Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

Published: September 26, 2013 doi: 10.3791/50765
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Cell Science, The University of Florida
* These authors contributed equally

Summary

עם פונקציות מפעיל להבדיל מתת תא T אחר, תאי Th17 היו מעורבים באופן מרכזי באוטואימוניות דלקתיות. במבחנה פרוטוקול בידול Th17 זו מספק אמצעי כדי לקבוע אם לימפוציטים מסוג CD4 + T נאיביים יכולים להתמיין לתאי Th17, ולבחון את תפקידם באוטואימוניות ותגובת מארח נוסף.

Abstract

תאי Th17 הם תת קבוצה ברורה של תאי T שנמצא לייצר אינטרלוקין 17 (IL-17), ונבדלים בפונקציה מתת התא האחר T כולל Th1, Th2, ותאי T רגולטוריים. Th17 תאים צמחו כאשם מרכזי בתגובות חיסוניים דלקתיות נלהבים מדי קשורות עם הרבה הפרעות אוטואימוניות. בשיטה זו אנו מטהרים לימפוציטים מסוג T מבלוטות הלימפה של הטחול ועכברי C57BL / 6, ולעורר תאי CD4 + T מטוהרים תחת שליטה וסביבות Th17 וישכנע. הסביבה וישכנע Th17 כוללת גירוי בנוכחות נוגדנים אנטי CD3 ואנטי CD28, IL-6, וTGF-β. לאחר דגירה לפחות 72 שעות ועד חמישה ימים על 37 מעלות צלזיוס, תאים מנותחים לאחר מכן ליכולת לייצר IL-17 באמצעות cytometry זרימה, qPCR, וELISAs. יכולים להיות מנוצלים על תאי CD4 + CD25-T Th17 המובחן כדי להבהיר את התפקיד שתאי Th17 לשחק בתחילת ההתקדמות של אוטואימוניות ודה מארח נוסףfense. יתר על כן, התמיינות Th17 של CD4 + CD25-לימפוציטים מדגמי נוקאאוט / מחלה עכבריות מובחנים יכולה לתרום להבנה של פלסטיות גורל תא שלנו.

Introduction

לימפוציטים מסוג CD4 + T (תאי T) לשחק תפקיד קריטי בהגנה בתיווך מערכת חיסון כנגד מיקרואורגניזמים מזהמים. לעומת זאת, תאי T גם קשר אינטימי עם תחילת ההתקדמות של מחלות אוטואימוניות כגון סוכרת מסוג 1, זאבת אדמנתית מערכתית, ודלקת מפרקים שגרונית. לימפוציטים מסוג CD4 + T להיות מופעלים באמצעות שילוב של קולטן תא T אינטראקציות (TCR) עם אנטיגן מאותו המקור / מורכב histocompatibility גדול השנייה מולקולות (MHCII), ואינטראקציות הקולטן CD28 עם B7.1/B7.2 ligands 15. בנוסף למתן גירוי TCR CD28 ושיתוף גירוי, תאי מציגי אנטיגן גם לספק סביבת ציטוקינים, הקובעת את מצב ההתמיינות של הלימפוציטים T, ובכך לכוון את התגובה של הלימפוציטים T לאנטיגן נתון. אינטראקציות הפתוגן מובחן / תא אנטיגן הצגה ליצור סביבות ציטוקינים שונות, אשר להטות T לימפוציטים למטה מסלולים שונים התמקדו באלייmination של הפתוגן ייזום. למרבה הצער, מסלולי מפעיל לימפוציט T, שנועדו במקור למיגור פולש פתוגנים, יכולים להיות מופנים בטעות נגד רקמות עצמי 15. לכן, הבנה טובה יותר של מצב הבידול של כל תת קבוצה של תאי CD4 + ברורה היא קריטית להבנה של איך לווסת את האיזון בין החיסול של פתוגנים וסובלנות לעצמי שלנו.

בנוסף לTh1, Th2, ומסלולי התמיינות תאי T רגולטוריים מושרה, יכול גם להיות מונע על לימפוציטים מסוג T נאיבי ידי ציטוקינים במורד מסלול Th17. ואילו פתוגנים תאיים לחימה תאי Th1, תאי Th2 לחסל פתוגנים תאיים, ותאי T רגולטוריים (Tregs) למזער תגובות דלקתיות 1, 16; תאי Th17 לשחק תפקיד חשוב בחיסול חיידקים ופטריות תאיים. Th17 תאים בדרך כלל מצוינים על ידי ביטוי של גורם הייחוס ספציפי לשעתוק RORγT וייצור של IL-17A, אשר מקדם את ההפעלה של מקרופאגים ונויטרופילים 1, 7.

תאי Th17 היו מעורבים בכמה הפרעות אוטואימוניות, ומודלים של המכרסמים הקשורים בם. כך, למשל, הודגם כי IL-23 (אשר נדרש כדי לקיים את הפנוטיפ Th17), אך לא IL-12, הוא האשם המרכזי בדלקת המוח אוטואימונית הניסויי (EAE), מודל המחלה המכרסם לטרשת נפוצה. זה לאחר מכן הוכח כי הפחתה בייצור IL-17 מתואמות לEAE מניעה 2, 6, 17. יתר על כן, תאי Th17 נקשרו עם הפרעות אוטואימוניות אחרות, כולל דלקת מפרקים וזאבת (לופוס) 10, 16. IL-23 p19 לקוי - / - עכברים הראו את מספרים נמוכים מאוד של תאי Th17, והם עמידים לפיתוח לא רק EAE, אלא גם בדלקת מפרקים קולגן-Induced, מודל לדלקת מפרקים שגרונית 10, 18. בנוסף, עכברים שטופלו בנוגדנים מנטרלים IL-17A בקע מירכי ספינהאה את התחלתה של דלקת מפרקים שנגרם קולגן נמצאה גם יש רזולוציה של נזק משותף 18. יצוין, כי תפקידיו של Th17 תאים בהתקדמות של מחלות אוטואימוניות עדיין לא מאופיינים כמו מחקר שנעשה לאחרונה הראה גם תפקיד המגן של תאי Th17 בסוכרת מהסוג 1 9, 11 ודלקת מעיים 14. מחקרים אלה מאשרים את החשיבות של בידול Th17 באוטואימוניות.

