Summary
Измерения биомаркеров в сложных биологических образцов все больше руководящих принятия клинических решений. Мы описываем высокочувствительным методом для одновременного измерения сердечного миозин-связывающего белка С, креатин киназы MB и сердечного тропонина I в образцах сыворотки пациентов с инфарктом миокарда и группой контроля.
Abstract
Биомаркеров становится все более важным в принятии клинических решений, а также фундаментальной науки. Диагностика инфаркта миокарда (ИМ) во многом основывается на выявлении сердечно-специфических белков в пациентов сыворотки или плазмы в качестве индикатора повреждения миокарда. Недавно показано, что сердечный миозин-связывающего белка-С (cMyBP-C) можно обнаружить в сыворотке крови после ИМ, мы предложили его в качестве потенциальных биомаркеров ИМ. Биологические маркеры обычно обнаруживаются традиционными сэндвич иммуноферментного анализа. Однако этот метод требует большого объема пробы, имеет небольшой динамический диапазон, и может измерять только один белок одновременно.
Здесь мы показываем, мультиплексе иммунотестом, в котором три сердечных белки могут быть измерены одновременно с высокой чувствительностью. Измерение cMyBP-C в Uniplex или вместе с креатина киназы MB и сердечного тропонина я показал чувствительность сопоставима. Эта техника использует мезо Масштаб Discovery(MSD) способ мультиплексирования в 96-луночный планшет в сочетании с электрохемилюминесценция для обнаружения. В то время как лишь небольшие объемы образцов требуются высокая чувствительность и широкий динамический диапазон будут достигнуты. Используя эту технику, мы измерили cMyBP-C, креатин киназы MB и сердечного тропонина I в сыворотке крови образцы из 16 пациентов с ИМ и сравнили результаты с 16 субъектами управления. Мы смогли обнаружить все три маркера в этих образцах и нашел всех трех биомаркеров быть увеличена после ИМ. Этот способ, следовательно, подходит для чувствительного обнаружения сердечных биомаркеров в образцах сыворотки.
Introduction
Измерение небольших количеств белка в сложных биологических образцов, таких как сыворотка, приобретает все большее клиническое значение для лечения пациента, а также основные науки. Например, увеличение сывороточных уровней сердечных биомаркеров, таких как тропонин I, в клинических условиях согласуется с острым инфарктом миокарда (ИМ) 1. Для обнаружения белков в образцах сыворотки, стандартный твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) является наиболее часто используемым способом, как это имеет высокую чувствительность и позволяет абсолютного количественного определения анализируемого вещества. Однако традиционные ELISA, требуют относительно большого количества образца (как правило, 100 мкл), имеют высокую фонового сигнала в некоторых биологических жидкостей, а ограничиваются измерением только одного аналита в ELISA-2.
В последнее время новый метод иммуноанализа была введена в обход многие из этих недостатков. Этот модифицированный анализа, разработанного MSD, использует electrochemiluminescENCE (ECL) для обнаружения сигнала, которая позволяет очень низкий фон и повышенная чувствительность, что позволяет использовать небольшие объемы образца. Электрохемилюминесценция основан на молекуле-репортеру рутений (II) trisbipyridal, которая крепится на обнаружение антител. Это репортерной молекулой излучает свет при 620 нм на электрической стимуляцией в нижней части 96-луночный планшет который имеет углеродные электроды интегрированы в них 3. Кроме того, при использовании точечного покрытия, несколько антител захвата могут быть покрыты в одну лунку (до 10 на 96-луночном планшете), что обеспечивает одновременное определение количества различных белков в одном образце 4. Этот метод был недавно использован для измерения профилей провоспалительных цитокинов в сыворотке 5,6. Мультиплекс плиты из MSD выгодно отличаются от других платформ множественного аналитического 7.
