Summary
En protokoll for å isolere, kultur, og bilde holme celle klynger (ICCS) avledet fra humane føtale bukspyttkjertelen celler er beskrevet. Metoden detaljer de nødvendige skritt for å generere ICC-verdiene fra vev, kultur som monolayers eller i suspensjon som tilslag, og bildet for markører for spredning og bukspyttkjertelen celle skjebne beslutninger.
Abstract
I nesten 30 år har forskere vist at menneskelige foster ICC-verdiene transplantert under nyre kapsel av nakne mus modnet til fungerende endokrine celler, noe som gjenspeiles av en betydelig økning i sirkulerende menneskelig C-peptid følgende glukose stimulering 1-9. Men in vitro, er tilblivelsen av insulinproduserende celler menneskelige foster ICC-verdiene fra lav 10; resultater som minner om siste eksperimenter utført med humane embryonale stamceller (hESC), en fornybar kilde til celler som holder store løftet som en potensiell terapeutisk behandling for type 1 diabetes. Som ICC-verdiene, transplantasjon av delvis differensiert hESC generere glukose responsive, insulinproduserende celler, men in vitro tilblivelsen av insulinproduserende celler fra hESC er mye mindre robust 11-17. En fullstendig forståelse av de faktorer som påvirker vekst og differensiering av endokrine forløper celler vil trolig kreve data generert fra både ICC-verdiene, og hanSC. Mens en rekke protokoller finnes for å generere insulinproduserende celler fra hESC in vitro 11-22, langt færre eksistere for ICC-verdiene 10,23,24. En del av denne uoverensstemmelsen sannsynlig kommer fra vanskeligheten med å jobbe menneskelige foster bukspyttkjertelen med. Mot dette målet, har vi fortsatt å bygge på eksisterende metoder for å isolere føtale holmer fra menneskelige pancreases med svangerskaps aldre fra 12 til 23 uker, dyrke cellene som en monolayer eller i suspensjon, og bildet for celleproliferasjon, pancreatic markører og menneskelige hormoner inkludert glukagon og C-peptid. ICC-verdiene genereres av den protokoll som er beskrevet nedenfor, resulterer i C-peptid-frigjøring etter transplantasjon under nyrekapselen nakne mus som er lik C-peptid-nivåer som oppnås ved transplantasjon av friskt vev 6.. Selv om eksemplene som presenteres her fokusere på den pankreatiske endoderm proliferasjon og β celle genese, kan protokollen som brukes for å studere andre aspekter av pankreas utvikling, Inklusive eksokrin, duktalt og andre hormonproduserende celler.
Introduction
En primær begrensning til celle-baserte insulin erstatning terapi ved type 1 diabetes er det sparsommelige menneskelige holmer som er tilgjengelige for transplantasjon. Evnen til å regulere proliferasjon og differensiering av humane pankreatiske forløper celler inn i insulin-produserende celler som oppfyller de metabolske kravene til en insulin-mangeltilstand forblir en kritisk byggesten for et cellebasert terapi til behandling av type 1 diabetes.
Før advent av hESC avledet insulinproduserende celler, menneskelige foster bukspyttkjertelens endokrine celler eller deres forløpere ble sett på som potensielle kilder til celler for klinisk transplantasjon. Selv om den vitenskapelige og regulatoriske landskapet har endret seg de siste årene, er det fortsatt et stort behov for å forstå hvordan den menneskelige foster bukspyttkjertelen utvikler. Mange nå vise terapeutisk bruk humane føtale celler på som lite sannsynlig, men hvis effektive og sikre metoder for å utvide cellene ble etablert, terapeutisk bruk av disse cellene kunne agAin bli utforsket. Et stort hinder som gjenstår er at in vitro transformasjon av humane føtale bukspyttkjertelen celler tilslag (ICCS) til glukose responsive, er insulin sekresjon endokrine celler i dag en ineffektiv prosess. Selv om mye arbeid over nesten 30 år har belyst og beskrevet de uttrykk profilen til transkripsjonsfaktorer som kreves for utvikling av endokrine bukspyttkjertelen, er det fortsatt hull i vår kunnskap om hvordan tidsbaserte uttrykk av transkripsjonsfaktorer er regulert og knyttet til cellefunksjon.