בבידול Th17 מבחנה היא שיטת צורך במחקר בתאי T, כי יש לפחות שתי שאלות המביכות שדורשות חקירה נוספת: 1) איך בדיוק IL-6 אין להסדיר את האיזון בין Treg ובידול Th17, ו 2) מה הם המנגנונים המדויקים מאחורי IL-מושרה 17 מחלות דלקתיות? השיטה שלנו מעסיקה תאי CD4 + CD25-T מהטחול ובלוטות לימפה של עכבר C57BL / 6. חשוב לציין כי למרות שזה אפשרי כדי לגרום לבידול Th17 באמצעות טמאאוכלוסייה, רכישה לפחות 80% CD4 טהור + אוכלוסיית תאי CD25-T שוללת כל דאגה של זיהום ומבטיחה תוצאות בידול Th17 מוצלחות יותר. על מנת להשיג בידול Th17 תקין, תאים מסוג CD4 + CD25-T מודגרת בנוכחות אנטי CD3 ואנטי CD28, המספקים אותות הפעלה, 1 ו -2, בהתאמה, ו-IL-6, וTGF-β. למרות שזה כבר דווח כי IL-23 לבדו יכול לשמש כדי להשיג בידול Th17, זה היה מאוחר יותר הוכיח כי IL-23 הוא הכרחי ליציבותה של אוכלוסיית תאי Th17, אבל IL-6 ו TGF-β הוא חיוניים לבידול Th17 3, 18, ​​19. מחקרים עכבריים הראו כי קולטן IL-23 מתבטא בתאים מסוג CD4 + T רק לאחר שהם כבר מגורה עם IL-6 ו TGF-β 13, 18. כמו כן, תאי Th17 יהיו בהצלחה לפתח בנוכחות של IL-חסימת 23 נוגדנים כל עוד IL-6 ו TGF-β נמצאים 18, 19. ככזה, prov פרוטוקול בידול Th17 זהאידו התנאים המתאימים כדי לגרום לבידול Th17 בהצלחה. פיתוח הבנה טובה יותר של מנגנוני בידול Th17 ו-IL-17 ייצור נוכחי ההזדמנות לפיתוח תרופות טובות יותר שמטרתה הפרעות אוטואימוניות 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השימוש בבעלי החיים נערכו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש.

1. הכנת תערובות ומדיה

  1. pH סטרילי PBS: 7.3 (1 ליטר)
    0.23 גרם לאא 2 PO 4
    1.15 גרם Na 2 HPO 4
    9.0 גרם NaCl
    קח את נפח עם מים די. לעקר עם החיטוי.
  2. תא תרבות מדיה (100 מיליליטר)
    89 RPMI מיליליטר
    10 מיליליטר 10% FBS
    1 מיליליטר האנטיביוטיקה antimycotic (ABAM) 100 מיקרוגרם 50 מ"מ 2-mercaptoethanol (3.5 מיקרוגרם המניה 2-mercaptoethanol ל96.5 מיקרוגרם PBS)
  3. 2% FBS FACS חיץ (Cell פלורסנט ההפעלה של מיון) (כדי לשמש במהלך cytometry זרימה) בPBS סטרילי
  4. iTh17 מיקס (בהתבסס על מספר דוגמאות, לקבוע את עוצמת הקול דרוש לכל תערובות והתקשורת)
    1.5 מיקרוגרם / מיליליטר אנטי CD28
    20 ng / ml IL-6
    5 ng / mlTGF-β

2. תאים יהיו מצופים בשלושה עותקים בתנאים הבאים

  1. צלחת מחויבת אנטי CD3, אנטי CD28 (זה תמהיל שליטת הפעלה).
  2. iTH17: צלחת מחויבת אנטי CD3, אנטי CD28, IL-6, TGF-β.

3. אנטי CD3 הנכנס פלייט (10 מיקרוגרם / מיליליטר)

מומלץ כי הכנת צלחות אנטי CD3 הנכנס צלחת נעשה לפחות 4 שעות לפני מועד תאים יתווספו לצלחות.

  1. הוסף 30 μl אנטי CD3 לבארות (אנטי CD3 הוא מדולל PBS סטרילי) של צלחת חדשה 96 גם U תחתון Microtest רקמות תרבות, ולהקיש על הצדדים של הצלחת כדי להבטיח כיסוי אחיד של הבארות. לדגור על C ° 37 עבור 4 שעות, ולאחר מכן שומרים במקרר עד שהגיעו הזמן להוסיף את תערובות ותאים לצלחת.

