.
Th17 клетки были вовлечены в нескольких аутоиммунных заболеваний, а также связанные с ними модели на грызунах. Например, было продемонстрировано, что IL-23 (который необходим для поддержания фенотип Th17), но не IL-12, был центральной преступник в экспериментальном аутоиммунном энцефалите (ЭАЭ), модель болезни грызунов для MS. Это впоследствии было показано, что снижение производства IL-17 коррелирует с предотвращением EAE 2, 6, 17. Кроме того, клетки Th17 были связаны с другими аутоиммунными нарушениями, включая артрит и системная красная волчанка (СКВ) 10, 16. IL-23 дефицитных p19 - / - мышей было показано, имеют очень низкие количества клеток Th17, и устойчивы к развитию не только EAE, но и коллаген-индуцированного артрита, модели ревматоидного артрита 10, 18. Кроме того, мыши, получавшие нейтрализации IL-17A антитела кормеэ начало коллаген-индуцированного артрита были также установлено, что разрешение повреждения суставов 18. Следует отметить, что роль клеток Th17 в прогрессировании аутоиммунных заболеваний остается охарактеризовать как недавние исследования также показали защитную роль Th17-клеток в диабетом типа 1 9, 11 и воспаление кишечника 14. Эти исследования подтверждают важность Th17 дифференциации в аутоиммунными.
В пробирке дифференциации Th17 является необходимым методом в исследовании Т-клеток, потому что есть по крайней мере два трудных вопросов, которые требуют дальнейшего изучения: 1) Как именно ИЛ-6 регулируют баланс между Treg и Th17 дифференциации, и 2) каковы точные механизмы за Ил-17-индуцированной воспалительных заболеваний? Наша методика использует CD4 + CD25-Т-клеток из селезенки и лимфатических узлов C57BL / 6 мыши. Важно отметить, что хотя можно индуцировать дифференцировку Th17 с помощью нечистойнаселение, приобретая по крайней мере, 80% чистого CD4 + CD25-Т-клеток населения сводит на нет любое беспокойство загрязнения и обеспечивает более успешные результаты Th17 дифференциации. Для того чтобы достичь надлежащего дифференцировку Th17, CD4 + CD25-Т-клетки инкубировали в присутствии анти-CD3 и анти-CD28, которые обеспечивают сигналы активации, 1 и 2, соответственно, и IL-6, и TGF-β. Хотя сообщалось, что IL-23 только может быть использована для достижения Th17 дифференциацию, позднее было показано, что IL-23 является необходимым для стабильности клеточной популяции Th17, но IL-6 и TGF-β имеют важное значение для дифференциации Th17 3, 18, 19. Мышиные исследования показали, что рецептор IL-23 экспрессируется на CD4 + Т-клеток только после их стимулировали IL-6 и TGF-β 13, 18. Кроме того, клетки Th17 будет успешно развиваться в присутствии IL-23-антитела блокируют до тех пор, IL-6 и TGF-β присутствуют 18, 19. Таким образом, этот протокол пров Th17 дифференциацияIDES соответствующие условия для успешного вызвать Th17 дифференциации. Развитие лучшего понимания механизмов, лежащих Th17 дифференциации и IL-17 производства представить возможность для разработки более совершенных терапии, направленных на аутоиммунными нарушениями 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Любое использование животных было проведено в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по Уходу за животными и использования.
1. Приготовления смесей и СМИ
- Стерильная PBS рН: 7.3 (1 л)
0,23 г NaH 2 PO 4
1,15 г Na 2 HPO 4
9,0 г NaCl
Возьмите объем дистиллированной водой. Стерилизовать с автоклаве. - Культура клеток Медиа (100 мл)
89 мл RPMI
10 мл 10% FBS
1 мл Антибиотик Противогрибковая (ABAM) 100 мкг 50 мМ 2-меркаптоэтанола (3,5 мкг акции 2-меркаптоэтанола в 96,5 мкг PBS) - СУИМ буфера (флуоресцентная Включение сортировки клеток) (будет использоваться во время проточной цитометрии) 2% FBS в стерильной PBS
- iTh17 Mix (На основе количества образцов, определения объема необходимой для всех смесей и средств массовой информации)
1,5 мкг / мл анти-CD28
20 нг / мл IL-6
5 нг / млTGF-β
2. Клетки будут покрыл в трех экземплярах при соблюдении следующих условий
- Связаны анти-CD3 плиты, анти-CD28 (это управление активация смеси).