Использование MSD в качестве основной платформы анализа, мы также разработали на заказ 3-комплекса, что с пластинойодновременного количественного определения уровня сердечного миозин-связывающего белка-C (cMyBP-C), креатин-киназы MB (CK-MB), и сердечный тропонин I (cTnI), и результаты сравнивали с monoplex обнаружения cMyBP-C. CK-MB и cTnI хорошо отлаженных биомаркеров для ИМ. Однако увеличение этих маркеров может быть вызвано патологий, кроме М.И., например, миокардит или почечной недостаточностью 8. Это свидетельствует о добавлении дополнительных биомаркеров для увеличения специфичности диагностики инфаркта миокарда. Недавно мы показали, что cMyBP-C также является потенциальным биомаркеров для MI 9. cMyBP-C представляет собой толстую нить ассоциированный белок, который экспрессируется в сердце, 10-12, но не в скелетной или гладкой мускулатуры. Таким образом, повышение уровня cMyBP-C в системе кровообращения является специфическим показателем повреждения сердца 13.
В этом исследовании сравнивали Uniplex обнаружения cMyBP-C с использованием пользовательского 3-комплекса анализе на определение сывороточных уровнейcMyBP-C, CK-MB, и cTnI в сыворотке крови больных с ОИМ. В будущем эта подпись техники может быть использован для диагностики инфаркта миокарда у пациентов с болями в груди в отделении неотложной помощи.
Учреждение обзор платы (IRB) из Университета Лойолы Чикаго одобрил исследования для использования deidentified человека образцы и использование иммуноферментного анализа (LU # 20392).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Uniplex cMyBP-C анализа
- За день до эксперимента, пальто 96-луночных стандартных MSD голой пластины с захватом антител. Для cMyBP-C, используя 30 мкл мышиных моноклональных анти-cMyBP-C антитела (желатина) в концентрации 5 мкг / мл разведенного в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS).
- Поскольку хорошо является гидрофобным, пипетки раствор в нижнем углу скважины; нажмите сторон пластины для распространения раствору в течение всей скважины.
- Планшет накрывают пластиной герметика и инкубировали O / N при 4 ° С без встряхивания.
- Снимите решение захвата антител, нажав на решение над раковиной, а затем на стопку бумажных полотенцах. Неспецифическое связывание к пластине блокировали добавлением 150 мкл 5% (вес / объем) блокатор (высокого класса BSA) раствора в PBS в каждую лунку.
- Закройте пластины и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре при встряхивании при 700 оборотах в минуту.
- Во время стадии блокирования подготовки стандартов и ейпримерам. Сделать стандартной серии разбавлением рекомбинантный cMyBP-C фрагмент белка (аминокислоты 1 - 271) до начальной концентрации 2000 нг / мл в 1% (вес / объем) блокатор / PBS. Затем последовательно разбавленной с коэффициентом 5 в 1% (вес / объем) блокатор / PBS. Всего 7 стандартами + 1 пустой (1% (масса / объем) блокатор / ЗФР), были использованы.
- Удалить блокирующий раствор и промыть пластины 3 раза по 150 мкл 0,05% (объем / объем) Tween-20/PBS. Каждый раз, удалите промывочного раствора опрокидыванием планшета над раковиной. После третьей стадии промывки, активно Флик планшет на раковине и погладить пластины энергично на слой бумажных полотенец, пока она полностью не высохнет. Это очень важный шаг, так как инкубационный объемы небольшие, и любые оставшиеся промывочного раствора значительно разбавить следующий инкубации.
- Внесите 25 мкл стандартов и образцов в лунки. Закройте пластины и инкубировать при комнатной температуре, при встряхивании при 700 оборотах в минуту в течение 1 часа.
- Подготовьте раствор обнаружение антител в концентрации 1 мкг / мл в 1%-блокатор / PBS. Cuльзовательская сделаны cMyBP-C антитела (эпитоп аминокислот 2 - 14) с MSD сульфо-TAG маркировки служит в качестве детектирующего антитела. Наборы доступны для сульфо-TAG маркировки, что делает его относительно простая процедура для обозначения любых антител.
