Summary
他のT細胞サブセットとは異なるエフェクター機能を持つ、Th17細胞は、中央炎症性自己免疫に関与している。このインビトロのTh17分化プロトコルは、ナイーブCD4 + Tリンパ球は、Th17細胞に分化することができ、さらに自己免疫および宿主応答におけるそれらの役割を検討するかどうかを決定するための手段を提供する。
Abstract
Th17細胞は、インターロイキン17（IL-17）を産生することが見出されているT細胞の別個のサブセットである、およびTh1、Th2の、および調節T細胞を含む他のT細胞サブセットの機能が異なる。 Th17細胞は、多くの自己免疫疾患に関連した熱心炎症性免疫応答において中心的な原因として浮上している。この方法では、C57BL / 6マウスの脾臓およびリンパ節からのTリンパ球を精製し、制御およびTh17分化を誘導する環境下での精製されたCD4 + T細胞を刺激する。 Th17分化を誘導する環境を、抗CD3および抗CD28抗体、IL-6、およびTGF-βの存在下での刺激を含む。少なくとも72時間、および37℃で最長5日間インキュベートした後、細胞を、続いてフローサイトメトリー、定量PCRおよびELISAを介してIL-17を産生する能力について分析する。 Th17の分化CD4 + CD25-T細胞はさらに、Th17細胞が自己免疫およびホスト·ドの発症および進行に果たす役割を解明するために利用することができる国防。また、個別のマウスノックアウト/疾患モデルからのCD4 + CD25 - リンパ球のTh17の分化は、細胞運命の可塑性の我々の理解に貢献することができます。
Introduction
CD4 + Tリンパ球（T細胞）は、感染性微生物に対する免疫系媒介性防御において重要な役割を果たしている。逆に、T細胞はまた、密接に1型糖尿病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチなどの自己免疫疾患の発症および進行に関連している。 CD4 + Tリンパ球は、T細胞受容体、同族抗原/主要組織適合複合体II（MHCII）の分子と（TCR）相互作用の組み合わせによって活性化され、B7.1/B7.2でCD28受容体の相互作用は15リガンド 。 TCR刺激およびCD28共刺激の提供に加えて、抗原提示細胞は、それによって所与の抗原に対するTリンパ球の応答を導く、Tリンパ球の分化状態を決定するサイトカイン環境を提供する。異なる病原体/抗原提示細胞の相互作用は、イーライに焦点を当てた別個の経路をTリンパ球をダウンスキュー異なるサイトカイン環境を作成する開始病原体のmination。残念ながら、元々の病原体を根絶するために設計された侵入するTリンパ球のエフェクター経路は、誤って自己組織15に向けることができる。したがって、各別個のCD4 + T細胞サブセットの分化状態のより良い理解は、病原体の排除と自己に対する寛容とのバランスを調節する方法についての我々の理解に重要である。
のTh1、Th2の、および誘導性調節性T細胞分化経路に加えて、ナイーブTリンパ球はまた、ダウン経路のTh17サイトカインにより駆動することができる。 Th1細胞は細胞内病原体戦闘一方、Th2細胞は、細胞外病原体を排除し、調節性T細胞（Tregs）は、炎症応答1,16を最小限に抑える、Th17細胞は、細胞外細菌および真菌の排除に重要な役割を果たしている。 Th17細胞は、一般に、系統特異的転写因子であるRORγtの発現およびILの産生を付しているマクロファージおよび好中球1,7の活性化を促進-17A、。
Th17細胞は、幾つかの自己免疫疾患、およびそれらに関連するげっ歯類モデルに関与している。例えば、それはIL-23（Th17の表現型を維持するために必要とされる）ことが実証されているではなく、IL-12、実験的自己免疫性脳炎（EAE）におけるMSのための齧歯類疾患モデル中央犯人であった。それは、その後、IL-17産生の減少がEAEの予防2、6、17に相関することが示されている。また、Th17細胞は、関節炎および全身性エリテマトーデス（SLE）10、16を含む他の自己免疫疾患と関連している。 IL-23 のp19欠損- / -マウスTh17細胞の非常に低い数値を有することが示されており、EAEだけでなく、現像に耐性であるが、コラーゲン誘導関節炎、関節リウマチ10,18のモデルをした。加えて、マウスは、後方にIL-17Aの中和抗体で処置小胞体コラーゲン誘導関節炎の発症はまた、関節損傷18の分解能を有することが見出された。なお、最近の研究はまた、1型糖尿病9,11および腸炎症14におけるTh17細胞の保護的役割が示されているような自己免疫疾患の進行におけるTh17細胞の役割は特徴付けされないままであることに留意されたい。これらの研究は、自己免疫におけるTh17の分化の重要性を確認。
