Summary
Med effektorfunktioner skilda från andra T-cellgrupper, har Th17 celler varit centralt inblandad i inflammatoriska autoimmunitet. Denna in vitro Th17 differentiering protokollet ger en möjlighet att avgöra om naiva CD4 + T-lymfocyter kan differentiera till Th17 celler, och för att ytterligare undersöka deras roll i autoimmunitet och värdsvar.
Abstract
Th17 celler är en distinkt undergrupp av T-celler som har befunnits producera interleukin-17 (IL-17), och skiljer sig i funktion från de andra T-cellundergrupper inklusive Th1, Th2, och reglerande T-celler. Th17 celler har dykt upp som en central boven i nitiska inflammatoriska immunsvar i samband med flera autoimmuna sjukdomar. I denna metod renar vi T-lymfocyter från mjälte och lymfkörtlar från C57BL / 6 möss, och stimulera renade CD4 + T-celler under kontroll och Th17-inducerande miljöer. Den Th17 framkallande miljö omfattar stimulering i närvaro av anti-CD3 och anti-CD28-antikroppar, IL-6 och TGF-β. Efter inkubation under minst 72 timmar och upp till fem dagar vid 37 ° C, är cellerna därefter analyseras för förmågan att producera IL-17 genom flödescytometri, qPCR och ELISA. Th17 differentierade CD4 + CD25-T-celler kan användas för att ytterligare belysa den roll som Th17 celler spelar i uppkomsten och utvecklingen av autoimmunitet och värd defense. Dessutom kan Th17 differentiering av CD4 + CD25-lymfocyter från olika musmodeller knockout / sjukdoms bidra till vår förståelse av cellens öde plasticitet.
Introduction
CD4 + T-lymfocyter (T-celler) spelar en kritisk roll i immunsystemet medierad försvar mot infektiösa mikroorganismer. Omvänt är T-celler också intimt förknippat med uppkomsten och utvecklingen av autoimmuna sjukdomar som typ 1-diabetes, systemisk lupus erythematosus, och reumatoid artrit. CD4 + T-lymfocyter blir aktiverade genom en kombination av T-cellsreceptor (TCR) interaktioner med besläktade antigen / MHC II (MHCII) molekyler, och CD28-receptorinteraktioner med B7.1/B7.2 ligander 15. Förutom tillhandahållandet av TCR-stimulering och CD28-samstimulering, antigenpresenterande celler ger också en cytokin miljö, som bestämmer differentier tillstånd av T-lymfocyten, därigenom rikta T-lymfocyt-svar på det givna antigenet. Tydlig patogen / antigenpresenterande cell interaktioner skapar distinkta cytokin miljöer, som skeva T lymfocyter ner skilda vägar fokuserade på Eliställandet av den initierande patogenen. Tyvärr, T-lymfocyter effektor vägar, som ursprungligen utformats för att utrota invaderande patogener, kan felaktigt riktas mot själv vävnader 15. Därför är avgörande för vår förståelse av hur man kan modulera balansen mellan elimineringen av patogener och tolerans att själv bättre förståelse för varje distinkt CD4 + T-cell delmängd s differentieringstillstånd.
Förutom den Th1, Th2, och inducerbara regulatoriska T-celldifferentieringsvägar, kan naiva T-lymfocyter också drivas av cytokiner nerför Th17 reaktionsväg. Skäl Th1 celler strids intracellulära patogener, eliminera Th2-celler extracellulära patogener, och reglerande T-celler (Tregs) minimera inflammatoriska svar 1, 16; Th17 celler spelar en viktig roll när det gäller att eliminera extracellulära bakterier och svampar. Th17 celler är allmänt betecknad med expression av härstamning specifik transkriptionsfaktör RORγT och produktion av IL-17A, som främjar aktivering av makrofager och neutrofiler 1, 7.
Th17 celler har implicerats i flera autoimmuna sjukdomar, med ingående gnagarmodeller. Till exempel har det visats att IL-23 (som krävs för att upprätthålla den Th17 fenotyp), men inte IL-12, var den centrala gärningsmannen i experimentell autoimmun encefalit (EAE), modellen gnagare sjukdom för MS. Det har senare visat sig att minskning av IL-17 produktion är korrelerade till EAE förebyggande 2, 6, 17. Dessutom har Th17 celler förknippats med andra autoimmuna sjukdomar, bland annat artrit och systemisk lupus erythematosus (SLE) 10, 16. IL-23 brist p19 - / - möss visade sig ha mycket låga antal av Th17-celler, och är resistenta mot att utveckla inte bara EAE, men även kollagen-inducerad artrit, en modell för reumatoid artrit 10, 18. Dessutom möss som behandlats med neutraliserande IL-17A-antikroppar aftER uppkomsten av kollagen-inducerad artrit befanns också ha resolution av ledskada 18. Det bör noteras att den roll som Th17 celler i förloppet av autoimmun sjukdom återstår att karakteriseras som senare forskning har också visat en skyddande roll av Th17 celler i typ 1-diabetes 9, 11 och tarminflammation 14. Dessa studier bekräftar vikten av Th17 differentiering i autoimmunitet.