- Повторите стадии промывки, как описано в пункте 1.4.
- Добавить 25 мкл детектирующего антитела раствора в каждую лунку, печать пластины, и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа в планшетном шейкере установлен на 700 оборотов в минуту.
- Во время инкубационного периода, запустите демо-MSD-пластины (пластина со светодиодами), чтобы обеспечить правильное функционирование Imager сектора и программного обеспечения (см. раздел реагента). Кроме того, разбавить чтения буфера, который обеспечивается MSD, путем добавления 5 мл 4x чтения буфера в 15 мл дистиллированной воды.
- Повторите стадии промывки, как описано в пункте 1.4.
- Добавить 150 мкл чтения буфера в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки. Будьте уверены, чтобы избежать воздушных пузырей (обратный пипетирование подходящий метод). После добавления чтения буфера, сразу сканирование пластины в сектореImager.
2. 3 комплексные cMyBP-C, CK-MB, и cTnI анализа
- 96-луночные 3-комплекса пластины и разбавитель решения уравновешивали до комнатной температуры перед использованием. Этот планшет предварительно покрытый с захватом антител для cMyBP-С, СК-МВ и cTnI на MSD.
- Добавить 25 мкл 1% (вес / объем) блокатор / PBS в каждую лунку. Нажмите на сторонах пластины, чтобы убедиться, что весь хорошо покрыта раствора.
- Печать пластины с заклеивания планшетов, поместите пластину на шейкере, и встряхните при 700 оборотах в минуту в течение 30 мин.
- В то же время серии разведений отдельных калибраторов готова. Поскольку каждую лунку имеет три антитела захвата трех калибраторов должны быть смешаны и серийно разводили перед использованием. Развести рекомбинантный cMyBP-С, СК-МВ (MSD) и cTnI (MSD), а также в 1% (вес / объем) блокатор / PBS, чтобы создать один образец с 2000 нг / мл cMyBP-C, 100 нг / мл CK- MB и 25 нг / мл cTnI (образец А).
- Конечный объем по меньшей мере 100 мкл подготовлена для каждого стандарта. Длязавершить стандартной серии, серийно разбавленных образцов с коэффициентом 5. Использование 25 мкл образца в 100 мкл 1% (вес / объем) блокатор / PBS создать образец B. Затем с помощью 25 мкл образца B в 100 мкл 1% (вес / объем) блокатор / PBS создать образец C и так далее. Пробах сыворотки крови человека от 16 пациентов с ИМ и 16 субъектов управления были использованы для измерения cMyBP-C, CK-MB, и cTnI уровнях. Эти образцы разбавляли 2x в 1% (вес / объем) блокатор / PBS.
- Добавить 25 мкл стандартов и разбавленных проб в 25 мкл уже присутствует в лунки 3-комплекса пластины. Важно также включать заготовки (только разбавитель). Чтобы установить технику, образцы загружаются в технических трижды. В противном случае, дубликаты являются достаточными.
- Печать пластины снова (для заклеивания планшетов могут быть повторно использованы) и инкубировать на шейкере (700 оборотов в минуту) при комнатной температуре в течение 2 часов.
- Непосредственно перед инкубацией закончена, раствор обнаружение антител подготовлены. Разбавителя, используемого на 1% (вес / объем) блокатор в PBS. Все Чете сульфо-меченого антитела обнаружения разводят вместе в конечной концентрации 1 мкг / мл каждый. Обнаружение антител, как правило, предоставляется на 50x концентрации акций.
- Для полного 96-луночном планшете, 2700 мкл общего разбавленного раствора необходимо (с пипеткой ошибки включены). Добавить 54 мкл каждого обнаружение антител к 2538 мкл 1% (вес / объем) блокатор / PBS.
- Через 2 часа, удалите Решения по энергично стряхивая пластины выше раковины. Промыть 3 раза скважин с 150 мкл 0,05% Tween-20 в PBS. Добавить 25 мкл обнаружение решение антител в каждую лунку помощью многоканальной пипетки и сторонах пластины использован для того, чтобы весь хорошо покрыта раствора.