さらなる調査が必要で、少なくとも2困惑の質問があるので、 体外のTh17分化の T細胞の研究に必要なメソッドです。1）どのように正確に、IL-6は、Treg細胞とTh17の分化との間のバランスを調節しないと、2）正確なメカニズムは何ですかIL-17誘導性の炎症性疾患の背後にある？我々の方法は、C57BL / 6マウスの脾臓およびリンパ節からのCD4 + CD25-T細胞を使用する。なお、留意することが重要であることは、不純を使用してTh17の分化を誘導することが可能であるが集団は、少なくとも80％純粋なCD4 + CD25-T細胞の集団を取得することにより、汚染の心配を否定し、より成功のTh17分化の結果を確実にする。適切なTh17の分化を達成するために、CD4 + CD25-T細胞を、それぞれ、抗CD3および抗CD28、活性化シグナルを提供する、1および2の存在下でインキュベートし、IL-6、およびTGF-β。それはIL-23単独ではTh17の分化を達成するために用いることができることが報告されているが、これは後でIL-23がTh17分化細胞集団の安定性のために必要であることが実証されたが、IL-6およびTGF-βは、Th17細胞の分化に必須である3、18、19。マウスの研究は、IL-23受容体は、それらがIL-6およびTGF-β13,18で刺激された後にのみCD4 + T細胞上で発現されることを示した。また、Th17細胞が正常であればIL-6およびTGF-β18,19存在するようなIL-23遮断抗体の存在下で発症する。このように、本のTh17分化プロトコルPROV正常のTh17分化を誘導するために適切な条件をIDES。 Th17の分化のメカニズムのよりよい理解を開発し、IL-17産生が自己免疫疾患13を目的とした、より良い治療法の開発のための機会を提示する。
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Protocol
すべての動物の使用は、施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従って実施した。
1。ミックスとメディアの準備
- 滅菌したPBSのpH：7.3（1リットル）
0.23グラムのNaH 2 POの4
1.15グラムのNa 2 HPO 4
9.0グラムのNaCl
DI水で音量を上げてください。オートクレーブ滅菌する。 - 細胞培養培地（100ミリリットル）
89ミリリットルのRPMI
10ミリリットル、10％FBS
1ミリリットル抗生物質抗真菌（ABAM）100μgを50 mMの2 - メルカプトエタノール（96.5μgのPBSに3.5μgの株式2 - メルカプトエタノール） - FACS緩衝液（蛍光活性化セルソーティング）（フローサイトメトリーの間に使用されるために）、2％FBS、滅菌PBS中
- iTh17ミックス （試料の数に基づいて、すべてのミックスとメディアのために必要な容積を決定）
1.5μg/ mlの抗CD28
20 ng / mlのIL-6
5 ng / mlのTGF-β
2。細胞は以下の条件で三重にメッキされます
- 抗CD3結合したプレートを、抗CD28（これは起動制御ミックスである）。
- iTH17：抗CD3バインドプレート、抗CD28、IL-6、TGF-β。
3。プレートに結合した抗CD3（10μg/ ml）を
これは、プレートに結合した抗CD3プレートの製造は、事前の細胞がプレートに添加される時間に、少なくとも4時間後に行われることをお勧めします。
- ウェルに30μlの抗CD3を追加し、新しい96ウェルU底マイクロテスト組織培養プレート（抗CD3を滅菌PBSで希釈）、およびウェルの均一な被覆を確実にするために、プレートの側面をタップする。それはプレートにミックスやセルを追加するための時間になるまで冷蔵し、その後4時間、37℃で培養します。
4。マウスの解剖
- このプロトコルは、C57BL / 6マイクの使用に基づいているE、3-8ヶ月齢、ジャクソン研究所（バーハーバー、ME）から購入した。
- CO 2窒息を使用して、マウスを犠牲にし、その後の頸椎脱臼で死亡が確認された。
- 70％エタノールでマウスの解剖ツールと切開領域を殺菌し、解剖を始める。
- 腹側のビューから、尿道口の前方で皮膚をつかんであごの領域に到達するまで、腹側正中までハサミで切断始まる。涙や腹膜壁の粘膜にカットしない予防策を講じる。
- 皮膚に引いて、取り外し作業中にリンパ節への快適なアクセスを可能にするために突き止める。
- 収集したリンパ節および脾臓を全てピンセットで除去し、バッファミルテニーバイオテク（リンパ節および脾臓の除去の図について図2及び図3を参照）から購入したランニングをautoMACSを5mlを含む滅菌ペトリ皿に置かれます。
- アール腋窩リンパ節を取り除く各マウスの胸筋の背後にある腋窩（脇の下）の近くで発見。
- 各腋窩の近くに結合組織に配置されている上腕リンパ節を除去します。
- 各マウスの首に見られる表面的な頸部リンパ節を除去します。
- 3血管の連動で、腰部に配置されて鼠径部リンパ節を除去します。
- 腸間膜リンパ節にアクセスするには、腹膜ライニングを通して腹側正中線をカット。腸間膜リンパ節は、腸を一緒に保持する結合組織に見出される。これらは一般的に4〜8ノードの文字列で発見されており、「真珠の文字列」として表示されることがあります。文字列全体を引き出していることを確認してください。
- 脾臓、胃や腸の後ろ、腹部領域に位置しています。膵臓からそれを引き出し、取り外して、それを削除します。
- 2つや消し顕微鏡スライドを使用して無菌フードの下での臓器を挽く。リンパ節や脾臓にを置く1顕微鏡のスライドのつや消し側、そして崩壊したまで、第2のスライドのつや消し側をこする。すべてのリンパ節や脾臓が接地されるまで繰り返します。