- iTH17: пластина связана анти-CD3, анти-CD28, ИЛ-6, TGF-β.
3. Тарелка с привязкой к анти-CD3 (10 мкг / мл)
Рекомендуется, чтобы подготовка пластин с привязкой к анти-CD3 пластин делается по крайней мере 4 ч до времени клетки будут добавлены к пластинам.
- Добавить 30 мкл анти-CD3 в лунки (анти-CD3 разбавляют в стерильном PBS) новой 96 и U нижней Микротест планшета для культуры ткани, и нажмите боковые стороны пластины, чтобы обеспечить равномерное покрытие лунок. Инкубировать при 37 ° С в течение 4 ч, а затем поставить в холодильник, пока не пришло время, чтобы добавить миксы и клетки к пластине.
4. Мышь Рассечение
- Этот протокол основан на использовании C57BL / 6 микрофономе, 3-8 месячного возраста, а также купленных у Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).
- Жертвоприношение мышь с помощью СО 2 удушье, и подтвердите смерть с последующим смещением шейных позвонков.
- Стерилизовать мышей рассечение инструментов и разрез область с 70% этанола и начать вскрытие.
- С брюшной стороны, захватить кожу, что наступили до отверстие мочеиспускательного канала и начать не резать с ножницами до вентральной срединной линии до достижения область подбородка. Примите меры предосторожности, не следует разрезать в подкладку брюшную стенку.
- Отойдите назад на коже и придавить, чтобы позволить удобный доступ к лимфатических узлов во время удаления.
- Лимфатических узлов и селезенки, собранных все будут удалены пинцетом и помещают в стерильную чашку Петри, содержащую 5 мл рабочего буфера AutoMACS приобретены у Miltenyi Biotec (см. фиг.2 и 3 для лимфатического узла и диаграмм удаление селезенки).
- Удалите подмышечных лимфатических узлов, которыенайдено рядом с подмышечной впадине (подмышки) за грудными мышцами каждой мыши.
- Удалить плечевого лимфатические узлы, которые находятся в соединительной ткани, расположенных вблизи каждой подмышечной впадине.
- Удалить поверхностные шейные лимфатические узлы, найденные в шее каждой мыши.
- Удалите паховые лимфатические узлы, которые расположены в области бедра в сочетании из 3 кровеносных сосудов.
- Чтобы получить доступ к брыжеечных лимфатических узлов, прорезать в брюшную выстраиваются вентральной срединной линии. Брыжеечные лимфатические узлы находятся в соединительной ткани, которая удерживает кишечник вместе. Они обычно находятся в строке 4-8 узлов, и может появиться как "нить жемчуга". Убедитесь в том, чтобы вытащить всю строку.
- Селезенка находится в области живота, позади желудка и кишечника. Удалите ее, потянув и снятие его с поджелудочной железой.
- Измельчить органы в стерильной капот с использованием 2 заморозили микроскопа. Наведите лимфатических узлов или селезенки наматовое сбоку одного стекло микроскопа, и втирают с матовым стороне второго слайда до распалась. Повторите, пока все лимфатические узлы и селезенка не были массу.
Примечание: Рекомендуется начать с лимфатических узлов и закончить с селезенкой, как кровь будет трудно, чтобы увидеть остальные лимфатические узлы в буфере AutoMACS.
- Для фильтрации наземные органы в суспензии отдельных клеток, начинают путем складывания за кусок 40 мкм нейлоновый материал в несколько раз, и размещение в верхней части 15 мл центрифужную пробирку. Нейлон материал должен быть примерно 3 х 3 дюйма
- Используйте шприц 5 мл и 21 г иглы для аспирации 5 мл AutoMACS Бег буфера и наземные органы. Не включать медленно в сложенном материала нейлона. Позаботьтесь, чтобы избежать прокалывания материала с иглы.