In vitro Th17 differentiering är en nödvändig metod i T-cellsforskning för att det finns åtminstone två förbryllande frågor som kräver ytterligare undersökning: 1) Hur exakt gör IL-6 reglerar balansen mellan Treg och Th17 differentiering, och 2) vad är de exakta mekanismerna bakom IL-17-inducerad inflammationssjukdomar? Vår metod använder CD4 + CD25-T-celler från mjälte och lymfkörtlar hos C57BL / 6 mus. Det är viktigt att notera att även om det är möjligt att inducera Th17 differentiering med användning av en orenbefolkning, skaffa åtminstone en 80% ren CD4 + CD25-T-cell population förnekar några bekymmer för förorening och säkerställer mer framgångsrika Th17 differentiering resultat. För att uppnå korrekt Th17 differentiering, är CD4 + CD25-T-celler inkuberades i närvaro av anti-CD3 och anti-CD28, som tillhandahåller aktiveringssignaler, 1 och 2, respektive, och IL-6 och TGF-β. Även om det har rapporterats att IL-23 i sig kan användas för att uppnå Th17 differentiering visade det senare visat att IL-23 är nödvändiga för stabiliteten av Th17 cellpopulationen, men IL-6 och TGF-β är väsentliga för Th17 differentiering 3, 18, 19. Murina studier har visat att IL-23-receptor uttrycks på CD4 +-T-celler endast efter att de har stimulerats med IL-6 och TGF-β 13, 18. Dessutom kommer celler Th17 framgångsrikt utvecklas i närvaro av IL-23-blockerande antikroppar, så länge som IL-6 och TGF-β är närvarande 18, 19. Som sådan här Th17 differentiering protokoll provIdes de rätta förutsättningarna för att lyckas förmå Th17 differentiering. Utveckling av en bättre förståelse av de mekanismer som ligger bakom Th17 differentiering och IL-17 produktion presentera möjligheten för utveckling av bättre terapier som syftar till autoimmuna sjukdomar 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All användning av djur har utförts i enlighet med protokoll som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Beredning av Mixer och media
- Steril PBS pH: 7,3 (1 L)
0,23 g NaH 2 PO 4
1,15 g Na 2 HPO 4
9,0 g NaCl
Tag upp volymen med avjoniserat vatten. Sterilisera med autoklav. - Cell Culture Media (100 ml)
89 ml RPMI
10 ml 10% FBS
1 ml Antibiotikum Antimykotisk (Abam) 100 | ig 50 mM 2-merkaptoetanol (3,5 | ig lager 2-merkaptoetanol till 96,5 | ig PBS) - FACS buffert (Fluorescent Aktivera cellsortering) (Används vid flödescytometri) 2% FBS i steril PBS
- iTh17 Mix (Baserat på antalet prov, bestämma den volym som krävs för alla blandningar och media)
1,5 ^ g / ml anti-CD28-
20 ng / ml IL-6
5 ng / mlTGF-β
2. Cellerna kommer att Plated trefaldigt under följande villkor
- Plansch bunden anti-CD3, anti-CD28 (detta är aktiveringsstyran mix).
- iTH17: platta bunden anti-CD3, anti-CD28, IL-6, TGF-β.
3. Plattbundet anti-CD3 (10 ng / ml)
Det rekommenderas att framställningen av plattbundet anti-CD3-plattor görs minst 4 h före den tid som celler kommer att tillsättas till plattorna.
- Tillsätt 30 ^ il anti-CD3 till brunnar (anti-CD3-spädes i steril PBS) av en ny 96 brunnars U botten Microtest vävnadsodlingsplatta, och knacka på sidorna av plattan för att säkerställa en enhetlig täckning av brunnarna. Inkubera vid 37 ° C under 4 timmar, och sedan i kylskåp tills det är dags att lägga till de blandar och cellerna till plattan.