注：血はそれが困難なAUTOMACSバッファ内の残りのリンパ節を参照してくださいになりますので、これは、リンパ節で始まり、脾臓で終了することをお勧めします。
- 単一細胞懸濁液に粉砕器官をフィルタリングするには、40ミクロンのナイロン素材のワンピースの上に数回折り畳み、そして15ミリリットルの遠心管の最上部に配置することで始まる。ナイロン素材は、大きく分けて3×3インチでなければなりません
- バッファとグラウンド臓器を実行AUTOMACSの5ミリリットルを吸引する5ミリリットルの注射器と21ゲージ針を使用してください。折り畳まれたナイロン素材に徐々に分注する。針で材料を穿刺しないように注意してください。
注：単一細胞懸濁液が達成されると、溶液はvisibなしで淡い、一貫性のあるソリューションとして表示されます固形組織のル·ピース。固体は、再吸引のままであり、新たを15ml遠心管に入れ、ナイロンの新しい折返し片を介して分配する場合。
- 使用しないときは、常に氷上で細胞を維持する。
5。細胞分離
- 最適な結果を得るために、MACS CD4 + CD25 +調節性T細胞単離キット、マウスを使用して細胞をautoMACS Proのセパレータを介して、少なくとも80％純粋なCD4 + CD25 - 細胞集団を得る。 CD4 + CD25-細胞集団の負の保持のためのプロトコルはミルテニー·バイオテク社を介して得られる。
6。のTh17分化
- とautoMACS Proの電池セパレータで分離した後に、CD4 + CD25 - 細胞集団を収集します。
- 血球計数器を用いてトリパンブルーで1:1000の割合で希釈した細胞を数える。
- 濃度は細胞数から決定されると、細胞培養培地中に1×10 6細胞/ mlの細胞懸濁液を希釈する。
- 4時間後に抗CD3バインドプレートと96ウェルプレートを取り出します。
- 200μlのPBSで抗CD3でコーティングされたウェルを洗浄します。 2回繰り返します。
- 洗浄するために抗CD3でコーティングされたウェルに滅菌PBSを200μlを追加し、廃棄物容器に、PBSを除去します。
- 三重でウェルにiTh17ミックスや起動制御ミックスを100μl（ポイント＃2を参照）を追加します。
- 各ウェルのTh17ミックスや起動制御ミックスのいずれかが置かれたに細胞100μlを加える。
- 少なくとも72時間、または5日間まで細胞をインキュベート（Th17の分化は、72時間後または5日後に得ることができる。）
- のTh17分化は、細胞内染色およびフローサイトメトリー分析、ELISA、またはqPCRにより評価することができる
7。細胞の活性化 （細胞内染色のためにのみ必要）
- 72時間または5日間のいずれかの端部にインキュベーターから96ウェルプレートを外し
- のTh17 differentiatioことを思い出してくださいnが72時間または5日間のいずれかの後に達成することができる。
- 各条件（ 例えば起動制御やiTh17）のために、24ウェル細胞培養プレートの1ウェルに三重にあるセルを転送する。 96ウェルU底培養プレートにトリプリケートであることとは対照的に、一つの条件のための細胞は、現在、24ウェル培養プレートの1ウェルにプールされている。
- 24ウェル細胞培養プレートの各ウェルの総容積は、現在600μLのである。細胞培養培地で各ウェルに1ミリリットルの音量を上げる。
- 記載された濃度で24ウェル細胞培養プレート中の各ウェルにPMA（ホルボールミリステートアセテート）（50 ng / mlの）、イオノマイシン（1μM）、およびBFA（ブレフェルジン-A）（10μg/ mlの）を添加する。
- 4時間37℃でインキュベートする。
8。細胞内染色
- フローサイトメトリー解析のために必要な細胞外および細胞内マーカーで染色した細胞。 oをプレゼンスを検出するfはIL-17は、細胞内染色は、抗IL-17A抗体を用いて行われる。推奨される細胞外表面マーカーは、CD4、CD8、およびCD25が含まれる。
- IL-17細胞内染色のために、BDバイオサイエンスからの細胞内サイトカイン染色スターターキット - マウスを使用しています。
- 各サンプルについて、ペレット細胞は、上清を除去し、200μlのFACSバッファー（PBS中の2％FBS）に再懸濁細胞ペレット。
- 96細胞フローサイトメトリープレートに再懸濁細胞を移す。
- 1,200 rpmで5分間細胞をスピンダウンし、上清を捨てる。
- 200μlのPBS FACS緩衝液、1,200 rpmで5分間遠心を追加し、上澄みを捨てる。
- FACS緩衝液100μlに再懸濁細胞と細胞外抗体100μlの（A-B）の混合物（細胞外抗体混合物をFACS緩衝で作られて）を適用。ホイルで覆い、室温で15分間インキュベートする。
- ステップ8.1.4を繰り返します。
- 手順を繰り返し8.1.5 2X。
- BDのCytofix / Cytoperm緩衝液100μl中に細胞を懸濁します。 Incubホイルで覆い、RTで20分間食べた。
- 1XのBDパーマ/洗浄緩衝液100μl加え、1,200 rpmで5分間遠心し、上清を捨てる。繰り返します。
- 細胞内の抗体混合液50μlを加える。 （細胞内抗体混合物を、1×BDのPerm /洗浄で行われる）箔で覆われたRTで15分間、インキュベートする。