Примечание: После того, как один суспензию клеток достигается, решение должно появиться в виде бледно-, последовательного решения с не visibле куски твердой ткани. Если твердые остаются, повторно аспирации и отказаться через новый сложенный лист нейлона размещены в новом 15 мл трубки центрифуги.
- Всегда держите клетки на льду, когда он не используется.
5. Сотовый Разделение
- Для получения оптимальных результатов, получить по крайней мере 80% чистого CD4 + CD25-популяции клеток через AutoMACS Cell Сепаратор Pro с помощью MACS CD4 + CD25 + регуляторных Т-изолятор комплект, мышь. Протокол для отрицательного сохранением CD4 + CD25-популяции клеток получают посредством Miltenyi Biotec.
6. Th17 Дифференциация
- Соберите CD4 + CD25-популяции клеток после отделения с AutoMACS Pro сотовый Сепаратор.
- Граф клеток развести в соотношении 1:1000 с использованием трипанового синего гемоцитометра.
- После того, как концентрация была определена от числа клеток, разбавленной клеточной суспензии в 1 × 10 6 клеток / мл в культуральной среде клеток.
- Выньте 96-луночных планшетов с пластиной связанного анти-CD3 после 4 часов.
- Промыть анти-CD3-лунок 200 мкл PBS. Повторите 2 раза.
- Для мытья добавить 200 мкл стерильной PBS, чтобы анти-CD3 покрытием скважин и удалить PBS в контейнер для отходов.
- Добавить 100 мкл смеси iTh17 или управления активация смеси (см. пункт № 2) в лунки в трех экземплярах.
- Добавьте 100 мкл клеток в каждую лунку, в которой либо смесь Th17 или управления активацией смесь была помещена.
- Инкубируйте клетки, по крайней мере 72 ч или до 5 дней (Th17 дифференциация может быть получен после 72 часов или через 5 дней.)
- Th17 дифференцирование может быть оценена путем внутриклеточного окрашивания и проточной цитометрии анализа, ELISA или количественной ПЦР
7. Сотовый активации (необходимо только для внутриклеточного окрашивания)
- Удалить 96-луночных планшетов из инкубаторов в конце либо 72 ч или 5 дней
- Напомним, что Th17 differentiatioн может быть достигнуто после либо 72 часов или 5 дней.
- Для каждого состояния (например, управления или активации iTh17), передача клетки, которые в трех экземплярах в одну лунку 24-луночного культурального планшета клеток. Клетки для одного состояния в настоящее время объединены в одну лунку 24-луночного планшета культуры, в отличие от быть в трех экземплярах на 96-луночный U нижней культурального планшета.
- Общий объем каждой лунки в клеточной культуральной пластины 24 а теперь 600 мкл. Поднимите объем каждой лунки по 1 мл с клеточной культуры.
- Добавить PMA (форболмиристатацетата) (50 нг / мл), иономицин (1 мкМ), и БФА (брефелдин-A) (10 мкг / мл) в каждую лунку в 24-луночного культурального планшета клеток в указанных концентрациях.
- Инкубировать при 37 ° С в течение 4 часов.
8. Внутриклеточного окрашивания
- Пятно клетки с нужными внеклеточных и внутриклеточных маркеров для проточной цитометрии анализа. Для обнаружения присутствия Oе IL-17, внутриклеточное окрашивание делается с анти-IL-17A антител. Рекомендуемые поверхностно внеклеточные маркеры включают CD4, CD8, и CD25.
- Используйте внутриклеточных окрашивание цитокинов Starter Kit-Mouse от BD Bioscience для окрашивания IL-17 внутриклеточного.
- Для каждого образца гранул клетки, удалить супернатант, и ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл FACS буфера (2% FBS в PBS).
- Трансфер ресуспендировали клетки до 96 потока клеток цитометрии пластины.
- Спин клетки вниз в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту и отбросить супернатант.
- Добавить 200 мкл буфера PBS FACS, центрифуги в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту, и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют клеток в 100 мкл FACS буфера и применять 100 мкл внеклеточного антитела (Ab) смесь (внеклеточный Ab смесь выполнен в FACS буфере). Инкубировать 15 мин при комнатной температуре, покрытые пленкой.