4. העכבר Dissection

  1. פרוטוקול זה מבוסס על השימוש בC57BL / 6 מיקרופוןדואר, 3-8 חודשים של גיל, ושנרכש מהמעבדה ג'קסון (בר הרבור, ME).
  2. להקריב את העכבר באמצעות CO מחנק 2, ולאשר את המוות עם נקע בצוואר הרחם שלאחר מכן.
  3. לעקר כלים לנתיחה עכברים ואזור חתך עם 70% אתנול ולהתחיל נתיחה.
  4. מתצוגת הגחון, לתפוס את העור, כי הוא קדמי לפתיחת השופכה ולהתחיל לחתוך במספריים את קו האמצע הגחון עד שמגיע לאזור הסנטר. לנקוט באמצעי זהירות שלא לקרוע או לחתוך לציפוי הפנימי של קיר הבטן.
  5. משוך לאחור על העור ולהצמיד כדי לאפשר גישה נוחה לבלוטות הלימפה בעת ההסרה.
  6. בלוטות לימפה והטחול ייאספו כל יוסרו עם מלקחיים, והניחו בצלחת פטרי סטרילית המכילה 5 מיליליטר של autoMACS הפעלת המאגר נרכש מMiltenyi יוטכנולוגיים (ראה איורים 2 ו -3 לבלוטות לימפה ודיאגרמות הסרת טחול).
    1. הסר את בלוטות הלימפה בבית השחי, כי הםנמצא ליד בית השחי (בית השחי) מאחורי שרירי החזה של כל עכבר.
    2. הסר את בלוטות הלימפה זרוע הנמצאות ברקמות חיבור הממוקמים בסמוך זה לבית השחי.
    3. הסר את בלוטות הלימפה בצוואר הרחם השטחיות שנמצאו בצווארו של כל עכבר.
    4. הסר את בלוטות הלימפה מפשעתי אשר ממוקמות באזור הירך בשילוב של כלי דם 3.
    5. כדי לגשת לבלוטות לימפה mesenteric, לחתוך דרך הצפק עד קו האמצע הגחון. בלוטות לימפה mesenteric נמצאות ברקמת החיבור שמחזיק את המעיים ביחד. בדרך כלל הם נמצאים בשרשרת של 4-8 צמתים, ועשויים להופיע כ" מחרוזת פנינים ". הקפד לשלוף את המחרוזת כולה.
    6. הטחול נמצא באזור הבטן, מאחורי הקיבה ומעיים. להסיר אותה על ידי משיכת וניתוקו מהלבלב.
  7. טוחן את האיברים מתחת למכסת מנוע סטרילית באמצעות 2 שקופיות מיקרוסקופ חלבית. הנח בלוטות הלימפה או טחול עלבצד החלבית של שקופית אחת מיקרוסקופ, ולשפשף עם צד חלבית של השקופית השנייה ועד מתפורר. חזור על פעולה עד שכל בלוטות הלימפה והטחול כבר טחונים.

הערה: מומלץ להתחיל עם בלוטות לימפה ולסיים עם הטחול, כמו הדם יעשה את זה קשה לראות את בלוטות הלימפה שנותרו במאגר autoMACs.

  1. כדי לסנן איברי קרקע לתוך השעיה תא בודדת, להתחיל על ידי קיפול מעל פיסת ניילון 40 מיקרומטר כמה פעמים חומר, והצבה בחלקו העליון של צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. חומר הניילון צריך להיות בערך 3 x 3 פנימה
  2. השתמש במזרק 5 מיליליטר ו21 מחט G כדי לשאוב 5 מיליליטר של autoMACs ריצת איברי חיץ והקרקע. לוותר לאט לתוך חומר הניילון המקופל. תשמור על עצמך כדי למנוע ניקוב החומר עם המחט.

הערה: לאחר ההשעיה תא בודד מושגת, הפתרון צריך להופיע כפתרון חיוור, עולה בקנה אחד עם שום visibחתיכות le של רקמה מוצקה. אם תישאר מוצקים, מחדש לשאוב ולוותר על דרך פיסה מקופלת חדשה מניילון להציב צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר חדש.

  1. תמיד לשמור על תאים על קרח כאשר אינו בשימוש.

5. הפרדת תאים

  1. לקבלת תוצאות אופטימליות, להשיג לפחות 80% CD4 טהור + אוכלוסיית CD25 תאים באמצעות מפריד הנייד Pro autoMACS באמצעות MACS CD4 + CD25 + T רגולטוריים בידוד תא הערכה, העכבר. הפרוטוקול לשימור השלילי של אוכלוסיית CD25-תאי CD4 + מתקבל באמצעות Miltenyi ביוטכנולוגיים.

6. בידול Th17

  1. לאסוף את אוכלוסיית CD25-תאי CD4 + אחרי פרידה עם מפריד הנייד Pro autoMACS.
  2. ספירת תאים בדילול מלא ביחס 1:1000 עם trypan הכחול באמצעות hemocytometer.
  3. ברגע שהריכוז כבר נקבע מספירת תאים, לדלל השעיה תא 1 x 10 6 תאים / מיליליטר בתקשורת תרבות תא.
  4. קח את 96 צלחות גם עם הצלחת מחויבת אנטי CD3 לאחר 4 שעות.
  5. לשטוף בארות מצופות-CD3 אנטי עם 200 μl של PBS. חזור על 2 פעמים.
    1. לשטוף להוסיף 200 μl של PBS סטרילי לבארות מצופים אנטי CD3 ולהסיר PBS לתוך מיכל פסולת.
  6. הוספה של תמהיל iTh17 או תערובת שליטת הפעלת 100 μl (ראה # נקודה 2) לבארות בשלושה עותקים.
  7. הוספה של תאים 100 μl לכל טוב שבו בכל תמהיל Th17 או תמהיל שליטת ההפעלה הושם.
  8. דגירה תאים לפחות 72 שעה או עד 5 ימים (ניתן להשיג בידול Th17 לאחר 72 שעה או לאחר 5 ימים.)
  9. בידול Th17 ניתן להעריך על ידי ניתוח תאיים מכתים ותזרים cytometric, ELISA, או qPCR