Før advent av hESC avledet insulinproduserende celler, menneskelige foster bukspyttkjertelens endokrine celler eller deres forløpere ble sett på som potensielle kilder til celler for klinisk transplantasjon. Selv om den vitenskapelige og regulatoriske landskapet har endret seg de siste årene, er det fortsatt et stort behov for å forstå hvordan den menneskelige foster bukspyttkjertelen utvikler. Mange nå vise terapeutisk bruk humane føtale celler på som lite sannsynlig, men hvis effektivog sikre fremgangsmåter for å utvide cellene ble etablert, terapeutisk anvendelse av disse cellene kan igjen bli utforsket. Et stort hinder som gjenstår er at in vitro transformasjon av humane føtale bukspyttkjertelen celler tilslag (ICCS) til glukose responsive, er insulin sekresjon endokrine celler i dag en ineffektiv prosess. Selv om mye arbeid over nesten 30 år har belyst og beskrevet de uttrykk profilen til transkripsjonsfaktorer som kreves for utvikling av endokrine bukspyttkjertelen, er det fortsatt hull i vår kunnskap om hvordan tidsbaserte uttrykk av transkripsjonsfaktorer er regulert og knyttet til cellefunksjon.
Nylig har stamcellefeltet ansatt akkumulert kunnskap om timelig transkripsjonsfaktor uttrykk under holme utvikling for å drive produksjonen av celler som uttrykker markører for modne endokrine celler. Selv om tilblivelsen av insulinproduserende celler fra hESC og induserte pluripotente celler (iPSC) har gjort betydelige ogbetydelige fremskritt i de siste årene, de mest effektive protokoller krever to distinkte differensiering faser: 1) en tidlig in vitro differensiering for å generere celler som uttrykker bukspyttkjertelen forløper transkripsjonsfaktorer, etterfulgt av 2) in vivo modning etter transplantasjon - en såkalt "black box "periode. For å bevege seg fremover, fremskritt i forståelsen av biologien underliggende holme modning in vivo, uavhengig av cellen kilde, må forstås på et biokjemisk nivå. Likheten mellom de resultater som oppnås med ICC-verdiene og hESC antyder at en rekke kritiske biokjemiske prosesser som regulerer overgangen av humane pankreatiske forløper celler til modne, glukose, insulin responsive utsondrende celler in vitro er imidlertid ukjent. En sentral del av denne forståelsen vil være å utvikle nye metoder for å utlede funksjonelle endokrine cellepopulasjoner fra bukspyttkjertelen stamceller og hESC vil kreve ikke bare biokjemisk caoaches som belyser modningen hendelser, men metodene for å analysere endringer.
Hvorfor tror vi at bildebehandling humane føtale bukspyttkjertelen celler er en kritisk del av å fange opp endringer i holme modning? Svaret ligger delvis i den historiske søken etter å skape insulinproduserende celler. Både modell og vev-kultur-systemer for bukspyttkjertelen forløpere og holmer har tillatt forskere å utforske de betydelige forskjellene som eksisterer mellom modning av dyre holmer og menneskelige holmer in vitro. En begrensning til utforskning av menneskelige foster bukspyttkjertelen utvikling er at svangerskaps aldre som lovlig kan brukes bare gi opphav til heterogene celle aggregater. Selv om de isolerte føtale menneskeceller ligner holmer, flekker etter in vitro kultur fra svangerskaps aldre 9-23 uker avslører mindre enn 15% inneholde markører for endokrine celler, med de fleste cellene ikke flekker på holmen hormoner. Men etter transplantasjon og ivivo modning, et stort flertall av celler uttrykker endokrine markører 6,25. Resultatene fra disse studiene blir gjentatt i dag med hESC differensiering protokoller som bare er i stand til å generere beskjedne bestander av enkelt hormon positive endokrine celler etter in vitro differensiering. In vitro metoder for å forbedre bestander av hormon positive celler vil trolig gi innsikt i in vivo holme modning. Å forstå de molekylære hendelser som driver human foster bukspyttkjertelen utvikling vil sannsynligvis forbedre arbeidet med å utlede insulinproduserende celler fra hESC og videre avgrense hvilke mekanismer som regulerer β celle regenerering og bukspyttkjertelen celletransdifferensiering.
Likhetene mellom menneskelig foster bukspyttkjertelen celle og hESC modning kan utvides til celle funksjon. Som murine celler, både humane føtale celler og differensiert hESC er ikke i stand til å frigi insulin som svar på glukoseetter holme neoformation in vitro 26,27. Men ved transplantasjon i nakne mus og modning, både menneskelige holme-liknende samlinger og insulinproduserende celler avledet fra hESC utstillings en endokrin fenotype. Tre måneder etter pode, nesten 90% av de transplanterte cellene fra enten befolkningen er insulin positive, og fungere normalt som bestemmes ved utgivelsen av C-peptid 17,26. Disse resultatene indikerer at transplantasjon gir kontekst og uidentifiserte signaler som fremmer holme modning. Optimalisert bilde protokoller, slik som den er beskrevet her, for menneske føtale bukspyttkjertelen celler vil hjelpe i søket for å identifisere faktorer som modulerer og akselerere modning. Fundamental biokjemiske utforskning av menneskelige foster bukspyttkjertelen celler og hESC differensiert mot en endokrin avstamning på dette stadiet av utviklingen er avgjørende for å måle effektiviteten av modning.