4. Mus Dissection
- Detta protokoll är baserad på användningen av C57BL / 6 mice, 3-8 månaders ålder, och köpt från The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).
- Sacrifice musen med CO 2 kvävning, och bekräfta döden med efterföljande halsdislokation.
- Sterilisera möss dissektion verktyg och snitt område med 70% etanol och börja dissektion.
- Från den ventrala uppfattning, ta tag i huden som är främre av urinrörets öppning och börjar klippa med sax upp den ventrala mittlinjen fram till att hakan. Vidta försiktighetsåtgärder inte att riva eller skuren i slemhinnan i bukväggen.
- Dra tillbaka på huden och sätta fingret på att tillåta bekväm tillgång till lymfkörtlarna under borttagning.
- De lymfknutor och mjältar samlats in kommer alla att tas bort med pincett, och placerades i en steril petriskål innehållande 5 ml av autoMACS löpbufferten inköptes från Miltenyi Biotec (se figurerna 2 och 3 för lymfkörtel och mjälte flytt diagram).
- Ta bort de lymfkörtlar som ärhittades nära armhålan (armhåla) bakom bröstmusklerna för varje mus.
- Ta bort de brachial lymfkörtlar som finns i den bindväv som ligger nära varje axill.
- Ta bort de ytliga cervikala lymfkörtlar som finns i halsen på varje mus.
- Ta inguinal lymfkörtlar som är belägna i höften vid kombination av blodkärlen 3.
- För att komma åt kröslymfknutor, skär genom peritoneal foder upp den ventrala mittlinjen. Kröslymfknuta påträffas i bindväven som håller tarmen tillsammans. De är i allmänhet finns i en sträng med 4-8 noder, och kan visas som ett "pärlband". Se till att dra ut hela strängen.
- Mjälten är belägen i buken, bakom magsäcken och tarmarna. Ta bort den genom att dra och tar bort den från bukspottkörteln.
- Grind organ i en steril huva med 2 frostade objektglas. Placera lymfkörtlar eller mjälte påden frostade sidan av ett objektglas, och gnugga med frostade sidan av den andra sliden tills sönder. Upprepa tills samtliga lymfknutor och mjälte har malts.
OBS: Vi rekommenderar att börja med lymfkörtlarna och avsluta med mjälten, eftersom blodet kommer att göra det svårt att se de återstående lymfkörtlar i AutoMACS buffert.
- För att filtrera jordorgan i en enda cellsuspension, börja genom att vika över en bit av 40 | im nylonmaterial flera gånger, och placering i den övre delen av ett 15 ml centrifugrör. Nylonmaterialet bör vara ungefär 3 x 3 tum
- Använd en 5 ml spruta och 21 G nål för att suga ut 5 ml av AutoMACS löpbufferten och jordorgan. Fördela långsamt i den vikta nylonmaterial. Var försiktig för att undvika att punktera material med nålen.
Anm: När enkelcellsuspension åstadkoms, bör lösningen visas som bleka, konsekvent lösning utan Siktle bitar av solid vävnad. Om lösningen innehåller partiklar, åter aspirera och dispensera genom en ny vikt bit nylon placerades i ett nytt 15 ml centrifugrör.
- Alltid hålla cellerna på is när de inte används.
5. Cellseparation
- För bästa resultat, få åtminstone en 80% ren CD4 + CD25-cellpopulationen genom autoMACS Pro cellseparator hjälp av MACS CD4 + CD25 + regulatoriska T-cell isolering kit, mus. Protokollet för den negativa retention av CD4 + CD25-cellpopulationen erhållits genom Miltenyi Biotec.
6. Th17 Differentiering
- Samla CD4 + CD25-cellpopulation efter separation med autoMACS Pro Cell Separator.
- Räkna celler utspädda i en 1:1000-förhållande med trypanblått med användning av en hemocytometer.
- När koncentrationen har bestämts från cellräkningar, utspädd cellsuspension till 1 x 10 6 celler / ml i cellodlingsmedium.
- Ta ut 96-brunnsplattor med platta bunden anti-CD3 efter 4 tim.
- Tvätta anti-CD3-belagda brunnar med 200 | il PBS. Upprepa 2 gånger.
- Att tvätta lägg 200 | il av steril PBS till anti-CD3-belagda brunnar och avlägsna PBS i en avfallsbehållare.
- Addera 100 pl av iTh17 blandning eller aktiveringsstyran blandning (se punkt # 2) till brunnarna i triplikat.
- Tillsätt 100 | il celler till varje brunn i vilken antingen det Th17 blandning eller aktiveringsstyranmixen har placerats.