- ステップ8.1.10を繰り返します。
- BD染色緩衝液200μl中に細胞を懸濁します。
- 200μlのBD染色緩衝液（最終容量は400μLである）を含むチューブにフローサイトメトリーに再懸濁した細胞を配置します。
- 4℃で保存サンプルが読み込み可能になるまで。
9。フローサイトメトリー分析
- ゲート生きた細胞集団。
- 生細胞集団からのCD4 + CD8-の人口上のゲート。
- CD4 + CD8-集団から、IL-17A +集団上のゲート。
- 我々の以前の実験結果に基づいて、IL-17A +集団の100％がCD25 +であろう。
*全絶対細胞数は、サンプル三連をプールした後に得られた
CD4 + CD25 + IL-17A +細胞のように、ライブゲートパーセンテージおよび系統特異的マーカー、CD4、CD25、およびIL-17Aを有する全細胞の割合で細胞の総数を乗じることによって求めた。**の絶対数フローサイトメトリーにより決定した。
10。定量PCRおよびELISA
- 場所細胞は、5〜10分間、13,000 rpmで1.5mlのエッペンドルフチューブ、遠心分離、フローサイトメトリー分析のために使用されない。遠心分離後に細胞ペレットに見出される細胞は、qPCR分析のために使用される。 qPCR分析は、PTC-200ペルチェサーマルサイクラー（Biorad）を用いて行った。
- ELISAの遠心分離チューブから上清を収集します。 IL-17A ELISAは、抗体ペアTC11-18H10（キャプチャ、カタログ番号555068）を使用して実施し、TC11-8H4ビオチン（検出、カタログ番号555067）はBD Biosciences社から購入した。 IL-17A ELISA STAndardsはイーバイオサイエンス（カタログ番号14-8171-80）から得た。
- 上清を除去した後、（後で使用するために-80℃でRNA抽出、cDNA合成および定量PCR、または格納のためにすぐに使用する）175μlのRNA溶解緩衝液中でのqPCRに使用する残りの細胞を再懸濁する。
- IL-17Aとアクチンのためのプライマー配列は、表IIを参照してください（ハウスキーピング遺伝子）
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Representative Results
このTh17の分化プロトコルは、脾臓の摘出および腋窩、上腕、腸間膜、頸部、および鼠径リンパ節から始まります。それぞれの位置の表現は、 図2および図3に見出すことができる。図1および図5の両方が、このプロトコルに記載された方法の視覚的表現を提供する。
このTh17のプロトコルは、CD4 + CD25 - Tリンパ球集団から分化に焦点を当てています。これは、とautoMACS Proの細胞分離がプールされ、総リンパ節および脾臓（ 図4）からの私達の希望のCD4 + CD25-の人口を豊かにする方法を効率的に注意することが重要である。未分画をプールし、リンパ節および脾細胞をautoMACSと、分離された画分をフローサイトメトリー分析（ 図4）、続いて抗CD4及びantiCD25抗体で染色した。 図4Aは、CD4 + CD25 +の割合の代表的なプロファイルを示すフローサイトメトリーによる未分画をプールし、リンパ節および脾臓中に存在するCD4 + CD25-リンパ。分離手順は、また、追加の実験（ 図4B）において使用することができるC57BL / 6マウス由来の濃縮されたCD4 + CD25 + Tregの集団を提供する。 図4Cは 、84％のCD4 + CD25-T細胞である集団と我々の所望の細胞濃縮を示すCD4 + CD25 + Tregの大部分が除去されている。我々は一貫して濃縮したCD4 +に存在する小さな非リンパ細胞集団があり、CD25をしますが、分化過程（ 図4C）と干渉しない。当社の豊富なCD4 + CD25-T細胞集団は、より成功のTh17分化を確保するのに役立ちます。
図5は、私たちのTh17分化手順の概略を示している。我々の濃縮されたCD4 + CD25-集団のTh17分化条件下でインキュベートされるか（抗CD3、抗CD28、IL-6、およびTGF-β）または対照（抗CD3、抗CD28）。それは、一方CD25 + Tリンパ球を生じた5日、Th17分化誘導条件下でのインキュベーションのために、抗CD3、抗CD28とCD4 + CD25-Tリンパ球のインキュベーションはIL17はCD4 + CD25 +リンパ球を産生するのサブセットが得られることが、図6に見ることができる。 iTh17条件下での5日間のインキュベーション後に、絶対細胞数の利回り+ CD4 + CD25 + IL-17Aの例については、表1を参照してください。
のTh17分化状態は、さらに、定量的PCRおよびELISAによって評価することができる。制御又はTh17分化を誘導する条件下でインキュベート富化CD4 + CD25-Tリンパ球から7データを提示する図 。 Th17分化条 件下でインキュベートしたCD4 + CD25-Tリンパ球は、定量PCR（ 図7A）およびELISA（ 図7B）を介して確認することができるIL17Aをアップレギュレートする。 Th17分化特異的転写因子のRORγtはまた、Th17分化を誘導する条件下でインキュベートするCD4 + CD25-T細胞によりアップレギュレートされ、およびthr確認することができるウワーッ定量PCR（ 図7A）。