Den følgende protokoll, som er skissert i Figure 1, gir vår nåværende metode for isolering av humane føtale pankreatiske celler, kalt ICC-verdiene fra hel human fetal pancreas og avbildning av disse cellene. Denne protokoll krever en initial tilberedning av celler fra vev, som deretter kan dyrkes som et monolag eller i suspensjon. Utarbeidelse av celler for avbildning av brukte markører av endokrine celleproliferasjon og modning er beskrevet.
Generering og avbildning av ICC-verdiene i fravær eller nærvær av et utvalg av kjemiske modifiserende midler gir en hurtig metode, sammenlignet med transplantasjonsmodeller, for å bidra til å identifisere dyrkningsbetingelser og forbindelser som akselerere modningen av humane føtale pankreatiske celler til fullstendig funksjonell eksokrin, duktalt, eller hormonproduserende pankreatiske celler.
Protocol
Merknader før du får startet:
- Menneskelige foster pankreata ble hentet fra fødselsskader Research Laboratory, University of Washington (Seattle, Washington, USA) som høstes i vevet. Informert samtykke for vev donasjon, lagring og bruk av prøvene ble oppnådd fra givere i midten. Protokollen samtykke uttalelse ble gitt skriftlig og The University of California, San Diego Menneske Forskning Protections Program godkjent hele studie (Protokoll # 081237XT).
- Det er viktig å opprettholde både human fetal bukspyttkjertelen og beholderen holder bukspyttkjertelen på is under hele prosedyren. Denne dissosiasjon og fordøyelse bør utføres så raskt som mulig.
- Send klinikken der den menneskelige foster bukspyttkjertelen ble innhentet fra buffer for lagring og transport av bukspyttkjertelen. (RPMI-1640 + 10% normalt humant serum (NHS), 300 mM trehalose SG, penicillin / streptomycin, og Fungizone).
En. Dissection of Human Fetal Pancreas
- Oppløs 5 mg av RT kollagenase XI i HBSS for å gi en endelig konsentrasjon på 2,5 mg / ml. Filtrer sterilisere løsningen med et 0,22 mikron sprøytefilter i en sterilt (autoklavert) scintillasjonskyvette og oppbevar ved 4 ° C. I en vevskultur panseret, satt ut to sterile petriskåler, en steril liten smeltedigel (hvis en smeltedigel er utilgjengelig, kan et lite begerglass erstattes), sterilisert saks og pinsett. Tilsett 2 ml HBSS til en petriskål for å vaske bukspyttkjertelen. Sug opp væske fra røret som inneholder fosterets bukspyttkjertelen, med avreise ca 1 ml.
- Fjern bukspyttkjertelen med pinsett inn i 60 mm petriskål uten HBSS. For disse forsøkene, er foster ICC-verdiene genereres fra frisk pankreata med gestational alder som spenner 9-23 uker. Isolation from pankreata på tidligere gestionational aldre er vanskelig på grunn av størrelsen av bukspyttkjertelen. Protokollen gjelder sannsynligvis svangerskaps aldre utover 23 uker, men oppkjøpet av pancreata etter dette tidspunktet er vanskelig på grunn av føderale (US) begrensninger. Av og til kommer fosterets bukspyttkjertelen med milten, fett, eller bindevev festet fra den opprinnelige disseksjon. Den ekstra vevet er lett synlig for det blotte øye, og bør fjernes fra bukspyttkjertelen før du starter protokollen.
- Skyll bukspyttkjertelen i et minimalt volum av kald HBSS (~ 0,5 ml) i petriskål.
- Flytt de rensede bukspyttkjertelen til den lille steril smeltedigel bruker steril tang og plasseres i en isbøtte. Plasser digelen i en holder for et 50 ml sentrifugerør og, ved hjelp av to par med saks, kraftig skjære bukspyttkjertelen i flere minutter. (Vanligvis 2-5 minutter, men tiden er avhengig av størrelsen og fasthet av vevet). Skjære teknikk er viktig. Hold den ene side av saksen i en fast stilling i bevegelse bare de motstående håndtak. Spissene på saksen skal hvile på bunnen av digelen. Fortsett med raske saksebevegelse å bryte bukspyttkjertelen i småstykker. De mindre stykker av vevet, jo bedre er collagenase vil fungere.