- Inkubera cellerna i minst 72 timmar eller minst 5 dag (kan Th17 differentiering uppnås efter 72 h eller efter 5 dagar.)
- Th17 differentiering kan bedömas genom intracellulär färgning och flödescytometrisk analys, ELISA, eller qPCR
7. Cellaktivering (endast nödvändigt för intracellulär färgning)
- Ta 96-brunnsplattor från inkubatorer vid slutet av antingen 72 h eller 5 dagar
- Minns att Th17 differentiation kan uppnås efter antingen 72 timmar eller 5 dagar.
- För varje tillstånd (t ex aktiveringsstyran eller iTh17), överför celler som är i triplikat i en brunn i en 24 väl cellodlingsplatta. Cellerna för ett tillstånd har nu poolas till en brunn i 24 brunnars odlingsplatta, i motsats till att vara i triplikat i 96 brunnars U bottnad odlingsplatta.
- Den totala volymen av varje brunn i 24-brunnars cellodlingsplatta nu är 600 | il. Öka volymen i varje brunn till en ml med cellodlingsmedia.
- Lägg PMA (forbolmyristatacetat) (50 ng / ml), jonomycin (1 pM), och BFA (Brefeldin-A) (10 | ig / ml) till varje brunn i 24-brunnars cellodlingsplatta vid de angivna koncentrationerna.
- Inkubera vid 37 ° C under 4 timmar.
8. Intracellulär färgning
- Fläck-celler med de önskade extracellulära och intracellulära markörer för flödescytometrisk analys. För att upptäcka förekomst of IL-17, är intracellulär färgning görs med anti-IL-17A-antikroppar. Rekommenderade cellulära ytmarkörer inkluderar CD4, CD8 och CD25.
- Använd Intracellulär cytokin färgning Starter Kit-mus från BD Bioscience för IL-17 intracellulär färgning.
- För varje prov pelletceller, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 200 | il FACS-buffert (2% FBS i PBS).
- Överför resuspenderade cellerna till 96 cell flödescytometri plattan.
- Snurra cellerna ner i 5 min vid 1200 rpm och kassera supernatanten.
- Addera 200 pl PBS FACS-buffert, centrifugera under 5 min vid 1200 rpm, och kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellerna i 100 | il FACS-buffert och applicera 100 | il av extracellulär antikropp (Ab)-blandning (extracellulär Ab blandningen göres i FACS-buffert). Inkubera i 15 minuter vid RT, täckt med folie.
- Upprepa steg 8.1.4.
- Upprepa steg 8.1.5 2x.
- Återsuspendera cellerna i 100 | il av BD Cytofix / Cytoperm buffert. Incubåt för 20 min vid RT, täckt med folie.
- Addera 100 pl av 1x BD Perm / tvättbuffert, centrifugera under 5 min vid 1200 rpm, och kassera supernatanten. Upprepa.
- Lägg till 50 l av intracellulär Ab blandning. (Intracellular Ab blandningen görs i 1x BD Perm / Wash) Inkubera i 15 min vid RT, täckt med folie.
- Upprepa steg 8.1.10.
- Återsuspendera cellerna i 200 | il av BD färgningsbuffert.
- Placera resuspenderade celler i flödescytometri rör innehållande 200 ^ BD färgning buffert (slutvolym är 400 l).
- Lagra vid 4 ° C tills proverna är redo att läsas.
9. Flödescytometrisk analys
- Gate levande cellpopulationen.
- Från den levande cellpopulation, grind på CD4 + CD8-populationen.
- Från CD4 + CD8-befolkningen, grind på IL-17A + befolkning.
- Baserat på våra tidigare experimentella resultat, kommer 100% av IL-17A + befolkning vara CD25 +.
* Totala absoluta celltal erhölls efter sammanslagning prov tre exemplar
** Absoluta antalet CD4 + CD25 + IL-17A +-celler bestämdes genom att multiplicera det totala antalet celler av den levande grind procentandel och den procentandel av de totala celler som bär de härstamningsspecifika markörer, CD4, CD25 och IL-17A, som bestämdes genom flödescytometri.
10. qPCR och ELISA
- Placera cellerna som inte används för flödescytometrisk analys i ett 1,5 ml Eppendorf-rör och centrifugera vid 13000 rpm under 5 till 10 min. De celler som finns i cellpelleten efter centrifugering kommer att användas för qPCR analys. qPCR analys utfördes med hjälp av PTC-200 Peltier Värmecykel (Biorad).