- Закройте пластины и инкубировать в течение 1 часа при встряхивании при 700 оборотах в минуту.
- Во время инкубационного периода, запустите демо-MSD-пластины (пластина со светодиодами), чтобы обеспечить правильное функционирование Imager сектора и программного обеспечения. Также разбавить чтения буфера, который обеспечивается MSD, путем добавления 5 мл 4x чтениябуфер на 15 мл дистиллированной воды.
- Повторите мыть шаг описан в шаге 2.8.
- Добавить 150 мкл чтения буфера в каждую лунку помощью многоканальной пипетки. Избегайте появления пузырьков является критическим (обратный пипетирование подходящий метод). После добавления чтения буфера, сразу сканирование пластины в секторе Imager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Основные принципы и процесс 3-комплекса анализа показаны на рисунке 1, а общий процесс описан в таблице 1. Uniplex анализов работать по тому же принципу, за исключением того, что все дно скважины покрыты одним иммобилизованным антителом. Обнаружение сигнала осуществляется ECL, в котором электрический сигнал подается на дне колодца. Это, в свою очередь, инициирует локальный производства легких посредством химической реакции для чтения буфер с сульфо-TAG этикетки на обнаружение антител. Это приводит к низкой фон и высокую чувствительность анализа. На рисунке 2, стандартной кривой cMyBP-C в анализе Uniplex в сравнении с cMyBP-С 3-комплекса анализа. Оба анализа показывают очень высокую чувствительность и динамический диапазон. Определение уровней и уровней квантификации, показаны в таблице 2 и сравнимы в обеих Uniplex и 3 комплексных анализов. Обнаружение уровней для cTnI и CK-MB являются ALSо показано на рисунке 3 и в таблице 2. Inter-оператор изменчивость определяли путем измерения идентичных образцов (п = 2, 3 технических повторяет) двумя разными операторами и изменчивости было установлено, что низкое (CV 8,5%). Перекрестная реактивность обнаружения антител с двумя другими калибраторов исследовали путем инкубации отдельные стандартные кривые всех трех калибраторов с одной обнаружение антител (фиг. 4). Только низкое количество перекрестной реактивности было замечено между CK-MB калибратора и оба cTnI и cMyBP-C обнаружения антител в то время как нет перекрестной реактивности не наблюдалось между другими калибраторы и обнаружения антител.
В качестве доказательства применимости анализа для обнаружения сердечной травмы, сывороточные уровни 16 пациентов с ИМ по сравнению с контрольной группой (п = 16). Используя 3-комплекса пластины, сывороточные уровни cMyBP-С, СК-МВ и cTnI были определены. Все три биомаркеров были увеличены в субъектах MI (см.Рисунок 5) с 3,7 раза (cMyBP-C) до 12,2 раз (CK-MB), хотя изменения в сыворотке крови был самым низким в cMyBP-C группы.
| Процесс | Uniplex анализа | 3-анализа сложных | |
| Эксперимент день 0 | Пальто пластины с захватом антител | Всю ночь | N / A |
| Эксперимент 1 день | Блок пластины | 1 час | 30 мин |
| Подготовка образцов и стандартных серий | |||
| Инкубируйте образцы и стандарты | 1 час | 2 часа | |
| Выдержите с обнаружением антител | 1 час | 1 час | |
| Добавить обнаружения реагентов и читатьплита |
Таблица 1. Workflow обзор Uniplex и мультиплекс анализов.