- Tilsett 1,5 ml HBSS + hakkede opp bukspyttkjertelen til hetteglasset med collagenase og plasser i et vannbad shaker satt til 37 ° C ved 200 rpm for opp til 10 min. Ikke sjekk oftere enn en gang i løpet av den første 5 min. Fordøyelse Tiden er avhengig av vevet kvalitet, kan så lite som 6 minutter være tilstrekkelig. Endepunktet er når partiklene er små og ensartede.
- Fyll ampullen (10-15 ml) med kald HBSS for å stoppe collagenase-aktivitet. Plasser på isen og la klumper til takke med 10 min. Ofte på dette punktet, har noen celledød skjedde og DNA er sluppet inn i media. Dette kan gjøre media 'trevlet'; i dette tilfellet, tilsett 100 ul DNase (10 mg / ml stock) til oppløsningen.
- Etter vevet i scintillasjonskyvette har avgjort for 10 min, aspirer av det øverste laget forlater det litt mindre enn halvfullt (7-8 ml). Overfør cellene til en 15 ml konisk rør, Tilsett 5 ml HBSS. Sentrifuger i 5 minutter ved 300 x g.
- Aspirer HBSS og resuspender cellene i 5 ml media inneholdende RPMI-1640, Glutamax, 10% normalt humant serum (NHS), 10 mM HEPES pH 7,2, penicillin / streptomycin, og Fungizone. Plate på 60 mm petriskål. For forskere som prøver å generere β-celler, legge HGF (10 ng / ml endelig) til media. I tillegg har en rekke grupper demonstrert at supplere kulturen media med inkretinhormon GLP-1 øker også β-celler 28. Cellene skal være igjen i suspensjon for 72 timer for å aggregere og danne ICC-verdiene.
- Etter 72 timer i suspensjon, kan cellene bli belagt på matriksen av den menneskelige cellelinje HTB9 matriks som tidligere beskrevet 29. Uavhengig av vekstbetingelser, bør mediet skiftes hver 48. time.
2. Immunfluorescens av markører for endokrine celleproliferasjon og Modning i ICC-verdiene dyrket i suspensjons, med ett lag, eller på Glassdekk
- For å måle celleproliferasjon, er BrdU merking av enten adherente celler eller celler i suspensjonen utføres i 12 timer før fiksering PFA. BrdU-reagens fortynnet 1:100 og filtersterilisert i RPMI-1640, Glutamax, 10% NHS, 10 mM HEPES pH 7,0, penicillin / streptomycin, og Fungizone.
- For celler i suspensjon: Sentrifuger for 5 min ved 300 xg og aspirer kultur medium. Tilsett 10 ml PBS å vaske ICC-verdiene, sentrifuger i 5 min ved 300 xg og aspirer. Hvis ICC-verdiene skal være innebygd i parafin, vennligst følg tilleggsprotokoll 03.01 til 03.17 For heftende celler:. Fjern kultur medium og vaske cellene med PBS som beskrevet ovenfor. Fix celler for 20 min med 4% PFA på RT, så vask to ganger med PBS. På dette punktet, kan platene være pakket med Parafilm og lagret i PBS ved 4 ° C i opptil 1 uke.
- Inkuber cellene med 0,2% Triton-X-100 i PBS i 10 min ved RT. Vask cellene to ganger med PBS og gjelder Blokkering Buffer (2% gjørnkey serum, 2% bovint serumalbumin, 50 mM glysin fortynnet i PBS) i 1 time. Vask cellene med Working Buffer (Blokkering Buffer fortynnet 1:10). Fortynn antistoffet i arbeids buffer. For celler dyrket på glass-coverslips, fortynnes antistoff i 60 pl totalt volum. For celler i en 6-brønns fatet, fortynnes antistoff i 600 pl totalt volum. Å farge flere epitoper, kan en cocktail av antistoffer påføres. Som en kontroll, bruker IgG-eller pre immun serum i stedet for det spesifikke antistoff. Kontrollprøver må inkubert med kontroll IgG fra den samme art som det primære antistoff som brukes.
- Inkuber det primære antistoff enten 1,5 timer ved romtemperatur, eller O / N ved 4 ° C. Aspirer primære antistoff og vask 3x med Working Buffer på RT.