- Samla supernatanten från den centrifugerade rör för ELISA. IL-17A ELISA utfördes med hjälp av antikropps par TC11-18H10 (capture, katalognummer 555068) och TC11-8H4 biotin (upptäckt, katalognummer 555.067) köpt från BD Biosciences. IL-17A-ELISA STAndards erhölls från eBiosciencen (katalognummer 14-8171-80).
- Efter avlägsnande av supernatanten, resuspendera de kvarvarande cellerna som skall användas för qPCR i 175 | il RNA-lysbuffert (använd omedelbart för RNA-extraktion, cDNA-syntes, och qPCR eller förvara vid -80 ° C för senare användning).
- Se tabell II för primer sekvenser för IL-17A och aktin (house-keeping gen)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna Th17 differentiering protokoll börjar med avlägsnandet av mjälten och armhålan, brachial, mesenteriska, cervikal och inguinala lymfknutor. En representation av placeringen av varje kan hittas i figurerna 2 och 3. Figurerna 1 och 5 både ge en visuell representation av de metoder som beskrivs i detta protokoll.
Denna Th17 protokoll fokuserar på differentiering av CD4 + CD25-T-lymfocyter befolkningen. Det är viktigt att notera hur effektivt autoMACS Pro cellseparation berikar vår önskade CD4 + CD25-populationen från den sammanslagna totala lymfkörtel och mjälte (Figur 4). Den ofraktionerade, poolades lymfkörtel och splenocyter samt de autoMACS-separerade fraktionerna färgades med antiCD4 och antiCD25 antikroppar följt av flödescytometrisk analys (Figur 4). Figur 4A visar en representativ profil av procentandelen CD4 + CD25 +och CD4 + CD25-lymfocyter är närvarande i de ofraktionerade poolade lymfkörtlar och mjälte genom flödescytometri. Isoleringsförfarandet ger också en berikad CD4 + CD25 + Treg befolkningen från C57BL / 6 möss som kan användas i ytterligare experiment (figur 4B). Figur 4C visar vår önskade cell anrikning med en befolkning som är 84% CD4 + CD25-T-celler, med den stora majoriteten av CD4 + CD25 + tregs bort. Vi har alltid en liten icke-lymfoida cellpopulation som finns i berikade CD4 + CD25-, men gör det inte stör den differentieringsprocess (Figur 4C). Vår berikad CD4 + CD25-T-cell population bidrar till att säkerställa en mer framgångsrik Th17 differentiering.
Figur 5 visar en schematisk av vår Th17 differentieringsförfarandet. Vår berikad CD4 + CD25-populationen antingen inkuberas under Th17 differentieringsbetingelser (anti-CD3, anti-CD28, IL-6 och TGF-β) eller kontroll (anti-CD3, anti-CD28). Det kan ses i figur 6 att medan inkubering av CD4 + CD25-T-lymfocyter med anti-CD3, anti-CD28 för 5 dagar gav CD25 + T-lymfocyter, inkubation enligt Th17 inducerande betingelser gav en delmängd av IL17 producerande CD4 + CD25 +-lymfocyter. Se tabell 1 för exempel på CD4 + CD25 + IL-17A + absoluta cellnummer avkastning efter 5 dagars inkubation i iTh17 förhållanden.
Th17 differentiering status kan vidare bedömas genom kvantitativ PCR och ELISA. Figur 7 presenterar data från berikade CD4 + CD25-T-lymfocyter inkuberas under kontroll eller Th17-inducerande förhållanden. CD4 + CD25-T-lymfocyter inkuberas under Th17 betingelser uppreglera IL17A, vilket kan fastställas genom qPCR (figur 7A) och ELISA (Figur 7B). Den Th17-specifika transkriptionsfaktorn RORγT också uppregleras av CD4 + CD25-T-celler inkuberade i enlighet Th17-inducerande betingelser, och kan fastställas thrgrundlig qPCR (figur 7A).