7. הפעלת תא (נחוץ רק לתאי מכתים)

  1. הסר 96 צלחות גם מחממות בסוף גם 72 שעות או 5 ימים
    1. נזכיר כי differentiatio Th17n יכול להיות מושגת לאחר שני 72 שעות או 5 ימים.
  2. עבור כל תנאי (שליטה למשל הפעלה או iTh17), להעביר תאים שנמצאים בשלושה עותקים לאחד טוב של צלחת תרבית תאים גם 24. התאים לתנאי אחד יש עכשיו כבר אספו לתוך אחד טוב של צלחת התרבות גם 24, בניגוד להיותו בשלושה עותקים בצלחת התרבות גם U התחתונה 96.
  3. הנפח הכולל של כל טוב בצלחת תרבית תאי 24 גם הוא החברה 600 μl. להעלות את עוצמת הקול של כל אחד גם למ"ל 1 עם תקשורת תרבות תא.
  4. הוספת PMA (אצטט phorbol Myristate) (50 ng / ml), ionomycin (1 מיקרומטר), והתואר הראשון (Brefeldin-) (10 מיקרוגרם / מיליליטר) היטב כל אחד בצלחת תרבית תאים גם 24 בריכוזים מופיעים ברשימה.
  5. לדגור על C ° 37 במשך 4 שעות.

8. מכתים תאיים

  1. תאי כתם עם הסמנים תאיים ו תאיים הרצויים לניתוח התזרים cytometric. כדי לזהות את נוכחות oו IL-17, מכתים תאיים נעשה עם נוגדנים נגד IL-17A. סמני משטח תאיים מומלצים כוללים CD4, CD8, וCD25.
    1. השתמש תאית ציטוקין מכתים Starter Kit-מאוס מBD Bioscience עבור מכתים IL-17 תאיים.
    2. עבור כל דגימה, תאים גלולה, להסיר supernatant, ו resuspend תא גלולה ב200 μl FACS חיץ (2% FBS PBS).
    3. העבר את תאי resuspended ל96 תא זרימת cytometry צלחת.
    4. ספין למטה תאים 5 דקות ב1,200 סל"ד וזורקים supernatant.
    5. הוסף 200 PBS חיץ FACS μl, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 1,200 סל"ד, וזורקים supernatant.
    6. תאי resuspend ב של FACS 100 μl חיץ ולהחיל של נוגדנים תאיים 100 μl תערובת (AB) (תערובת Ab תאית מורכבת בחיץ FACS). דגירה של 15 דקות ב RT, מכוסות בנייר כסף.
    7. חזור על השלב 8.1.4.
    8. 2x חזור על צעד 8.1.5.
    9. Resuspend תאים בשל BD Cytofix / Cytoperm הצפת 100 μl. Incubאכלתי ל20 דקות ב RT, מכוסות בנייר כסף.
    10. הוספה של חיץ 1x BD פרם / לשטוף 100 μl, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 1,200 סל"ד, וזורקים supernatant. חזור על פעולה.
    11. הוסף 50 μl של תערובת Ab תאית. (תערובת תאית Ab הוא עשה ב1x BD פרם / לשטוף) דגירה במשך 15 דקות ב RT, מכוסה בנייר כסף.
    12. חזור על שלב 8.1.10.
    13. Resuspend תאים ב200 μl של BD מכתים הצפת.
    14. מקום תאי resuspended לcytometry זרימת צינורות המכילים 200 μl BD מכתים חוצץ (נפח סופי הוא 400 μl).
    15. חנות ב 4 ° C עד דגימות מוכנות לקריאה.

9. תזרים cytometric ניתוח

  1. אוכלוסיית תא חי שער.
  2. מאוכלוסיית התא החי, שער בCD4 + CD8-אוכלוסייה.
  3. מסוג CD4 + CD8-האוכלוסייה, שער על IL-17A + אוכלוסייה.
    1. בהתבסס על תוצאות הניסוי הקודמות שלנו, של IL-17A + האוכלוסייה 100% יהיו + CD25.

* ספירת תאים מוחלטת סך הכל התקבלו לאחר איגום triplicates המדגם
** מספר מוחלט של CD4 + CD25 + IL-17A + תאים נקבע על ידי הכפלת המספר הכולל של תאים על ידי אחוז השער החי ואחוז התאים בסך הכל נושאים את סמני שושלת ספציפית, מסוג CD4, CD25, ו-IL-17A, כפי נקבע על ידי cytometry זרימה.