- Spe den sekundære antistoff på 1:200 for rodaminmolekyler og FITC konjugerte antistoffer, 1:500 - 1:1.000 for Alexa konjugerte antistoffer. Det er viktig å merke seg at alle sekundære antistoffer er lysfølsom. Dekk prøvenei aluminiumsfolie for å hindre tap av signal. Inkuber i 1 time ved RT.
EKSTRA: Å visual kjerner, kan DAPI legges på 1:500 i løpet av videregående inkubasjon. Dette er nyttig for kvantifisering av protein ekspresjon i den totale cellepopulasjon. - Aspirer sekundært antistoff og vask 3x med Working Buffer på RT. For celler dyrket på et dekkglass, forsiktig løft dekkglass med tang, mens midt i buffer; vaske den ved å dyppe i PBS. For celler dyrket i en 6-brønns plate, tilsett PBS for å vaske og aspirat. På dette tidspunkt er de klare til å undersøke i henhold til et invertert mikroskop.
- Trykk på kanten av dekk forsiktig på en Kimwipe å bli kvitt overflødig PBS. Legg en dråpe montering gel på et glass lysbilde og invertere dekkglass på lysbildet. Fjern overflødig montering gel ved aspirasjon. Trykk på dekkglass forsiktig med baksiden av en 200 mL pipette spissen for å fjerne boblene.
- Tørt ved romtemperatur i ca 20 minutter eller O / N ved 4 ° C og undersøke under en fluorescent eller konfokalmikroskop.
Tre. (Valgfritt) Immunofluorescent Farging av Proteiner fra Parafin Embedded ICC-verdiene
- Forbered en 3% agarose løsning og la avkjøles til 55-60 ° C.
- Overfør ICC-verdiene inkubert i suspensjon i et 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 1500 xg i 5 min ved romtemperatur.
- Aspirer media fra cellene og fikse med 500 mL 4% PFA for 10 min ved RT. Ikke bland pellet, med mindre pellets er svært store.
- Vask pelleten to ganger med 750 mL PBS. I likhet med 4% PFA, er dette avfallet som farlig og bør kastes i henhold til institusjonens farlige spesifikasjoner avfall.
- Forsiktig flick cellepelleten å løsne og tilsett 150-200 pl av agarose nedover veggen av 15 ml konisk rør.
- Bland forsiktig ved å sveipe i røret, men ikke danner bobler.
- Tillat å stivne ved 4 ° C i 5-10 min.
- Bruk en 21 G kanyle til å løsnepellet, og plasser i en frisk 15 ml konisk rør.
- Parafin embedding og utarbeidelse av seksjoner på lysbilder kan gjøres på stedet ved hjelp av en mikrotom eller ved kjernemikros fasiliteter.
- Deparaffinize vev, hydrat, og vaske med vann raskt.
- Til 0,2 M glysin i 30 minutter ved RT for å slukke den gjenværende aldehyd.
- Vask lysbildet to ganger med PBS i 2 min hver.
- For antigen gjenfinning, bringe 10 mM Citrate Buffer (pH 6,0) til å koke over kokeplate. Fordyp lysbildene i bufferen, vent til det å komme tilbake til en byll, og vent i 15 min.
- Fjern begeret fra kokeplaten. Vent ca 40 min for lysbildene avkjøles i bufferen.
- Vask objektglassene to ganger med H2O i 5 minutter hver, vaske objektglassene to ganger med PBS i 5 minutter hver, blokk med 2% normal esel serum i PBS i 1 time.
- Inkuber med primært antistoff, fortynnet til riktig konsentrasjon i arbeids buffer inneholdende 0,2% Triton X-100.Generelt er det primære antistoff inkubert over natten om farging for transkripsjonsfaktorer, og i 1,5 timer dersom fargingen for hormoner, markører for proliferasjon og / eller differensiering.
- Følg trinn 2.3 til 2.9 som er beskrevet ovenfor.