| LLOD (нг / мл) | LLOQ (нг / мл) | Улак (нг / мл) | |
| cMyBP-C (Uniplex) | 0,126 ± 0,007 | 0,567 ± 0,073 | 400 нг / мл |
| cMyBP-C (3plex) | 0,057 ± 0,022 | 0,469 ± 0,171 | 400 нг / мл |
| CK-MB (3-комплексными) | 0,038 ± 0,014 | 0,587 ± 0,213 | 100 нг / мл |
| cTnI (3plex) | 0,033 ± 0,011 | 0,147 ± 0,053 | 25 нг / мл |
Таблица 2. Пределы обнаружения Uniplex и 3 комплексных калибраторы. LLOD, нижний предел обнаружения определяется как расчетная концентрация сигнала заготовки + 3 раза стандартное отклонение заготовки образцов. LLOQ, нижний предел количественного определения, определяется как значение, превышающее LLOD, с коэффициентом дисперсии (обратное отношение сигнал-шум) ниже, чем 20%, а восстановление в пределах 80 - 120%. Улак, верхний предел количественного определения, определяется как самый высокий проанализированы концентрации, которая может быть измерена с коэффициент вариации менее 20% и восстановление в пределах 80 - 120%.
Рисунок 1. Схематический обзор пластины и рабочий процесс.) 96-луночный планшет показан. Каждая лунка покрыта трех различных антител захвата, то есть против cMyBP-C, CK-MB и cTnI. Четвертый безрезультатнов состоянии пятно не используется, и покрыта БСА. B) рабочего процесса 3-комплекса ELISA. Предварительно покрытой пластине (шаг 1) блокируется, и затем образцы сыворотки или калибраторов добавляют в каждую лунку и оставляли для связывания (стадия 2). cMyBP-C (красные ромбы), CK-MB (зеленый прямоугольник) и cTnI (оранжевый овал) связываются с их соответствующих антител захвата. После отмывания несвязанных белков, сульфо-TAG-меченных антител обнаружения добавляются (этап 3). Они связываются с cMyBP-C, CK-MB или cTnI белки, которые связаны с их захват антитела. После отмывания несвязанного антитела обнаружения для чтения добавляют буфер и планшет проанализированы. Электрический сигнал в нижней части пластины инициирует локальный химической реакции сульфо-TAG с буфере чтения, что приводит к производству света (этап 4). Количество света, прямо пропорционально количеству сульфо-TAG меченых обнаружения антитела, связанного. ПЗС-датчик повторношнуры света и может различать разные места в каждую лунку и, следовательно, сигнал, поступающий от каждого анализируемого вещества (стадия 5).
Рисунок 2. Стандартной кривой cMyBP-C калибратор измеряется в Uniplex или в 3-комплекса. Же стандартная серия была измерена в анализе Uniplex, а на 3-комплекса пластины. Стандартная серия началась в 2000 нг / мл и разводили серийно 5x с наименьшей концентрацией бытия 0,128 нг / мл. Кроме того, разбавитель используетс в качестве пустого образца. Область обнаружения этого анализа отображаются в сером цвете. Нижняя линия показывает нижний предел обнаружения (LLOD), который определяется как расчетная концентрация заготовки сигнал + 3 раза стандартное отклонение заготовки значений. Верхний предел обнаружения определяется как тон высокую концентрацию стандартной серии, который может быть надежно измерено. Оба Uniplex и 3 комплексных cMyBP-C стандартные кривые являются сопоставимыми. Пределы обнаружения отображаются в таблице 2. Au: условные единицы.
Рисунок 3. Стандартные кривые CK-MB и cTnI. Стандартные кривые CK-MB и cTnI, которые были измерены одновременно с cMyBP-C на 3 комплексных пластины. Оба калибратора показывают высокую чувствительность и широкий динамический диапазон. В серый зоны обнаружения анализа на дисплее. Нижняя линия показывает нижний предел обнаружения (LLOD), который определяется как расчетная концентрация заготовки сигнал + 3 раза стандартное отклонение заготовки значений. Верхний предел обнаружения определяется как высокая концентрация стандартного себе Райса, которая может быть надежно измерено. Пределы обнаружения отображаются в таблице 2. Au: условные единицы.