10. qPCR וELISA

  1. תאי מקום שאינו משמשים לניתוח התזרים cytometric בצינור 1.5 מיליליטר Eppendorf ו צנטריפוגות ב 13,000 סל"ד 5-10 דק '. התאים הנמצאים בתא גלולה לאחר צנטריפוגה ישמשו לניתוח qPCR. ניתוח qPCR בוצע באמצעות Cycler תרמית PTC-200 Peltier (BioRad).
  2. איסוף supernatant מן הצינורות centrifuged לELISAs. IL-17A ELISAs בוצע באמצעות צמד נוגדן TC11-18H10 (לכידה, מספר קטלוג 555,068) וביוטין TC11-8H4 (זיהוי, מספר קטלוג 555,067) שנרכש מBiosciences BD. IL-17A ELISA standards התקבלו מeBioscience (מספר קטלוג 14-8171-80).
  3. לאחר הסרת supernatant, resuspend התאים שנותרו כדי לשמש לqPCR ב175 מאגר תמוגה RNA μl (להשתמש באופן מיידי להפקת RNA, סינתזת cDNA, וqPCR, או בחנות ב-80 ° C לשימוש מאוחר יותר).
    1. עיין בטבלה השנייה לרצפי פריימר לIL-17A ויקטין (גן בית שמירה)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול הבחנה זו Th17 מתחיל עם ההסרה של הטחול ובית השחי, זרוע, mesenteric, צוואר הרחם, ובלוטות לימפה מפשעתי. ניתן למצוא ייצוג של המיקומים של כל אחד באיורים 2 ו -3. איורים 1 ו 5 שניהם מספקים ייצוג חזותי של השיטות שתוארו בפרוטוקול זה.

פרוטוקול Th17 זה מתמקד בבידול מאוכלוסיית הלימפוציטים מסוג CD4 + CD25-T. חשוב לציין באיזו יעילות הפרדת תא Pro autoMACS מעשירה CD4 הרצוי + CD25-אוכלוסייה מהצומת ונקוותה סך הלימפה והטחול (איור 4). , צומת unfractionated נקוותה לימפה וsplenocytes, ושברי autoMACS המופרדים הוכתמו עם נוגדני antiCD4 וantiCD25 אחרי ניתוח התזרים cytometric (איור 4). איור 4A מציג פרופיל מייצג של אחוז מסוג CD4 + CD25 +וCD4 + CD25-ימפוציטים הווה ב, בלוטות לימפה ונקווה unfractionated וטחול על ידי cytometry זרימה. הליך הבידוד מספק גם אוכלוסייה מסוג CD4 + CD25 + Treg מועשר מעכברי C57BL / 6 אשר יכול לשמש בניסויים נוספים (איור 4). איור 4C מציג העשרת התא הרצויה שלנו עם אוכלוסייה שהיא 84% תאי CD4 + CD25-T, עם הרוב המכריע של CD4 + CD25 + Tregs הוסר. יש לנו באופן עקבי אוכלוסיית תא שאינו הלימפה קטנה, שנמצאת בסוג CD4 + המועשר CD25-, אבל האם זה לא יפריע לתהליך ההתמיינות (איור 4C). אוכלוסיית התא שלנו העשירה מסוג CD4 + CD25-T מסייעת להבטיח בידול Th17 מוצלח יותר.

איור 5 מראה סכמטי של הליך בידול Th17 שלנו. + CD25-CD4 האוכלוסייה המועשר שלנו גם היא מודגרות בתנאי ההבחנה Th17 (אנטי CD3, אנטי CD28, IL-6, וTGF-β) או שליטה (אנטי CD3, אנטי CD28). ניתן לראות באיור 6 שבעוד דגירה של לימפוציטים מסוג CD4 + CD25-T עם אנטי CD3, אנטי CD28 במשך 5 ימים הניבו לימפוציטים מסוג CD25 + T, דגירה בתנאי גרימת Th17 הניבה משנה של IL17 הפקה מסוג CD4 + CD25 + לימפוציטים. אנא עיין בטבלת 1 לדוגמאות של CD4 + CD25 + IL-17A + תשואות מספר מוחלטות לתא לאחר דגירה של 5 ימים בתנאי iTh17.

מצב בידול Th17 נוסף ניתן להעריך באמצעות PCR כמוני וELISA. איור 7 מציג נתונים לימפוציטים מסוג CD4 + CD25-T מועשרים מודגרות תחת שליטה או תנאי Th17 וישכנע. לימפוציטים מסוג CD4 + CD25-T מודגרות בתנאי Th17 להסדיר את-IL17A, אשר יכול להיות הוברר דרך qPCR (איור 7 א) וELISA (איור 7). גורם שעתוק Th17 הספציפי RORγT גם שהוגברו על ידי תאים מסוג CD4 + CD25-T מודגרות בתנאי Th17 וישכנע, וניתן לקביעה through qPCR (איור 7 א).

איור 1
איור 1. סכמטי בידול Th17. 1. בארות סמל של צלחת גם 96 תחתית-U עם אנטי CD3 (10 מיקרוגרם / מיליליטר) בדילול מלא PBS. 2. צלחת מקום בחממה במשך 4 שעות ב 37 ° C. בעוד צלחת היא דוגרת, לנתח בלוטות לימפה (LN) וטחול מעכבר. טוחן את האיברים ולסנן לקבל השעיה תא בודדת. בודד תאי CD4 + CD25-T באמצעות ערכת בידוד תאי CD4 + CD25 + T רגולטורים ומפריד Pro Miltenyi autoMACS. CD4 + CD25-תאים צריך להיות מדולל ל 1 x 10 6 תאים / מיליליטר. 3. לאחר 4 שעות של הדגירה הצלחת 96 גם היא מלאה, לשטוף בארות עם PBS (200 μl / טוב) 3x. 4. הוספת 100 μl מסוג CD4 + תאי CD25-T לצלחת-מאוגדים (PB) בארות אנטי CD3 מצופים. 5. הוספת 100 μl אנטי CD28 או 100 μl coc iTh17 ktail (antiCD28, TGF-β, ו-IL-6). 6. דגירה צלחת במשך 3 או 5 ימים ב 37 ° C. הדגירה הבאה להעריך בידול על ידי צביעה תאית, qPCR, ו / או ELISA.