Representative Results
Grundige forberedelser av føtale ICC-verdiene er avgjørende for å lykkes i denne protokollen. Representative bilder av hvordan cellene vanligvis ser ved definerte perioder etter plating er vist i figur 2.. Etter rensing vises den ferske belagt celleaggregater som små, spredte store klaser som inneholder få celler (figur 2A). Etter de første 24 timer (figur 2B), er mange av celleklynger blir større, men tallrike små klynger forbli. Etter 48 timer, er klyngene utvidet betraktelig, men forblir asymmetrisk (figur 2C). Ved 72 timer, ICC-verdiene burde være klar, relativt ensartet i størrelse og form (figur 2D). Det er ved dette punktet at cellene kan enten være belagt på matriser, slik som HTB-9, i 24 timer forut for immunfluorescens eller tillates å vokse i en annen 72 timer i fravær eller i nærvær av kjemikalier eller legemidler som kan endre ekspresjonen av gener nødvendig for bukspyttkjertelen endokrine celle generation. Figur 3 høydepunkter en rekke vanlig brukte antistoffer for å vurdere enten ICC spredning eller differensiering mot bukspyttkjertel endoderm. I figur 3A, ble det ICC-verdiene belagt på HTB-9, dyrket i 4 dager, og farget for PDX1, en kritisk markør for pankreatisk utvikling. Selv om in vitro farging av ICC-verdiene utføres rutinemessig i vårt laboratorium, oftere, er menneskelige foster ICC-verdiene transplantert under nyre kapsel av nakne mus og lov til å spre seg og skille in vivo 6,9,30-32. På bestemte tidspunkter etter transplantasjon, er mus ofret og nyrene som inneholder de transplanterte ICC-verdiene er fjernet, fiksert i 4% paraformaldehyde, og innebygd i parafin. Sekvensielle 5-mikrometer seksjoner genereres enten på hotellet ved hjelp av en mikrotom eller av en kjerne mikros anlegget. Epitop avsløring og farging av proteiner fra parafin innebygd vev for immunofluorescent mikroskopi er beskrevet i tilleggsprotokoll 3,10 til 3.. 17 I Figur 3B, ble transplantert ICC-verdiene farget med epitelcelle markør pan cytokeratin (PanCK, grønn) og med Ki67 (rød) for å vurdere cellevekst. I et annet eksempel ble både humant insulin (grønn) og glukagon (rød) detektert etter transplantasjon og modning under nyrekapselen en naken mus (figur 3C).
Figur 1. Flytskjema for human foster ICC forberedelse og farging for Immunfluorescens.
Figur 2. Representative fetal ICC-verdiene forberedelse på 0, 24, 48 eller 72 timer etter plating. (A) ICC-verdienei suspensjon ble fotografert umiddelbart etter plating, (B) 24 timer etter plating, (C) 48 timer etter plating, eller (D) 72 timer etter plating. Målestokk for AC, 10X forstørrelse = 300 mikrometer, skala bar for D, 20 forstørrelse = 100 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
.. Figur 3 Immunfluorescens av belagt ICC-verdiene Rutinemessig, ICC-verdiene avbildes for (A) bukspyttkjertelen endoderm markør PDX1 (grønn), (B) endokrine celler (pan-CK, grønn) og spredning (Ki67, red), (C) insulin (grønn) og glukagon (rød). Målestokk for AC, 40X forstørrelse = 20 mikrometer.
Discussion
De metodene som presenteres her, lar en til å generere ICC-verdiene menneskelige foster bukspyttkjertelen og senere image for markører for celleproliferasjon og bukspyttkjertel endoderm fra. Prosessen med human fetal pancreas dissosiasjon kreves omtrent 90 min, etterfulgt av en 72 timers periode dannelse ICC, en fremgangsmåte som er vesentlig forskjellig fra protokoller for å isolere β celle stamceller fra mus. Protokollen presenteres her gir en reproduserbar metode som gjør det mulig for forskeren å utforske menneskelige foster bukspyttkjertelen utvikling. To forskjellige typer av langsgående studier kan utføres. For det første kan den potensielle for å generere funksjonelle pankreas celletyper (ductal celler, eksokrine celler, og hormon-positive celler) fra forskjellige svangerskaps aldre vurderes etter transplantasjon. For det andre, kan ICC-verdiene fra en enkelt gestasjonsalder dyrkes i kultur, behandlet med utvalgte farmakologiske midler og transplantert ved ulike tidspunkt i løpet av ICC kultur til å utforske forskjelleri celle skjebne. Med den enorme innsatsen for tiden rettet mot hESC differensiering inn insulinproduserende celler, er problemene knyttet til insulinsekresjon i respons til fysiologiske stimuli igjen blir gjenopplivet. Menneske ICC-verdiene gir en unik modellsystem for å studere denne kritiske aspektet av fosterets bukspyttkjertelen celleproliferasjon og β celle utvikling.
Som med hvilken som helst protokoll å isolere celler fra vev, detaljer er avgjørende for suksess. Et antall parametre er dessverre utenfor kontroll av laboratoriepersonalet som utfører eksperimentet. To problemer som oppstår ved dette laboratoriet omfatte dårlig kvalitet på utgangsmateriale og levering av ikke-pankreatisk vev. Sunn foster bukspyttkjertelen vev er fast til en sakse kutt. Hvis vevet kutt for lett, er det et tegn på at de pankreatiske enzymer har begynt å fordøye bukspyttkjertelen selv. Fra dette er det dessverre ingen utvinning og utarbeidelse er best kansellert. Sjelden, en ierfarne teknikere fjerne bukspyttkjertelen vil forvirre seksjoner av tarmen for bukspyttkjertelen. Disse prøvene vil ha mye mer elastisitet enn en bukspyttkjertel og en bemerkelsesverdig lumen vil være til stede. Igjen bør disse prøvene kastes.