- Повторите шаг 8.1.4.
- Повторите шаг 8.1.5 2x.
- Ресуспендируют клеток в 100 мкл BD Cytofix / Cytoperm буфера. Incubели в течение 20 мин при комнатной температуре, покрытых пленкой.
- Добавить 100 мкл 1x BD Пермь / промывочного буфера, центрифуги в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту, и отбросить супернатант. Повторите.
- Добавить 50 мкл внутриклеточного Ab смеси. (Внутриклеточный Ab смесь выполнен в 1x BD Пермь / стирка) Инкубировать 15 мин при комнатной температуре, покрытые пленкой.
- Повторите шаг 8.1.10.
- Ресуспендируют клеток в 200 мкл BD окрашивающего буфера.
- Поместите ресуспендировали клетки в проточной цитометрии пробирки, содержащие 200 мкл окрашивающего буфера BD (конечный объем 400 мкл).
- Хранить при 4 ° С до образцы не будут готовы для чтения.
9. Анализ проточной цитометрии
- Ворота живая клетка населения.
- Из живой клеточной популяции, ворота на CD4 + CD8-населения.
- С CD4 + CD8-населения, ворота на IL-17A + населения.
- На основе наших предыдущих экспериментальных результатов, 100% от IL-17A + населения будет CD25 +.
* Всего на счету абсолютные клеток были получены после объединения образцы трижды
** Абсолютное число CD4 + CD25 + IL-17A + клеток определяли путем умножения общего количества клеток в живой процент и процент от общего объема клеток, несущих происхождение конкретных маркеры, CD4, CD25 и IL-17A ворот, как определяется с помощью проточной цитометрии.
10. КПЦР и ИФА
- Место клетки не используются для анализа проточной цитометрии в 1,5 мл пробирку Эппендорфа и центрифуге при 13000 оборотах в минуту в течение 5-10 мин. Клетки, обнаруженные в осадок клеток после центрифугирования будет использоваться для анализа КПЦР. Анализ КПЦР проводили с использованием PTC-200 Пельтье Термоциклер (BioRad).
- Сбор супернатант из центрифугированных труб для ИФА. IL-17A ИФА проводили с использованием антитела пара TC11-18h10 (захват, каталожный номер 555068) и TC11-8х4 биотин (обнаружение, каталожный номер 555067), приобретенного у BD Biosciences. IL-17A ИФА станцииndards были получены из eBioscience (номер по каталогу 14-8171-80).
- После удаления жидкости, ресуспендируют остальные ячейки, которые будут использоваться для количественной ПЦР в 175 мкл буфера для лизиса РНК (немедленно использовать для экстракции РНК, синтез кДНК и количественной ПЦР, или хранить при температуре -80 ° С для последующего использования).
- Обратитесь к таблице II для последовательностей праймеров для IL-17A и актина (гена уборки)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол дифференциация Th17 начинается с удаления селезенки и подмышечных, плечевых, мезентериальных, шейки матки, и паховых лимфатических узлов. Представление из мест каждого можно найти на рисунках 2 и 3. На рисунках 1 и 5 и дают наглядное представление из методов, описанных в этом протоколе.
Этот протокол Th17 фокусируется на дифференциации от популяции лимфоцитов CD4 + CD25-T. Важно отметить, насколько эффективно Pro разделени клеток AutoMACS обогащает желаемый CD4 + CD25-популяции из объединенных общей лимфатического узла и селезенки (фиг. 4). Нефракционированного, объединяли лимфатических узлов и спленоциты, и AutoMACS разделенных фракции окрашивали antiCD4 и antiCD25 антител с последующим анализом проточной цитометрии (рис. 4). 4А показывает, представитель профиля процент CD4 + CD25 +и CD4 + CD25-лимфоциты, присутствующие в нефракционированных, объединенных лимфатических узлов и селезенки методом проточной цитометрии. Процедура изоляция также обеспечивает обогащенный население CD4 + CD25 + Treg из C57BL / 6 мышей, которые могут быть использованы в дополнительных экспериментах (фиг.4В). Фиг.4С показан наш нужное обогащение клеток с населением, что составляет 84% CD4 + CD25-Т-клетки, с подавляющее большинство CD4 + CD25 + Tregs удалены. Мы последовательно имеют небольшой НЕЛИМФОИДНОЙ клеточной популяции, которая присутствует в обогащенном CD4 + CD25-, но это не мешает процессу дифференциации (фиг.4С). Наш обогащенный CD4 + CD25-Т-клеток населения помогает обеспечить более успешное дифференциацию Th17.