איור 2
איור 2. מדריך Dissection LN. א) ניתן למצוא לימפה צומת זרוע 1 ברקמת החיבור הממוקמת בסמוך זה לבית השחי (בית השחי) של עכבר. ב ') ניתן למצוא בלוטות לימפה בבית השחי 1 בכל בית השחי, מאחורי שרירי החזה. C) בלוטות לימפה mesenteric ממוקמים ב רקמת חיבור של המעיים. הם דומים למחרוזת פנינים. ד ') 4 בלוטות לימפה בצוואר הרחם שטחיות נמצאות בצוואר של העכבר. E) 2 בלוטות לימפה מפשעתי (1 בכל צד) יכולות להיות ממוקמות באזור הירך במיקום שבו 3 כלי דם נפגשים .

. = "תמיד"> בתוך עמודים איור 3
איור 3. טחול מדריך לנתיחה. טחול עכבר נמצא בצד השמאל של הגוף מאחורי הקיבה ומעיים. פשוט להסיר על ידי משיכת והפרדה עם המלקחיים.

איור 4
איור 4. ברים ניידים מLN נקווה ותאי טחול לפני ואחרי תאי הפרדת LN Pro autoMACS.) והטחול היו מוכתמים, לשעבר vivo, להקים אוכלוסיות תאי בסיס לפני ההפרדה. ההפרדה הבאה, מסוג CD4 + CD25 + (ב) ו CD25-שברים מסוג CD4 + (ג) היו מוכתמים להעריך טוהר של CD4 + CD25 + ואוכלוסיות לימפוציטים מסוג CD4 + CD25-T, בהתאמה. כל הדגימות הוכתמו מסוג CD4 + ו + CD25 נוגדנים ונותחו על ידי cytometry זרימה.

jove_content "עבור: together.within-לשמור על עמודים =" תמיד "> איור 5
איור 5. Th17 בידול. דגירה תאים לתקופה של עד 5 ימים. קציר תאים מכתימים תאיים וqPCR; supernatants קציר לELISA.

איור 6
איור 6. בידול Th17 הוערך על ידי cytometry זרימה. לימפוציטים מסוג CD4 + CD25-T הודגרו בנוכחות מאוגד צלחת אנטי CD3, אנטי CD28, IL-6, וTGF-β (iTh17) או צלחת בכריכה אנטי CD3 ואנטי CD28 בלבד (בקרה) עבור 5 ימים. תאים לאחר מכן הופעלו עם PMA וionomycin עבור 4 שעות ב 37 ° C. לאחר הפעלה, תאים היו מוכתמים אנטי CD4, אנטי CD8, אנטי CD25, ונוגדנים נגד IL-17A לניתוח התזרים cytometric להעריך בידול Th17. iTh17 = Th17 ג התרמהonditions.

איור 7
איור 7. בידול Th17 הוערך על ידי qPCR וELISA. לימפוציטים מעכברי C57BL / 6 מוינו ותאי CD4 + CD25-T הודגרו בנוכחות, אנטי CD28 (מיליליטר 1.5 מיקרוגרם / אנטי CD3 (10 מיקרוגרם / מיליליטר) בכריכת צלחת ), IL-6 (20 ng / ml), וTGF-β (5 ng / ml) או) תאי צלחת בכריכה אנטי CD3 ואנטי CD28 בלבד (בקרה) למשך 5 ימים. היו אז נקטפו להעריך RORγT Supernatants וביטוי הודעת IL-17A באמצעות qPCR. B) נקצרו להעריך ביטוי חלבון IL-17A על ידי ELISA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן יש לנו תיארתי את הפרוטוקול כדי להשיג בידול Th17 במבחנה. המחקר של בידול Th17 חשוב, כמו בידול של T לימפוציטים מסוג למשנה Th17 הוא קריטי לחיסול היעיל של פתוגנים אנושיים 13. לעומת זאת, ייצור IL17 נקשר עם התקדמות מחלה אוטואימונית 13. השיטה של ​​בידול Th17 ישימה להגדרות מחקר רבות כפי שהוא יכול להיות מיושם על מודלים עכבריים מובהקים רבים של רגולציה ואוטואימוניות חיסונית. שיטה זו מסייעת לענות על שאלות בנוגע ליכולתם של לימפוציטים מסוג T, להתמיין לתא Th17, מצוינת בפרוטוקול זה על ידי הייצור של IL-17A והביטוי של גורם שעתוק RORγT, כדי לווסת את התגובה חיסונית. יתר על כן, הוכח על ידי אחרים שיכולים גם להיות מזוהים Th17 תאים על ידי הייצור של IL17F, Il22, ו-GM-CSF 8, 12. פרוטוקול זה הוא משמעותי ביחס לאחריםפרוטוקולים ידועים T התמיינות לימפוציטים, כגון Th1 או Th2 בידול, כי ניתן להשתמש בו כדי להשלים את הפרוטוקולים אלה כדי להבין טובים יותר כיצד פונקציות מפעיל לימפוציט T מתייחסות לפעולת מערכת חיסונית.