Når protokollen ovenfor ble fulgt som beskrevet, er det sjelden problemer som oppstår for å kaste isolering av sporet. Et par punkter å huske på for å sikre en jevn isolasjon inkluderer, for å bruke skarp saks for presis bukspyttkjertelen skjæring og å sørge for å ikke la noen vevsprøve for stor til å fordøye. Hvis kuttene er ikke små nok, så kollagenase ikke virker effektivt, og det er få ICC-verdiene dannes. Motsatt, når du bruker en ny batch av collagenase, starter med et tilsvarende nivå dersom IE (internasjonale enheter) for fordøyelsen som tidligere ble brukt. Imidlertid reduserer inkubasjonstiden for å sikre at i løpet av fordøyelsen ikke forekommer. Denne feilsøkingsteknikk sikrer at IU etiketten ikke variere betydelig fra parti til BAtch.
Tatt i perspektiv, er denne teknikken for isolering humane føtale ICC-verdiene av relativt standard på området. De fleste laboratorier bekreftet våre funn at tillegg av HGF til media hjelper cellene overlever og sprer 33. I sammendraget har vi utviklet en metode for å isolere humane føtale ICC-verdiene frisk pankreata med gestational alder som spenner 9-23 uker. Cellene kan dyrkes som et monolag eller i suspensjon til eksperimenter for å visualisere endokrin pankreas transkripsjonsfaktorer og humant insulin.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av California Institute for Regenerative Medicine (RB3-02266) og NIH (DK54441).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trehalose SG | Hayashibara | Trehalose SG | |
| Collagenase XI | Sigma | C-9407 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 24020-117 | |
| RPMI 1640 with glutamate | Life Technologies | 11879020 | no glucose or HEPES |
| Human AB Sera, Male Donors | Omega Scientific | HS-30 | |
| Fungizone | Life Technologies | 15290018 | |
| Gentamicin Solution 50 mg/ml | Invitrogen | 15750060 | |
| 1 M Hepes, pH 7.0 | Life Technologies | 15630080 | |
| Penicillin/streptomycin 100x solution | Life Technologies | 15070063 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Peprotech | 100-39 | |
| GLP-1 | Peprotech | 130-08 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Dnase | Sigma | DN25 | |
| Sterile Petri dishes, 60 x 15 mm; stackable, venting ribs | Spectrum Laboratory Products, Inc. | D210-13 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| BrdU | Life Technologies | 00-0103 | |
| anti-insulin (mouse monclonal; 1:1,000) | Sigma | I2018 | |
| anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2,000) | Sigma | G2654 | |
| PDX1 (mouse monoclonal) | Novus Biologicals | NBP1-47910 | |
| PDX1 (goat polyclonal) | AbCam | 47383 | |
| PDX1 (rabbit polyclonal) | AbCam | 47267 | |
| Alexa Fluor 546 (rabbit) | Invitrogen | A11010 | |
| Alexa Fluor 546 (mouse) | Invitrogen | A11003 | |
| Alexa Fluor 488 (rabbit) | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa Fluor 488 (mouse) | Invitrogen | A11001 | |
| Ki67 | Lab Vision Neomarkers | RM 9016-50 | |
| pan-CK (mouse monoclonal; 1:100) | Immunotech | 2128 | |
| CK19 | AbD Serotech | MCA 2145 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
| HTB9 cell line | ATCC | 5637 | see Beattie 1997 reference to generate matrix |
| Agarose | Sigma | A-6013 |
References
- Tuch, B. E., Ng, A. B. P., Jones, A., Turtle, J. R. Histologic differentiation of human fetal pancreatic explants transplanted into nude mice. Diabetes. 33, 1180-1187 (1984).
- Tuch, B. E., Grigoriou, S., Turtle, J. R. Growth and hormonal content of human fetal pancreas passaged in athymic mice. Diabetes. 35, 464-469 (1986).
- Hullett, D. A., Falany, J. L., Love, R. B., Butler, J. A., Sollinger, H. W. Human fetal pancreas: Potential for transplantation. Transplantation Proceedings. XIX (1), 909-910 (1987).