На рисунке 5 показана схема нашей процедуры дифференциации Th17. Наш обогащенный CD4 + CD25-популяции либо инкубируют в условиях Th17 дифференцированием (анти-CD3, анти-CD28, IL-6 и TGF-β) или контроль (анти-CD3, анти-CD28). Как видно на фиг.6, что в то время как инкубация CD4 + CD25-Т-лимфоцитов анти-CD3, анти-CD28 в течение 5 дней дало CD25 + Т-лимфоциты, инкубации при Th17 условий, индуцирующих дали подмножество IL17 производства CD25 + лимфоцитов CD4 +. Пожалуйста, обратитесь к таблице 1 приведены примеры CD4 + CD25 + IL-17A + абсолютных урожайности номер мобильного после 5 дней инкубации в условиях iTh17.
Th17 статус дифференциация может быть дополнительно оценены через количественной ПЦР и ИФА. Рисунке 7 показаны данные из обогащенных CD4 + CD25-Т-лимфоцитов инкубировали под контролем или Th17-индуцирующих условиях. CD4 + CD25-T-лимфоцитов инкубируют в условиях Th17 до регулировать IL17A, который может быть установлено через количественной ПЦР (7А) и ELISA (фиг. 7b). Th17-специфический фактор транскрипции RORγT также активируется с помощью CD4 + CD25-Т-клеток, инкубированных при Th17-индуцирующих условиях, и может быть установлено THRух КПЦР (рис. 7А).
Рисунок 1. Th17 Дифференциация схематично. 1. Coat скважины U-дном 96-луночный планшет с анти-CD3 (10 мкг / мл) разводили в PBS. 2. Разместить пластина в инкубаторе в течение 4 ч при 37 ° С. В то время как пластина инкубации, рассекают лимфатические узлы (LN) и селезенки от мыши. Измельчите органы и фильтрации с получением суспензии отдельных клеток. Изолировать CD4 + CD25-Т-клеток с использованием клеток Isolation Kit CD4 + CD25 + регуляторных Т-и Miltenyi AutoMACS Pro сепаратора. CD4 + CD25-клетки должны быть разведено до 1 х 10 6 клеток / мл. 3. После 4 ч инкубации 96-луночного планшета будет завершена, мыть скважин с PBS (200 мкл / лунку) 3x. 4. Добавить 100 мкл CD4 + CD25-Т-клетки к пластине с привязкой (Pb) анти-CD3 лунок. 5. Добавить 100 мкл анти-CD28 или 100 мкл iTh17 COCktail (antiCD28, TGF-β, и ИЛ-6). 6. Инкубируйте пластины в течение 3 или 5 дней при 37 ° С После инкубации оценивают дифференцировку внутриклеточным окрашиванием, КПЦР и / или ELISA.
Рисунок 2. Л.Н. Руководство Рассечение. А) 1 плечевой лимфатических узлов можно найти в соединительной ткани, расположенной рядом с каждым подмышечной впадине (подмышки) мыши. B) 1 подмышечных лимфатических узлов можно найти в каждой подмышечной впадине, за грудными мышцами. C) мезентериальных лимфатических узлов, расположенных в соединительная ткань кишечника. Они похожи на нитку жемчуга. D) 4 поверхностные шейные лимфатические узлы находятся в области шеи мыши. E) 2 паховые лимфоузлы (1 с каждой стороны) может быть расположена в области тазобедренного сустава в месте, где три кровеносные сосуды удовлетворения .
. Внутри-странице = "всегда"> 
Рисунок 3. Селезенка рассечение руководство. Селезенки мыши можно найти на левой стороне тела позади желудка и кишечника. Просто удалите, потянув и отделения с пинцетом.