ישנם מספר צעדים קריטיים בחשבון בעת ​​ביצוע ניסויים אלה. בידול Th17 יכול להיות מושגת באמצעות CD4 + CD25-אוכלוסייה טמאה, אבל לתוצאות האפקטיביות ואמינות ביותר, מסוג CD4 + CD25-אוכלוסייה של טוהר לפחות 80% הוא רצוי. השיטה שלנו מנצלת את הפרוטוקול המסופק על ידי Miltenyi יוטכנולוגיים למפריד הנייד שלהם autoMACS Pro. קיט + CD25 autoMACS CD4 + T רגולטורי בידוד תא, עכבר משמש לסלקציה שלילית של אוכלוסיית CD25-תאי CD4 +. סלקציה שלילית מאפשרת לשימוש בתאים נאיביים שלא היה שינו באופן פוטנציאלי על ידי אינטראקציות נוגדן.

באמצעות סמנים פני תא מסוימים בניתוח התזרים cytometric יכול לאשר את הטוהר של apopulation. סמני המשטח המומלץ הם מסוג CD4, CD8, CD25 וכפי שהם יכולים בקלות לזהות את הסוג CD4 + הרצויים CD25-אוכלוסייה. B220 וCD11b עשוי לשמש לבדיקת תא B וזיהום מקרופאג, בהתאמה. דגימות מדוללת באופן עקבי ל1 x 10 6 תאים / מיליליטר מומלץ גם כן מצאנו שהבידול האופטימלי תשואות הריכוז הזה. בעבר מצאנו כי ריכוזי תא שהיו גבוהים מדי או נמוכים מדי לעתים קרובות מוטרדים התרחבות סלולרית ותוצאות מוטות (כגון ייצור IL-17A מוטה).

כמו כן, חשוב לזכור לשמור על דגימות קרח בכל העת כאשר אינו בשימוש. כדאיות תא היא גורם חשוב בהשגת בידול Th17 חיובי. זה יכול להיות אישר באמצעות ספירת תאים באמצעות דילולים trypan כחולים. מכיוון שפרוטוקול זה מעסיק המגון רקמה ידנית על ידי שחיקה בלוטות לימפה וטחול עם שקופיות מיקרוסקופ חלבית, זו יכולה להיות שיטת זמן רב. מו עיצוב אחדdification הוא לנצל dissociators רקמות אוטומטית כאופציה חלופית.

במקרה שבידול Th17 הרצוי אינו מושגת, יש כמה טיפים ירי צרות שיש לשקול. ראשית, פקדים חייבים להיות גם לשקול בזהירות, כך שההיקף האמיתי של בידול Th17 ניתן למדוד כמו שצריך. אנחנו בדרך כלל לקבוע את מידת בידול Th17 על ידי השוואת תוצאות אלה לימפוציטים מסוג CD4 + T מקבל אנטי CD3 בלבד וגירוי אנטי CD28. זכור גם כי לימפוציטים מסוג CD4 + T צריכים להיות מופעלים בלהבדיל סדר. גם אחד צריך לבדוק חזותי תאים בתרבית תחת מיקרוסקופ כדי לאשר את קיומו של ארור / תאי T מופעלים. תאי T מופעלים מופיעים חזותי באופן משמעותי גדולים יותר מאשר תאים שלא היה מגורה. התרחבות משובט גם ניתן לצפות באמצעות אשכולות גלויים של פיצוץ תאים שכבר נגזרו משיבוט תא T אחד. הפעלת תא יכולה להיות גם verified באמצעות השימוש בניתוח התזרים cytometric באמצעות אנטי CD4 ונוגדנים נגד CD25 לזהות תאים + הופעלו מסוג CD4 + CD25 4

כמו כן, חשוב לציין כי פרוטוקול זה כבר מותאם לשימוש עם עכברי C57BL / 6, לעומת זאת פרסמו נתונים מראה כי בידול Th17 עשוי להיות מושגת בזנים אחרים, כולל עכבר NOD ועכברי BALB / ג 5, 11, 20. יצוין, כי בידול Th17, כוללים תדירות כוללת ומספר מוחלט של לימפוציטים מסוג CD4 + T עוברים התמיינות, תלוי בגורמים גנטיים (כגון זן עכבר) 20, וגורמים סביבתיים (כגון מיקום מושבה) 5 ועשוי לדרוש אופטימיזציה.