- Hullett, D. A., Bethke, K. P., Landry, A. S., Leonard, D. K., Sollinger, H. W. Successful long-term cryopreservation and transplantation of human fetal pancreas. Diabetes. 38, 448-453 (1989).
- Tuch, B. E. Reversal of diabetes by human fetal pancreas. Transplantation. 51, 557-562 (1991).
- Beattie, G. M., Lopez, A. D., Otonkoski, T., Hayek, A. Transplantation of human fetal pancreas: fresh vs. cultured fetal islets or ICCS. J Mol Med. 77, 70-73 (1999).
- Joglekar, M. V., et al. The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells. Islets. 1, 137-147 (2009).
- Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Joglekar, S. V., Hardikar, A. A. Human fetal pancreatic insulin-producing cells proliferate in vitro. J Endocrinol. 201, 27-36 (2009).
- Kayali, A. G., et al. The SDF-1alpha/CXCR4 Axis is Required for Proliferation and Maturation of Human Fetal Pancreatic Endocrine Progenitor Cells. PLoS One. 7, (2012).
- Otonkoski, T., et al. Hepatocyte growth factor/scatter factor has insulinotropic activity in human fetal pancreatic cells. Diabetes. 43, 947-953 (1994).
- D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24, 1392-1401 (2006).
- Xu, X., et al. Endoderm and pancreatic islet lineage differentiation from human embryonic stem cells. Cloning Stem Cells. 8, 96-107 (2006).
- Jiang, J., et al. Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1940-1953 (2007).
- Shim, J. H., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells towards a pancreatic cell fate. Diabetologia. 50, 1228-1238 (2007).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26, 443-452 (2008).
- Van Hoof, D., D'Amour, K. A., German, M. S. Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).
- Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lees, J. G., Tuch, B. E. Conversion of embryonic stem cells into pancreatic beta-cell surrogates guided by ontogeny. Regen Med. 1, 327-336 (2006).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61, 2016-2029 (2012).
- Bai, L., Meredith, G., Tuch, B. E. Glucagon-like peptide-1 enhances production of insulin in insulin-producing cells derived from mouse embryonic stem cells. J Endocrinol. 186, 343-352 (2005).
- Semb, H. Definitive endoderm: a key step in coaxing human embryonic stem cells into transplantable beta-cells. Biochem Soc Trans. 36, 272-275 (2008).
- Van Hoof, D., Mendelsohn, A. D., Seerke, R., Desai, T. A., German, M. S. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endoderm in patterned size-controlled clusters. Stem Cell Res. 6, 276-285 (2011).
- Beattie, G. M., Otonkoski, T., Lopez, A. D., Hayek, A. Maturation and function of human fetal pancreatic cells after cryopreservation. Transplantation. 56, 1340-1343 (1993).
- Sandler, S., et al. Tissue culture of human fetal pancreas. Effects of nicotinamide on insulin production and formation of isletlike cell clusters. Diabetes. 38 Suppl 1, 168-171 (1989).
- Otonkoski, T., Beattie, G. M., Cirulli, V., Mally, M. I., Hayek, A. Pancreatic regeneration. Sharvetnick, N., Landes, R. G. , (1997).
- Otonkoski, T., Beattie, G. M., Mally, M. I., Ricordi, C., Hayek, A. Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells. J Clin Invest. 92, 1459-1466 (1993).
- Xie, R., et al. Dynamic chromatin remodeling mediated by polycomb proteins orchestrates pancreatic differentiation of human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 224-237 (2013).
- Hardikar, A. A., et al. Functional maturation of fetal porcine beta-cells by glucagon-like peptide 1 and cholecystokinin. Endocrinology. 143, 3505-3514 (2002).
- Beattie, G. M., Cirulli, V., Lopez, A. D., Hayek, A. Ex vivo expansion of human pancreatic endocrine cells. J Clin Endocrinol Metab. 82, 1852-1856 (1997).
- Beattie, G. M., et al. Trehalose: a cryoprotectant that enhances recovery and preserves function of human pancreatic islets after long-term storage. Diabetes. 46, 519-523 (1997).
- Hayek, A., Beattie, G. M. Experimental transplantation of human fetal and adult pancreatic islets. J Clin Endocrinol Metab. 82, 2471-2475 (1997).
- Otonkoski, T., Beattie, G. M., Lopez, A. D., Hayek, A. Use of hepatocyte growth factor/scatter factor to increase transplantable human fetal islet cell mass. Transplant. Proc. 26, 33-34 (1994).
- Beattie, G. M., et al. A novel approach to increase human islet cell mass while preserving beta-cell function. Diabetes. 51, 3435-3439 (2002).