図1。 TH17分化概略図。 37℃で4時間、インキュベーター中で抗CD3 PBSで希釈した（10μg/ ml）を有するU底96ウェルプレートの1ウェルコートに関する。置き板プレートをインキュベートしている間に、マウスからのリンパ節（LN）および脾臓を分析。器官を粉砕し、単一細胞懸濁液を得るために濾過する。 CD4 + CD25 +制御性T細胞単離キットおよびミルテニーをautoMACS Proのセパレータを用いてCD4 + CD25-T細胞を単離する。 CD4 + CD25-細胞は、1×10 6細胞/ mlに希釈すべきである。3。96ウェルプレートの4時間のインキュベーションが完了したら、3×（200μl/ウェル）、PBSでウェルを洗浄する。4。+100μlのCD4の追加CD25-T細胞は、情報（PB）、抗CD3被覆ウェル5プレートに結合した。100μlの抗CD28又は100μlのiTh17のCOCを追加ktail（antiCD28、TGF-β、およびIL-6） 図6は、37℃で3〜5日間プレートをインキュベートインキュベーション後、細胞内染色、定量PCR、および/またはELISAにより分化を評価する。
図2。 LN解剖ガイド。 A）1上腕リンパ節は、マウスの各腋窩（脇の下）の近くに位置し、結合組織に記載されています。、B）1腋窩リンパ節は、胸筋の後ろに、各腋窩に記載されています。C）腸間膜リンパ節は内にあります腸の結合組織。彼らは、真珠の文字列に似ている。D）4浅頚部リンパ節をマウスの頸部に見出される。E）2鼠径リンパ節（各側に1）は3の血管が交わる位置で腰領域に配置することができる。
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図3。脾臓解剖ガイド 。マウスの脾臓、胃や腸の背後体の左側に見られる。単純に引き、ピンセットで分離することにより除去します。
図4。分離前に、ベースラインの細胞集団を確立する。A）、LNおよび脾臓細胞を染色し、 前にプールLNおよび脾臓細胞からとをautoMACS Proの分離後の細胞画分 、ex vivoで、。分離後、CD4 + CD25 +（B）およびCD4 + CD25-（C）画分を、それぞれ、CD4 + CD25 +およびCD4 + CD25-Tリンパ球集団の純度を評価するために染色した。全てのサンプルは、CD4 +およびCD25 +抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
図5。 TH17分化。最大5日間、細胞をインキュベートします。細胞内染色および定量PCR用の細胞を回収し、ELISA用収穫上清。
図6。 TH17分化は、フローサイトメトリーにより評価した 。 CD4 + CD25-Tリンパ球は、プレートに結合した抗CD3、抗CD28、IL-6、およびTGF-β（iTh17）または単独でプレート結合抗CD3および抗CD28の存在下（対照）でインキュベートした。 5日間。次いで、細胞を37℃で4時間、PMAおよびイオノマイシンで活性化した活性化後、細胞のTh17分化を評価するためにフローサイトメトリー分析のために、抗CD4、抗CD8、抗CD25、および抗IL-17A抗体で染色した。 iTh17 = Th17分化誘導Conditions。
図7。 C57BL / 6マウスから定量PCRおよびELISA。リンパ球によって評価したTh17分化は、ソートし、CD4 + CD25-T細胞をプレート結合抗CD3（10μg/ ml）を、抗CD28（1.5μg/ mlの存在下でインキュベートした。 ）、IL-6（20 ng / mlの）、およびTGF-β（5 ng / mlの）、またはプレート結合抗CD3単独の抗CD28（対照）5日間A）細胞を、次いでのRORγtを評価するために回収した定量PCRを介して、およびIL-17Aメッセージ発現。B）上清をELISAによりIL-17Aタンパク質の発現を評価するために回収した。
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Discussion
ここでは、 インビトロでのTh17分化を達成するためのプロトコルを記載している。のTh17サブセットへのTリンパ球の分化はヒト病原体13の効果的な除去のために重要であるとしてのTh17分化の研究は、重要です。逆に、IL17産生は、自己免疫疾患の進行13と関連している。それは、免疫調節および自己免疫の多数の異なるマウスモデルに適用することができるように、Th17の分化の方法は、多くの研究設定にも適用可能である。この方法は、免疫応答を調節するために、IL-17Aおよび転写因子RORγtの表現の産生により、このプロトコルに示されたTh17細胞に分化するために、Tリンパ球の能力に関する質問に答えることができます。また、Th17細胞はまた、IL17F、IL22、およびGM-CSF 8,12の産生により同定することができることが他者によって示されている。このプロトコルは、互いに対して有意である例えば、Th1またはTh2分化のような公知のTリンパ球の分化プロトコルは、より良好なTリンパ球のエフェクター機能は、免疫系の動作に関連するかを理解するために、これらのプロトコルを補完するために使用することができるからである。