Рисунок 4. Сотовые фракции из объединенной LN и клетки селезенки до и после Pro разделение AutoMACS.) LN и клеток селезенки были окрашены, экс естественных, определить исходные клеточные популяции до разделения. После разделения, CD4 + CD25 + (В) и CD4 + CD25-(C) фракции окрашивали для оценки чистоты CD4 + CD25 + и CD4 + CD25-T популяциях лимфоцитов соответственно. Все образцы окрашивали CD4 + и CD25 + антитела и проанализированы с помощью проточной цитометрии.
Рисунок 5. Th17 Дифференциация. Инкубируйте клетки на срок до 5 дней. Урожай клеток для внутриклеточного окрашивания и количественной ПЦР; урожай надосадки для ELISA.
Рисунок 6. Th17 дифференциация оценивали с помощью проточной цитометрии. CD4 + CD25-Т-лимфоциты инкубировали в присутствии пластины с привязкой к анти-CD3, анти-CD28, IL-6 и TGF-β (iTh17) или пластины с привязкой к анти-CD3 и анти-CD28 один (контроль) в течение 5 дней. Затем клетки активируются ФМА и иономицином в течение 4 часов при 37 ° С. После активации клетки окрашивали анти-CD4, анти-CD8, анти-CD25 и анти-IL-17A антител для проточной цитометрии анализа для оценки Th17 дифференциации. iTh17 = Th17 вызывая сonditions.
Рисунок 7. Th17 дифференциация оценивали по количественной ПЦР и ELISA. Лимфоциты мышей C57BL / 6 были отсортированы и CD4 + CD25-Т-клетки инкубировали в присутствии пластинчатых связан анти-CD3 (10 мкг / мл), анти-CD28 (1,5 мкг / мл ), IL-6 (20 нг / мл), и TGF-β (5 нг / мл) или пластины с привязкой к анти-CD3 и анти-CD28 один (контроль) в течение 5 дней. A) Клетки затем собирают для оценки RORγT и IL-17A экспрессии сообщение через КПЦР. B) Супернатанты собирали для оценки экспрессии белка IL-17A по ELISA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описали протокол для достижения в пробирке Th17 дифференциации. Изучение Th17 дифференциации важно, так как дифференциация Т-лимфоцитов в подгруппе Th17 имеет решающее значение для эффективной ликвидации человеческих патогенов 13. И наоборот, IL17 производство было связано с аутоиммунным прогрессирования заболевания 13. Способ Th17 дифференциации применимо к многих научных исследованиях как он может быть применен в многочисленных различных мышиных моделях иммунной регуляции и аутоиммунных заболеваний. Этот метод помогает ответить на вопросы относительно способности Т-лимфоцитов, дифференцироваться в клетки Th17, обозначаемой в данном протоколе по производству IL-17A и экспрессии фактора транскрипции RORγT, модулировать иммунный ответ. Кроме того, было показано, что другие клетки Th17 также могут быть идентифицированы по производству IL17F, Il22 и GM-CSF 8, 12. Этот протокол является значительным по отношению к другойизвестные Т-лимфоцитов дифференциации протоколы, такие как Th1 или Th2 дифференциации, так как он может быть использован в дополнение к эти протоколы для того, чтобы лучше понять, как Т-функции лимфоцитов эффекторные относятся к работе иммунной системы.
Есть несколько важных шагов, которые следует учитывать при проведении этих экспериментов. Th17 дифференциация может быть достигнуто путем нечистом CD4 + CD25-популяции, но и для наиболее эффективных и надежных результатов, CD4 + CD25-популяция, по крайней мере 80%-ной чистоты желательно. Наш метод использует протокол, предоставляемый Miltenyi Biotec для их AutoMACS Pro сотовый Сепаратор. AutoMACS CD4 + CD25 + регуляторных Т Выделение клеток комплект, мышь используется для негативной селекции на CD4 + CD25-клеточной популяции. Отрицательный отбор позволяет использовать наивных клеток, которые не были потенциально измененных антител взаимодействий.