Figur 1. Th17 Differentiering schema. 1. Coat brunnar i U-bottnade 96-brunnsplatta med anti-CD3 (10 ng / ml) spädd i PBS. 2. Placera plattan i inkubatorn under 4 h vid 37 ° C. Medan platta ruvar, dissekera lymfkörtlar (LN) och mjälte från mus. Grind organ och filtrera för att erhålla en enkelcellsuspension. Isolera CD4 + CD25-T-celler med hjälp av CD4 + CD25 + Regulatory T-cell Isolation Kit och Miltenyi autoMACS Pro Separator. CD4 + CD25-celler bör spädas till 1 x 10 6 celler / ml. 3. När fyra timmars inkubering av plattan med 96 brunnar är fullständig, tvättas brunnarna med PBS (200 | il / brunn) 3x. 4. Tillsätt 100 | il av CD4 + CD25-T-celler att plattbundet (PB) anti-CD3-belagda brunnar. 5. Tillsätt 100 | il anti-CD28-eller 100 pl iTh17 cocktail (antiCD28, TGF-β, och IL-6). 6. Inkubera plattan under 3 eller 5 dagar vid 37 ° C. Efter inkubation bedöma differentiering av intracellulär färgning, qPCR, och / eller ELISA.
Figur 2. LN Dissection Guide. A) en brakial lymfkörtel kan hittas i bindväven som ligger nära varje axill (armhåla) för musen. B) en axillär lymfkörtel kan hittas i varje armhåla, bakom bröstmusklerna. C) mesenteriska lymfkörtlar är belägna i bindväv i tarmarna. De liknar ett pärlband. D) 4 ytliga cervikala lymfkörtlar finns i nacken av musen. E) 2 inguinal lymfkörtlar (en på varje sida) kan placeras i höften på den plats där tre blodkärl träffas .
. Inom-page = "alltid"> 
Figur 3. Spleen dissektion guide. Mus mjältar finns på den vänstra sidan av kroppen bakom magen och tarmarna. Helt enkelt ta bort genom att dra och separera med pincett.
Figur 4. Cell fraktioner från poolade LN och mjältceller före och efter autoMACS Pro separation. A) LN och mjältceller färgades, ex vivo, för att fastställa nominella cellpopulationer före separationen. Efter separation, CD4 + CD25 + (B) och CD4 + CD25-(C)-fraktionerna färgades att bedöma renheten av CD4 + CD25 + och CD4 + CD25-T-lymfocytpopulationer, respektive. Alla proverna färgades med CD4 + och CD25 +-antikroppar och analyserades med flödescytometri.
Figur 5. Th17 differentiering. Inkubera cellerna i upp till 5 dagar. Harvest celler för intracellulär färgning och qPCR, skörd supernatanter för ELISA.
Figur 6. Th17 differentiering utvärderas genom flödescytometri. CD4 + CD25-T-lymfocyter inkuberades i närvaro av plattbundet anti-CD3, anti-CD28, IL-6 och TGF-β (iTh17) eller plattbundet anti-CD3 och anti-CD28 enbart (kontroll) under 5 dagar. Celler aktiverades sedan med PMA och Ionomycin under 4 h vid 37 ° C. Efter aktivering, färgades cellerna med anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25 och anti-IL-17A antikroppar för flödescytometrisk analys för att bedöma Th17 differentiering. iTh17 = Th17 inducera cILLKOR.
Figur 7. Th17 differentiering fastställdes genom qPCR och ELISA. Lymfocyter från C57BL / 6 möss sorterades och CD4 + CD25-T-celler inkuberades i närvaro av plattbundet anti-CD3 (10 ng / ml), anti-CD28 (1,5 ug / ml ), IL-6 (20 ng / ml) och TGF-β (5 ng / ml) eller plattbundet anti-CD3 och anti-CD28 enbart (kontroll) under 5 dagar. A) Celler skördades därefter för att bedöma RORγT och IL-17A meddelande uttryck via qPCR. B) Supernatanter skördades för att bedöma IL-17A proteinuttryck med ELISA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har vi beskrivit det protokoll för att uppnå in vitro Th17 differentiering. Studien av Th17 differentiering är viktig, eftersom differentieringen av T-lymfocyter in i Th17 delmängd är kritisk för en effektiv eliminering av humana patogener 13. Omvänt har IL17 produktion förknippats med autoimmun sjukdomsprogression 13. Förfarande enligt Th17 differentiering är tillämpbar på många forskningsinställningar som det kan tillämpas på ett stort antal distinkta murina modeller av immunreglering och autoimmunitet. Denna metod hjälper till att svara på frågor om förmågan hos T-lymfocyter, att differentiera till en Th17 cell, betecknat i detta protokoll genom produktionen av IL-17A och uttryck av transkriptionsfaktorn RORγT, för att modulera immunsvar. Dessutom har det visat sig av andra att Th17 celler också kan identifieras genom framställning av IL17F, Il22, och GM-CSF-8, 12. Detta protokoll är av betydelse med avseende på annankända T lymfocyter differentieringsprotokoll som Th1 eller Th2-differentiering, eftersom det kan användas för att komplettera dessa protokoll för att bättre förstå hur T-lymfocyter effektorfunktioner avser immunsystemet funktion.