これらの実験を実施する際に考慮すべきいくつかの重要なステップがあります。のTh17分化は、不純なCD4 + CD25-集団によって達成することができるが、最も効果的かつ信頼性の高い結果を得るために、少なくとも80％の純度のCD4 + CD25-集団が望まれている。我々の方法は、彼らをautoMACS Proの電池セパレータ用ミルテニーバイオテク社が提供するプロトコルを利用しています。をautoMACS CD4 + CD25 +制御性T細胞単離キットは、マウスは、CD4 + CD25 - 細胞集団をネガティブ選択に使用される。負の選択は、潜在的に、抗体相互作用によって変更されていないナイーブ細胞の使用を可能にする。
フローサイトメトリー分析の特定の細胞表面マーカーを使用して、APの純度を確認することができるopulation。それらは、容易に所望のCD4 + CD25-集団を同定することができるように推奨される表面マーカーは、CD4、CD8、およびCD25である。 B220とのCD11bは、それぞれ、B細胞およびマクロファージ汚染について試験するために使用されてもよい。我々は、この濃度の歩留まり最適な分化することを見出したように、一貫して1×10 6個/ mlに希釈した試料もお勧めします。過去に我々は、多くの場合、高すぎたり低すぎた細胞濃度が細胞の拡大と（そのような歪んだIL-17Aの生産など）にバイアスされ、結果を乱さなかったことを発見した。
これは、使用しないときは、常に氷上でサンプルを保つために覚えておくことも重要です。細胞生存率は、正のTh17分化を達成する上で重要な因子である。これは、トリパンブルー希釈を用いて細胞計数を介して確認することができる。このプロトコルはフロスト顕微鏡スライドとリンパ節および脾臓を粉砕して手動組織均質化を採用しているため、これは時間のかかる方法であり得る。一つの設計MOdificationは、代替オプションとして自動組織解離剤を利用することである。
所望のTh17分化が達成されない場合には、考慮すべきいくつかのトラブルシューティングのヒントが存在する。のTh17分化の真の範囲を適切に測定することができるように、まず、コントロールも慎重に検討する必要があります。我々は、通常、抗CD3および抗CD28刺激を受けたCD4 + Tリンパ球にこれらの結果を比較することにより、Th17の分化の程度を決定する。また、CD4 + Tリンパ球が注文分化で活性化される必要があることを覚えておいてください。 Oneはまた、視覚的にブラスト処理/活性化T細胞の存在を確認するために顕微鏡下で培養した細胞を検査しなければならない。活性化T細胞は、視覚的に刺激されていない細胞よりも有意に大きく見える。クローン性増殖はまた、単一T細胞クローンから誘導された細胞をブラストの可視クラスタを介して観察することができる。細胞の活性化にもverifiすることができますCD4 + CD25 +活性化細胞4を識別するために、抗CD4および抗CD25抗体を用いたフローサイトメトリー分析の使用を介して編
しかしながら、公表されたデータは、Th17の分化がNODおよびBALB / cマウス5、11、20を含む他のマウス系統において達成され得ることを示している、このプロトコルはC57BL / 6マウスで使用するために最適化されていることに言及することも重要である。これは、全体の周波数および分化を受けているCD4 + Tリンパ球の絶対数を含むTh17の分化は、20（例えば、マウス株など）遺伝因子、および（例えば、コロニー位置など）環境因子5に依存し、最適化を必要とし得ることに留意すべきである。
このTh17の分化プロトコルは、さらにのTh17サブセット内の細胞の機能に関する質問に答えるための貴重な手段として機能することができます。のTh17分化の我々の方法は、いくつかの重要な利点を持っています。先に述べたように使用し最小純度80％のCD4 + CD25-細胞集団は、より一貫性のある効果的な微分結果を提供する。とautoMACS Proの電池用セパレータの使用による分離の容易さは、付加的な利点である。さらに、最適なサイトカインや活性化シグナルの使用は、区別するために適切な環境とT細胞を提供します。このプロトコルの将来の影響は、Th17細胞とIL-17Aの生産が自己免疫の発症や進行に関与することで機械的な手段を決定することを含む。
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Disclosures
宣言するの開示。
Acknowledgments
この作品は、フロリダ大学のTL1 TR000066とUL1 TR000064、国立衛生研究所、BDバイオサイエンス試薬の助成金、および大学からの親グラントR01AI056152からダイバーシティ·補完するために、NIH / NCATS臨床およびトランスレーショナル科学賞によって部分的にサポートされていますフロリダ州。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Sterile Polyestrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | 60 mm x 15 mm |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Premium Microscope Slides, Frosted | Fisher Scientific | 12-544-3 | 3" x 1"1 mm |