Использование определенных маркеры клеточной поверхности, в проточной цитометрии анализа можно подтвердить чистоту арopulation. Рекомендуемые поверхностные маркеры CD4, CD8, CD25 и как они могут легко определить нужный CD4 + CD25-популяции. B220 и CD11b может быть использован для проверки В-клетки и загрязнения макрофагов, соответственно. Образцы последовательно разбавляют до 1 х 10 6 клеток / мл также рекомендуется как мы обнаружили, что это дает концентрация оптимальную дифференциацию. В прошлом мы обнаружили, что концентрации клеток, которые были слишком высоко или слишком низко часто был возмущен сотовой расширение и предвзятые результаты (например, перекос производства Ил-17, а).
Важно также помнить, чтобы сохранить образцы на льду во все времена, когда он не используется. Жизнеспособность клеток является важным фактором в достижении положительного дифференциацию Th17. Это может быть подтверждено путем подсчета клеток с использованием трипанового синего разведения. Поскольку этот протокол использует ручной ткани гомогенизации путем измельчения лимфатические узлы и селезенка с матовым микроскопа, это может быть способ отнимает много времени. Один дизайн месdification является использование автоматических dissociators ткани в качестве альтернативного варианта.
В случае, если желаемый Th17 дифференциация не достигнута, Есть несколько советов, Поиск и устранение неисправностей, которые следует учитывать. Во-первых, управления также должны быть тщательно продуманы, чтобы истинные масштабы Th17 дифференциации может быть должным образом измерить. Как правило, мы определить степень Th17 дифференциации, сравнивая эти результаты лимфоцитам CD4 + Т-, получавших только анти-CD3 и анти-CD28 стимуляции. Также помните, что CD4 + Т-лимфоциты должны быть активированы в порядке дифференцируются. Следует также визуально проверить культивируемых клеток под микроскопом, чтобы подтвердить наличие разрушенных / активированных Т-клеток. Активированные Т-клетки визуально значительно казаться больше, чем клеток, которые не были стимулированных. Клональный расширения также можно наблюдать через видимых скоплений взрывных клетки, которые были получены из одной Т-клеток клона. Активация клеток также может быть Verifiред с использованием анализа проточной цитометрии с использованием анти-CD4 и анти-CD25 антитела для выявления CD4 + CD25 + активированные клетки 4
Важно также отметить, что этот протокол был оптимизирован для использования с мышей C57BL / 6, однако опубликованные данные показывают, что Th17 дифференциация может быть достигнуто в других линий мышей включая NOD и BALB / с мышей 5, 11, 20. Следует отметить, что Th17 дифференциация, в том числе общей частоты и абсолютного числа CD4 + Т-лимфоцитов подвергаться дифференциации, зависит от генетических факторов (например, штамм мыши) 20, и факторов окружающей среды (например, колонии месте) 5 и может потребовать оптимизации.
Этот протокол дифференциация Th17 может служить неоценимым средством для дальнейшего ответить на вопросы относительно функции клеток в подгруппе Th17. Наш метод Th17 дифференциации имеет ряд существенных преимуществ. Как упоминалось ранее использованиеминимального 80% чистого CD4 + CD25-популяция клеток представляет собой более последовательную и эффективную результат дифференциации. Простота изоляции посредством использования AutoMACS сепаратора клеток Pro является дополнительным преимуществом. Кроме того, использование оптимальных цитокинов и активации сигналов обеспечивает Т-клеток с соответствующей среды, в которой дифференцировать. Будущие последствия для этого протокола включать в себя определение механистические средства, с помощью которых клетки Th17 и производство IL-17A которые участвуют в возникновении и прогрессировании аутоиммунных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет раскрытия объявить.