Рисунок 4. Кросс-реактивность 3-комплекса антитела обнаружения. Отдельные стандартные кривые cMyBP-C, CK-MB, и cTnI были подготовлены и инкубировали на 3 комплексных пластины. Каждый стандартной кривой было чем зондировали отдельные антитела обнаружения, для оценки количества перекрестной реактивности между отдельными обнаружение антител (например, cMyBP-C), а другой калибратор (например, креатинкиназы в миокарде и cTnI). Перекрестная реактивность была низкой в 3-комплекса анализа. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 5 "FO: Content-ширина =" 3 дюйма "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50786/50786fig5highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50786/50786fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Биомаркеров в сыворотке крови ИМ и управления, измеренные с 3-комплекса анализа. Уровни cMyBP-C, CK-MB, и cTnI были измерены одновременно на 3-комплекса анализа в образцах сыворотки из 16 контрольной группы и 16 пациентов с ИМ. Данные отображаются на коробке с усами (усы представляют 10-й и 90-й процентиль). Повышенные уровни всех трех биомаркеров были обнаружены в сыворотках пациентов с ИМ по сравнению с контрольной группой. Поскольку данные не показывают нормальное распределение (проходят проверку Д'Агостино Пирсон Omnibus), непараметрического Манна-Уитни статистический тест был использован для проверки различий между контролем и MI групп. # Р <0,001
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы покажем применимость мультиплекса иммуноанализа для обнаружения нескольких сердечных биомаркеров в сыворотке крови у пациентов. Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными ELISA. Во-первых, в ECL набора для анализа используют вместо колориметрического обнаружения. В ECL, электрический сигнал стимулирует местное производство измеряемого свойства (свет), таким образом, разобщение стимуляции событие из сигнала, который уменьшает фоновый 14. Это позволяет обеспечить высокую чувствительность, как можно видеть в таблице 2.
Мультиплексирование анализ не приводит к потере чувствительности для обнаружения cMyBP-C, как можно видеть на фиг.2 и в таблице 2. cMyBP-C измеряется в Uniplex показал чувствительность и дальность обнаружения сопоставимы с cMyBP-C измерены одновременно с CK-MB и cTnI 13. Одновременные измерения существенно сократить объем образца, необходимый для ИЗМЕРЕНИЕTS, которые могут быть важным фактором при работе с редких биологических образцов, а также сократить время запуска нескольких анализов Uniplex.
Как и в любом иммунологический анализ, анализ в значительной степени зависит от качества антител, используемых. Сродство, специфичность и авидность захвата и обнаружение антител является основным фактором, определяющим чувствительность анализа 15. Различных пар антител должны предстать перед судом, чтобы увидеть, какая комбинация захвата и обнаружения антител дает самую высокую чувствительность и динамический диапазон. При использовании технологии мультиплексирования, захват антитела должны быть местом покрытием на скважине. Это означает, что малый объем, очень концентрированный раствор наносили на части скважины (см. рисунок 1), в отличие от покрывающего раствора, используемого при анализе Uniplex или в обычных ELISA. Это должно быть оценено, если захват антител работает так же, с места покрытия, как это делает с решением покрытия. Кросс-реактивностьантител или калибратор с другого антитела пара может также привести к ложно-положительных результатов 2,15.
Для этого исследования, выполненного на заказ мультиплекса пластина была разработана в сотрудничестве с MSD. Хотя ряд предварительно покрытых пластин мультиплекс, являются коммерчески доступными, эта конкретная инновация требует оптимизации анализа, поскольку новые (cMyBP-C) мишени мультиплексированных с заранее оптимизирована Каталог анализы (CK-MB и cTnI). Таким образом, очевидным недостатком этого способа является дополнительным требованием для специализированных планшет-ридере и планшеты, содержащие электроды для обнаружения ECL сигнала. Хотя и работает одном мультиплексе анализа в сравнении с многими анализов Uniplex снизит общие затраты, планшет-ридер должна быть первоначально приобрел 2.