| 5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle | BD Biosciences | 309632 | |
| Corning 15 ml Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| Nylon 40 microns | Miami Aquaculture | Nylon 40/26 | |
| Microtest tissue culture plate 96 well U bottom | BD Biosciences | 35-3077 | |
| Corning Costar 24 well cell culture plates | Sigma-Aldrich | CL3524 | |
| Eppendorf Tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e | BD Biosciences | 553057 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | |
| Mouse IL-6 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFbeta | R&D Systems | 240-B-002 | |
| Trypan blue solution 0.4 % | Sigma-Aldrich | 66H2364 | |
| Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 558107 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553035 | |
| PE Conjugated Anti-mouse CD25 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 | BD Biosciences | 560820 | |
| Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) | |
| MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | Corning, Cellgro | 10-040-CM | |
| B 2-Mercapt–thanol | MP Biomedical | 194834 | Hazardous |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | |||
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | Hazardous |
| Brefeldin A (BFA) | MP Biomedicals | 159027 | |
| ELISA IL-17A Capture mAb | BD Biosciences | 555068 | |
| ELISA IL-17A Detection mAb | BD Biosciences | 555067 | |
| ELISA IL-17A Standard | eBioscience | 14-8171-80 | |
| IL-2 ELISA Kit | BD Biosciences | 555148 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Biosciences | 555214 | |
| Equipment | |||
| autoMACS Pro Cell Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge | ThermoScientific | ||
| Napco series 8000 WJ CO2 Incubator | ThermoScientific | ||
| PTC-200 Peltier Thermal Cycler | Biorad | ||
References
- Chen, Z., Lin, F., et al. Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17. International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).
- Cua, D. J., Sherlock, J., et al. Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain. Nature. 421, 742-748 (2003).