Det finns flera viktiga steg för att tänka på när man utför dessa experiment. Th17 differentiering kan uppnås genom en oren CD4 + CD25-populationen, men för de mest effektiva och tillförlitliga resultat, är en CD4 + CD25-befolkning på minst 80% renhetsgrad önskas. Vår metod utnyttjar protokollet från Miltenyi Biotec för deras autoMACS Pro Cell Separator. Den autoMACS CD4 + CD25 + regulatoriska T Cell Isolation Kit, är mus används för negativt urval av CD4 + CD25-cellpopulationen. Negativt urval möjliggör användning av naiva celler som inte har eventuellt ändrats av interaktioner antikroppar.
Med hjälp av vissa cellytmarkörer i flödescytometrisk analys kan bekräfta renheten av apBefolknings. De rekommenderade ytmarkörer är CD4, CD8 och CD25 som de lätt kan identifiera den önskade CD4 + CD25-populationen. B220 och CD11b kan användas för att testa för B-cell och förorening makrofager, respektive. Prover konsekvent utspädd till 1 x 10 6 celler / ml rekommenderas också eftersom vi har funnit att denna koncentration ger optimal differentiering. I det förflutna har vi funnit att cellkoncentrationer som var för hög eller för låg ofta hade störd cellulär expansion och snedvridna resultat (t.ex. skev IL-17A produktion).
Det är också viktigt att komma ihåg att hålla proverna på is hela tiden när den inte används. Cellernas livsduglighet är en viktig faktor för att uppnå positiv Th17 differentiering. Detta kan bekräftas genom cellräkning med hjälp av trypanblått utspädningar. Eftersom detta protokoll använder manuell vävnad homogenisering genom malning lymfkörtlar och mjälte med frostade objektglas, kan detta vara en tidskrävande metod. En konstruktion modification är att utnyttja automatiska vävnads dissociators som ett alternativ.
I händelse av att den önskade Th17 differentiering inte uppnås, finns det flera problem med fotograferingstips som bör beaktas. Först kontroller måste också övervägas noga så att den verkliga omfattningen av Th17 differentiering kan mätas korrekt. Vi bestämmer typiskt omfattningen av Th17 differentiering genom jämförelse av dessa resultat till de CD4 +-T-lymfocyter som fick enbart anti-CD3 och anti-CD28-stimulering. Kom också ihåg att CD4 + T-lymfocyter måste vara aktiverat för att särskilja. Man bör också visuellt inspektera odlade celler under mikroskop för att bekräfta förekomsten av blästrade / aktiverade T-celler. Aktiverade T-celler, tycks visuellt signifikant större än celler som inte har stimulerats. Klonal expansion kan också observeras genom synliga kluster av sprängning celler, vilka har härletts från en enda T-cell-klon. Cellaktivering kan också vara veried hjälp av flödescytometrisk analys med användning av anti-CD4-och anti-CD25-antikroppar för att identifiera de CD4 + CD25 + aktiverade celler 4
Det är också viktigt att nämna att detta protokoll har optimerats för användning med C57BL / 6 möss, men publicerade data visar att Th17 differentiering kan uppnås i andra musstammar däribland NOD-och BALB / c möss 5, 11, 20. Det bör noteras att Th17 differentiering, inklusive totala frekvensen och absoluta antalet CD4 + T-lymfocyter som genomgår differentiering, är beroende av genetiska faktorer (t.ex. musstam) 20, och miljöfaktorer (t.ex. koloni plats) 5, och kan kräva optimering.
Denna Th17 differentiering protokoll kan fungera som ett värdefullt instrument för att ytterligare svara på frågor angående funktionen av celler i Th17 delmängd. Vår metod för Th17 differentiering har flera betydande fördelar. Såsom tidigare nämnts användningenav minst 80% ren CD4 + CD25-cellpopulation ger en mer enhetlig och effektiv differentiering resultat. Ease of isolering genom användning av autoMACS Pro cellseparator är ytterligare en fördel. Vidare användning av de optimala cytokin-och aktiveringssignaler ger T-cellerna med lämplig miljö att differentiera. Framtida konsekvenser för detta protokoll inkluderar att bestämma de mekaniska medel som Th17 celler och produktion av IL-17A är involverade i uppkomsten och utvecklingen av autoimmunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga upplysningar för att förklara.