Acknowledgments
Эта работа частично поддержана на NIH / NCATS клинических и трансляционных науки Awards в Университете Флориды TL1 TR000066 и UL1 TR000064, разнообразие дополнения от родителей Грант R01AI056152 из Национального института здравоохранения, гранта реагента BD Biosciences и университета Флориды.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Sterile Polyestrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | 60 mm x 15 mm |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Premium Microscope Slides, Frosted | Fisher Scientific | 12-544-3 | 3" x 1"1 mm |
| 5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle | BD Biosciences | 309632 | |
| Corning 15 ml Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| Nylon 40 microns | Miami Aquaculture | Nylon 40/26 | |
| Microtest tissue culture plate 96 well U bottom | BD Biosciences | 35-3077 | |
| Corning Costar 24 well cell culture plates | Sigma-Aldrich | CL3524 | |
| Eppendorf Tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e | BD Biosciences | 553057 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | |
| Mouse IL-6 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFbeta | R&D Systems | 240-B-002 | |
| Trypan blue solution 0.4 % | Sigma-Aldrich | 66H2364 | |
| Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 558107 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553035 | |
| PE Conjugated Anti-mouse CD25 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 | BD Biosciences | 560820 | |
| Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) | |
| MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | Corning, Cellgro | 10-040-CM | |
| B 2-Mercapt–thanol | MP Biomedical | 194834 | Hazardous |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | |||
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | Hazardous |
| Brefeldin A (BFA) | MP Biomedicals | 159027 | |
| ELISA IL-17A Capture mAb | BD Biosciences | 555068 | |
| ELISA IL-17A Detection mAb | BD Biosciences | 555067 | |
| ELISA IL-17A Standard | eBioscience | 14-8171-80 | |
| IL-2 ELISA Kit | BD Biosciences | 555148 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Biosciences | 555214 | |
| Equipment | |||
| autoMACS Pro Cell Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge | ThermoScientific | ||
| Napco series 8000 WJ CO2 Incubator | ThermoScientific | ||
| PTC-200 Peltier Thermal Cycler | Biorad | ||
References
- Chen, Z., Lin, F., et al. Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17. International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).
- Cua, D. J., Sherlock, J., et al. Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain. Nature. 421, 742-748 (2003).
- El-Behi, M., Rostami, A., et al. Current views on the roles of Th17 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalitis. J. Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
- Inaba, K., Kroide, S., et al. Properties of memory T lymphocytes isolated from the mixed leukocyte reaction. Proc Natl Acad Sci. 82, 7686-7690 (1985).
- L, I. vanovF. rutosR., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 16, 337-349 (2008).
- Jager, L. D., Dabelic, R., et al. The Kinase Inhibitory Region of SOCS-1 is Sufficient to Inhibit T helper-17 Function in Experimental Allergic Encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 232, 08-18 (2011).
- Kimura, A., Kishimoto, T.
- Korn, T., Bettelli, E., et al.
- Kriegel, M. A., Seflk, E., et al. Naturally transmitted segmented filamentous bacteria segregate with diabetes protection in nonobese diabetic mice. PNAS. 108, 11548-11553 (2011).
- Langrish, C. L., Chen, Y., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J. Exp. Med. 201, 233-240 (2005).
- Lau, K., Benitez, P., et al. Inhibition of type 1 diabetes by a Lactobacillus johnsonii mediated Th17 bias. J. Immunol. 186, 3538-3546 (2011).
- Lee, Y., Awasthi, A., et al. Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells. Nat Immunol. 13, 991-999 (2012).
- Litmann, D. R., Rudensky, A. Y. Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation. Cell. 140, 845-858 (2010).
- O'Connor, W. Jr, Kamanaka, M., et al. A protective function for interleukin 17A in T cell-mediated intestinal inflammation. Nat Immunol. 10, 603-609 (2009).
- Picca, C. C., Larkin, J., et al. Role of TCR specificity in CD4+CD25+ regulatory T cell selection. Immunol Rev. 212, 74-85 (2006).
- Shah, K., Lee, W. W., et al. Disregulated balance of Th17 and Th1 cells in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research & Therapy. 12, R53 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R.
- Stockringer, B., Veldhoen, M. Differentiation and function of Th17 T cells. Current Opinion in Immunology. 19, 281-286 (2007).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., et al. TGFβ in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24, 179-189 (2006).
- Zou, Y., Zhang, H., et al. Strain-dependent production of interleukin-17/interferon-γ and matrix remodeling-associated genes in experimental Candida albicans keratitis. Mol Vis. 18, 1215-1225 (2012).