- El-Behi, M., Rostami, A., et al. Current views on the roles of Th17 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalitis. J. Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
- Inaba, K., Kroide, S., et al. Properties of memory T lymphocytes isolated from the mixed leukocyte reaction. Proc Natl Acad Sci. 82, 7686-7690 (1985).
- L, I. vanovF. rutosR., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 16, 337-349 (2008).
- Jager, L. D., Dabelic, R., et al. The Kinase Inhibitory Region of SOCS-1 is Sufficient to Inhibit T helper-17 Function in Experimental Allergic Encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 232, 08-18 (2011).
- Kimura, A., Kishimoto, T.
- Korn, T., Bettelli, E., et al.
- Kriegel, M. A., Seflk, E., et al. Naturally transmitted segmented filamentous bacteria segregate with diabetes protection in nonobese diabetic mice. PNAS. 108, 11548-11553 (2011).
- Langrish, C. L., Chen, Y., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J. Exp. Med. 201, 233-240 (2005).
- Lau, K., Benitez, P., et al. Inhibition of type 1 diabetes by a Lactobacillus johnsonii mediated Th17 bias. J. Immunol. 186, 3538-3546 (2011).
- Lee, Y., Awasthi, A., et al. Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells. Nat Immunol. 13, 991-999 (2012).
- Litmann, D. R., Rudensky, A. Y. Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation. Cell. 140, 845-858 (2010).
- O'Connor, W. Jr, Kamanaka, M., et al. A protective function for interleukin 17A in T cell-mediated intestinal inflammation. Nat Immunol. 10, 603-609 (2009).
- Picca, C. C., Larkin, J., et al. Role of TCR specificity in CD4+CD25+ regulatory T cell selection. Immunol Rev. 212, 74-85 (2006).
- Shah, K., Lee, W. W., et al. Disregulated balance of Th17 and Th1 cells in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research & Therapy. 12, R53 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R.
- Stockringer, B., Veldhoen, M. Differentiation and function of Th17 T cells. Current Opinion in Immunology. 19, 281-286 (2007).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., et al. TGFβ in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24, 179-189 (2006).
- Zou, Y., Zhang, H., et al. Strain-dependent production of interleukin-17/interferon-γ and matrix remodeling-associated genes in experimental Candida albicans keratitis. Mol Vis. 18, 1215-1225 (2012).