Acknowledgments
Detta arbete stöds delvis av NIH / NCATS Kliniska och Translational Science Awards till University of Florida TL1 TR000066 och UL1 TR000064, en mångfald tillägg från Parent Grant R01AI056152 från National Institute of Health, en BD Biosciences reagens bidrag och universitetet i Florida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Sterile Polyestrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | 60 mm x 15 mm |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Premium Microscope Slides, Frosted | Fisher Scientific | 12-544-3 | 3" x 1"1 mm |
| 5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle | BD Biosciences | 309632 | |
| Corning 15 ml Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| Nylon 40 microns | Miami Aquaculture | Nylon 40/26 | |
| Microtest tissue culture plate 96 well U bottom | BD Biosciences | 35-3077 | |
| Corning Costar 24 well cell culture plates | Sigma-Aldrich | CL3524 | |
| Eppendorf Tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e | BD Biosciences | 553057 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | |
| Mouse IL-6 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFbeta | R&D Systems | 240-B-002 | |
| Trypan blue solution 0.4 % | Sigma-Aldrich | 66H2364 | |
| Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 558107 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553035 | |
| PE Conjugated Anti-mouse CD25 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 | BD Biosciences | 560820 | |
| Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) | |
| MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | Corning, Cellgro | 10-040-CM | |
| B 2-Mercapt–thanol | MP Biomedical | 194834 | Hazardous |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | |||
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | Hazardous |
| Brefeldin A (BFA) | MP Biomedicals | 159027 | |
| ELISA IL-17A Capture mAb | BD Biosciences | 555068 | |
| ELISA IL-17A Detection mAb | BD Biosciences | 555067 | |
| ELISA IL-17A Standard | eBioscience | 14-8171-80 | |
| IL-2 ELISA Kit | BD Biosciences | 555148 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Biosciences | 555214 | |
| Equipment | |||
| autoMACS Pro Cell Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge | ThermoScientific | ||
| Napco series 8000 WJ CO2 Incubator | ThermoScientific | ||
| PTC-200 Peltier Thermal Cycler | Biorad | ||
References
- Chen, Z., Lin, F., et al. Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17. International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).
- Cua, D. J., Sherlock, J., et al. Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain. Nature. 421, 742-748 (2003).
- El-Behi, M., Rostami, A., et al. Current views on the roles of Th17 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalitis. J. Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
- Inaba, K., Kroide, S., et al. Properties of memory T lymphocytes isolated from the mixed leukocyte reaction. Proc Natl Acad Sci. 82, 7686-7690 (1985).
- L, I. vanovF. rutosR., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 16, 337-349 (2008).
- Jager, L. D., Dabelic, R., et al. The Kinase Inhibitory Region of SOCS-1 is Sufficient to Inhibit T helper-17 Function in Experimental Allergic Encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 232, 08-18 (2011).
- Kimura, A., Kishimoto, T.
- Korn, T., Bettelli, E., et al.
- Kriegel, M. A., Seflk, E., et al. Naturally transmitted segmented filamentous bacteria segregate with diabetes protection in nonobese diabetic mice. PNAS. 108, 11548-11553 (2011).
- Langrish, C. L., Chen, Y., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J. Exp. Med. 201, 233-240 (2005).
- Lau, K., Benitez, P., et al. Inhibition of type 1 diabetes by a Lactobacillus johnsonii mediated Th17 bias. J. Immunol. 186, 3538-3546 (2011).
- Lee, Y., Awasthi, A., et al. Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells. Nat Immunol. 13, 991-999 (2012).
- Litmann, D. R., Rudensky, A. Y. Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation. Cell. 140, 845-858 (2010).
- O'Connor, W. Jr, Kamanaka, M., et al. A protective function for interleukin 17A in T cell-mediated intestinal inflammation. Nat Immunol. 10, 603-609 (2009).
- Picca, C. C., Larkin, J., et al. Role of TCR specificity in CD4+CD25+ regulatory T cell selection. Immunol Rev. 212, 74-85 (2006).
- Shah, K., Lee, W. W., et al. Disregulated balance of Th17 and Th1 cells in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research & Therapy. 12, R53 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R.
- Stockringer, B., Veldhoen, M. Differentiation and function of Th17 T cells. Current Opinion in Immunology. 19, 281-286 (2007).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., et al. TGFβ in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24, 179-189 (2006).
- Zou, Y., Zhang, H., et al. Strain-dependent production of interleukin-17/interferon-γ and matrix remodeling-associated genes in experimental Candida albicans keratitis. Mol Vis. 18, 1215-1225 (2012).