Используя 3-комплекса иммуноанализа уровни биомаркеров выпуск cMyBP-С, СК-МВ и cTnI было измерено у пациентов с ИМ и по сравнению с контрольной группой. Раз изменение больше, чем в гоэлектронной контрольной группы отличались между тремя биомаркеров (см. рисунок 4), равно как и изменение в группе ИМ. Изменение уровней биомаркеров, как ожидается, в коллекции больных ИМ, а сроки забора крови, инфаркта, а также целый ряд других факторов, которые могут способствовать освобождению сердечного белка и его последующей деградации в обращении. Ли уровне отдельных маркеров коррелирует с клиническим параметрам, таким как размер инфаркта, требует дальнейшего исследования.
Переводя эти результаты непосредственно для использования в отделение неотложной помощи для обнаружения MI требуется целый ряд проблем, которые необходимо преодолеть. Главным среди них является время протокола, необходимое для производства результатов, которые даже с предварительным покрытием пластин занимает 3 ½ часа. Как и в случае тропонина анализов, используемых сегодня, анализ должен быть оптимизирован для быстрого обнаружения, что позволяет экспресс-диагностики.
В заключение, мы разработали подпись анализом, в котором двое знаетен сердечных биомаркеров и один потенциальный сердечных биомаркеров, cMyBP-C, были продемонстрированы одновременно обнаружить наличие повреждений миокарда у больных ИМ количественным сердечной титры сывороточных белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Полная патентная заявка находится на рассмотрении (заявка № 13/464, 466, Паб США № 2012/0282618 A1 и дата:. 05/04/12), чтобы определить факторы риска, связанные с cMyBP-C разложению и выделению жидкости в человеческие тела и количественного определения уровня cMyBP-C в человеческом теле жидкости.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось Национальным институтом здоровья и гранты R01HL105826 K02HL114749 (Dr. Sadayappan) и Американской Ассоциации Сердца Запада стипендий; 11PRE7240022 (г-н Barefield) и 13POST14720024 (Dr. Говиндана). Авторы выражают признательность за помощь доктор Джимми Пейдж, Джилл Clampit и д-р Джон Хадсон, MSD, за их отличную техническую поддержку и литературы в развитии анализа.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant | Meso Scale Discovery | R92TC-2 | |
| Tween-20 | Acros | 9005-64-5 | |
| MSD Blocker A | Meso Scale Discovery | R93BA-1 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher BioReagents | BP399-4 | Filter before use |
| Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free | Santa Cruz | SC-137180L | For coating, antibody has to be gelatin free |
| Plates and Equipment | |||
| Multi-Array 96-well standard plate | Meso Scale Discovery | L15XA-3 | |
| A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB | Meso Scale Discovery | N452A-1 | |
| ThermaSeal Sealing Film | Life Science Products Inc. | ST-3098 | |
| MSD SECTOR Imager 2400A | Meso Scale Discovery | ||
| MTS 2/4 digital microtiter shaker | IKA | 3208001 | |
References
- Thygesen, K., et al. Third universal definition of myocardial infarction. Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).
- Leng, S. X., et al. ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).
- Thompson, I., et al. Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains. Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).
- Kingsmore, S. F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays. Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).
- Altan, Z. M., et al. A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis. J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).
- Patel, K. D., et al. High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction. Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).
- Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. Comparison of multiplex immunoassay platforms. Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).
- Mahajan, V. S., Jarolim, P. How to interpret elevated cardiac troponin levels. Circulation. 124, 2350-2354 (2011).
- Govindan, S., et al. Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).
- Barefield, D., Sadayappan, S. Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease. J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).
- Kuster, D. W., et al. Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease. J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).
- Sadayappan, S., de Tombe, P. P. Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function. Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).
- Sadayappan, S. Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury. Biomark Med. 6, 69-72 (2012).
- Fichorova, R. N., et al. Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study. Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).
- Malekzadeh, A., et al. Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases. Methods. 56, 508-513 (2012).