פרוטוקול הבחנה זו Th17 יכול לשמש כאמצעי רב ערך כדי לענות על עוד שאלות בנוגע לתפקודם של תאים בקבוצת משנה Th17. יש השיטה של ​​בידול Th17 שלנו יש כמה יתרונות משמעותיים. כפי שהוזכר בעבר השימוששל 80% CD4 טהור מינימום + אוכלוסיית CD25 התא מספקת תוצאת בידול יותר עקבית ויעילה. קלות בידוד באמצעות שימוש במפריד תא Pro autoMACS היא יתרון נוסף. יתר על כן השימוש באותות ציטוקינים והפעלה אופטימליים מספק תאי T עם הסביבה המתאימה שבו תוכל להבדיל. השלכות עתידיות עבור פרוטוקול זה כוללים קביעת האמצעים מכניסטית שבו תאי Th17 והייצור של IL-17A מעורבים בהתפרצות וההתקדמות של אוטואימוניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין גילויים להכריז.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי פרסים NIH / NCATS הקליני וTranslational המדע לאוניברסיטת פלורידה TL1 TR000066 וUL1 TR000064, תוספת גיוון מההורה גרנט R01AI056152 מהמכון הלאומי לבריאות, מענק מגיב BD Biosciences, ואת האוניברסיטה פלורידה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Sterile Polyestrene Petri Dish Fisher Scientific 0875713A 60 mm x 15 mm
autoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Premium Microscope Slides, Frosted Fisher Scientific 12-544-3 3" x 1"1 mm
5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle BD Biosciences 309632
Corning 15 ml Centrifuge Tubes Sigma-Aldrich CLS430791
Nylon 40 microns Miami Aquaculture Nylon 40/26
Microtest tissue culture plate 96 well U bottom BD Biosciences 35-3077
Corning Costar 24 well cell culture plates Sigma-Aldrich CL3524
Eppendorf Tubes 1.5 ml Fisher Scientific 05-408-129
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e BD Biosciences 553057
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 BD Biosciences 553294
Mouse IL-6 Recombinant Protein eBioscience 14-8061-62
TGFbeta R&D Systems 240-B-002
Trypan blue solution 0.4 % Sigma-Aldrich 66H2364
Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 BD Biosciences 558107
APC Rat Anti-Mouse CD8a BD Biosciences 553035
PE Conjugated Anti-mouse CD25 eBioscience E01155-516
Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 BD Biosciences 560820
Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse BD Biosciences 51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse Miltenyi Biotec 130-091-221
ABAM Cellgro 30-004-CI
RPMI Corning, Cellgro 10-040-CM
B 2-Mercapt–thanol MP Biomedical 194834 Hazardous
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)
Ionomycin Calcium Salt Sigma-Aldrich 13909-1ML Hazardous
Brefeldin A (BFA) MP Biomedicals 159027
ELISA IL-17A Capture mAb BD Biosciences 555068
ELISA IL-17A Detection mAb BD Biosciences 555067
ELISA IL-17A Standard eBioscience 14-8171-80
IL-2 ELISA Kit BD Biosciences 555148
TMB Substrate Reagent Set BD Biosciences 555214
Equipment
autoMACS Pro Cell Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
Sorvall Legend RT+ Centrifuge ThermoScientific
Napco series 8000 WJ CO2 Incubator ThermoScientific
PTC-200 Peltier Thermal Cycler Biorad

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, Z., Lin, F., et al. Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17. International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).
  2. Cua, D. J., Sherlock, J., et al. Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain. Nature. 421, 742-748 (2003).
  3. El-Behi, M., Rostami, A., et al. Current views on the roles of Th17 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalitis. J. Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
  4. Inaba, K., Kroide, S., et al. Properties of memory T lymphocytes isolated from the mixed leukocyte reaction. Proc Natl Acad Sci. 82, 7686-7690 (1985).
  5. L, I. vanovF. rutosR., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 16, 337-349 (2008).
  6. Jager, L. D., Dabelic, R., et al. The Kinase Inhibitory Region of SOCS-1 is Sufficient to Inhibit T helper-17 Function in Experimental Allergic Encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 232, 08-18 (2011).
  7. Kimura, A., Kishimoto, T. IL-6: regulator of Treg/Th17 balance. Eur. J. Immunol. 40, 1830-1835 (2010).
  8. Korn, T., Bettelli, E., et al. IL-17 and Th17 Cells. Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).
  9. Kriegel, M. A., Seflk, E., et al. Naturally transmitted segmented filamentous bacteria segregate with diabetes protection in nonobese diabetic mice. PNAS. 108, 11548-11553 (2011).
  10. Langrish, C. L., Chen, Y., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J. Exp. Med. 201, 233-240 (2005).
  11. Lau, K., Benitez, P., et al. Inhibition of type 1 diabetes by a Lactobacillus johnsonii mediated Th17 bias. J. Immunol. 186, 3538-3546 (2011).
  12. Lee, Y., Awasthi, A., et al. Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells. Nat Immunol. 13, 991-999 (2012).
  13. Litmann, D. R., Rudensky, A. Y. Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation. Cell. 140, 845-858 (2010).
  14. O'Connor, W. Jr, Kamanaka, M., et al. A protective function for interleukin 17A in T cell-mediated intestinal inflammation. Nat Immunol. 10, 603-609 (2009).
  15. Picca, C. C., Larkin, J., et al. Role of TCR specificity in CD4+CD25+ regulatory T cell selection. Immunol Rev. 212, 74-85 (2006).
  16. Shah, K., Lee, W. W., et al. Disregulated balance of Th17 and Th1 cells in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research & Therapy. 12, R53 (2010).
  17. Sospedra, M., Martin, R. Immunology of Multiple Sclerosis. Annu. Rev. Immunol. 23, 683-747 (2005).
  18. Stockringer, B., Veldhoen, M. Differentiation and function of Th17 T cells. Current Opinion in Immunology. 19, 281-286 (2007).
  19. Veldhoen, M., Hocking, R. J., et al. TGFβ in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24, 179-189 (2006).
  20. Zou, Y., Zhang, H., et al. Strain-dependent production of interleukin-17/interferon-γ and matrix remodeling-associated genes in experimental Candida albicans keratitis. Mol Vis. 18, 1215-1225 (2012).

Tags

אימונולוגיה גיליון 79 ביולוגיה תאית ביולוגיה מולקולרית רפואה זיהום תאי Th17 IL-17 בידול Th17 תאי T אוטואימוניות תא בידוד תרבות
בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bedoya, S. K., Wilson, T. D.,… More

Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin III, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naïve CD4 T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (79), e50765, doi:10.3791/50765 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter