Summary
Ett protokoll för att isolera, kultur, och bild holme cell kluster (ICCS) som härrör från mänskliga foster pankreasceller beskrivs. Metoden beskrivs de åtgärder som krävs för att generera ICCs från vävnad, kultur som monolager eller i suspension som aggregat, och bilden för markörer för proliferation och pankreas cell öde beslut.
Abstract
I nästan 30 år har forskare visat att humana fetala ICCs transplanterade under njurkapseln i nakna möss mognat till fungerande endokrina celler, vilket framgår av en betydande ökning av cirkulerande human C-peptid efter glukosstimulering 1-9. Men in vitro är låg 10 uppkomsten av insulinproducerande celler från mänskliga foster ICCs; resultat som påminner om de senaste experiment utförda med mänskliga embryonala stamceller (hESC), en förnybar celler som håller stort löfte som en potentiell terapeutisk behandling för typ 1-diabetes. Som ICCs, transplantation av delvis differentierade hESC genererar glukos lyhörd, insulinproducerande celler, men in vitro uppkomsten av insulinproducerande celler från stamceller från mänskliga embryon är mycket mindre robust 11-17. En fullständig förståelse av de faktorer som påverkar tillväxt och differentiering av endokrina prekursorceller kommer sannolikt att kräva uppgifter som genereras från både ICCs och HESC. Medan ett antal protokoll existerar för att generera insulinproducerande celler från hESC in vitro 11 till 22, mycket färre existera för ICCs 10,23,24. En del av denna diskrepans sannolikt kommer från svårigheten att arbeta med mänskliga foster bukspottkörteln. Mot detta syfte har vi fortsatt att bygga vidare på befintliga metoder för att isolera foster holmar från mänskliga pancreases med gestational åldrar 12-23 veckor, odla cellerna som ett monolager eller i suspension, och bilden för celltillväxt, pankreas markörer och mänskliga hormoner däribland glukagon och C-peptid. ICCs genereras av protokollet beskrivet nedan i C-peptid frisättning efter transplantation under njurkapseln hos nakna möss som liknar C-peptidnivåer som erhållits genom transplantation av färsk vävnad 6. Även om de exempel som presenteras här fokuserar på den pankreatiska endoderm proliferation och β-cell genes kan protokollet användas för att studera andra aspekter av pankreatisk utveckling, Inklusive exokrin, duktal, och andra hormonproducerande celler.
Introduction
En primär begränsning till cellbaserade insulinersättningsterapier i typ 1-diabetes är bristen på mänskliga holmar tillgängliga för transplantation. Förmågan att reglera proliferationen och differentieringen av humana pankreatiska prekursorceller till insulinproducerande celler som uppfyller de metaboliska kraven på en insulinbristtillstånd förblir en kritisk byggsten för en cellbaserad terapi för att behandla typ 1-diabetes.
Fram till tillkomsten av stamceller från mänskliga embryon härledda insulinproducerande celler, humana fetala pankreas endokrina celler eller deras föregångare betraktades som potentiella källor till celler för klinisk transplantation. Även om den vetenskapliga och rättsliga landskapet har förändrats under de senaste åren, finns det fortfarande ett stort behov för att förstå hur den mänskliga foster bukspottkörteln utvecklas. Många visa nu terapeutisk användning av mänskliga fosterceller som osannolikt, men om effektiva och säkra metoder för att expandera cellerna etablerades, terapeutisk användning av dessa celler kunde agAin utforskas. Ett stort hinder som återstår är att in vitro transformation av humana fetala pankreasceller aggregat (ICCS) till glukos lyhörd, är insulinproducerande endokrina celler närvarande en ineffektiv process. Även om mycket arbete under nästan 30 år har klarlagts och avgränsas uttrycksprofilen av transkriptionsfaktorer som krävs för utvecklingen av endokrina pankreas, finns det fortfarande luckor i vår kunskap om hur tidsmässiga uttryck av transkriptionsfaktorer är reglerad och relateras till cellernas funktion.
Fram till tillkomsten av stamceller från mänskliga embryon härledda insulinproducerande celler, humana fetala pankreas endokrina celler eller deras föregångare betraktades som potentiella källor till celler för klinisk transplantation. Även om den vetenskapliga och rättsliga landskapet har förändrats under de senaste åren, finns det fortfarande ett stort behov för att förstå hur den mänskliga foster bukspottkörteln utvecklas. Många visa nu terapeutisk användning av mänskliga fosterceller som osannolikt, men om effektivoch säkra metoder för att expandera cellerna etablerades, terapeutisk användning av dessa celler kunde återigen undersökas. Ett stort hinder som återstår är att in vitro transformation av humana fetala pankreasceller aggregat (ICCS) till glukos lyhörd, är insulinproducerande endokrina celler närvarande en ineffektiv process. Även om mycket arbete under nästan 30 år har klarlagts och avgränsas uttrycksprofilen av transkriptionsfaktorer som krävs för utvecklingen av endokrina pankreas, finns det fortfarande luckor i vår kunskap om hur tidsmässiga uttryck av transkriptionsfaktorer är reglerad och relateras till cellernas funktion.
Nyligen har stamcellsfältet används den ackumulerade kunskapen om tidstranskriptionsfaktor uttryck under holme utveckling för att driva produktionen av celler som uttrycker markörer för mogna endokrina celler. Även uppkomst av insulinproducerande celler från stamceller från mänskliga embryon och inducerade pluripotenta celler (iPSC) har gjort betydande ochbetydande framsteg under de senaste åren, de mest effektiva protokoll kräver två olika differentierings faser: 1) en tidig in vitro differentiering för att generera celler som uttrycker bukspottkörtel gångare transkriptionsfaktorer, följt av 2) in vivo-mognad efter transplantation - en så kallad "black box "period. För att flytta framåt, framsteg i att förstå biologi underliggande holmen mognad in vivo, oavsett cellkälla, måste förstås på en biokemisk nivå. Likheten mellan de resultat som erhållits med ICCs och hESC tyder på att ett antal kritiska biokemiska processer som reglerar övergången av humana pankreas prekursorceller till mogna, glukos lyhörd, insulinproducerande celler in vitro är fortfarande okända. En central del i denna överenskommelse är att utveckla nya metoder för att få fram fungerande endokrina cellpopulationer från pankreas progenitorceller och stamceller från mänskliga embryon kommer att kräva inte bara biokemisk caoaches som belyser mognadshändelser, men metoder för att analysera förändringarna.
Varför tror vi att avbilda humana fetala celler i bukspottkörteln är en viktig aspekt för att identifiera förändringar i holme mognad? Svaret ligger delvis i den historiska strävan att skapa insulinproducerande celler. Både modellen och vävnadskultursystem för pankreas prekursorer och holmar har låtit forskare att utforska de stora skillnader som finns mellan mognaden av djur holmar och humana öar in vitro. En begränsning till utforskandet av människans foster bukspottkörteln utveckling är att de gestational åldrar som lagligen får användas ger endast upphov till heterogena cellaggregat. Även de isolerade fetala mänskliga celler liknar holmar, färgning efter in vitro-kultur från graviditets åldrarna 9-23 veckor avslöjar mindre än 15% innehåller markörer för endokrina celler, med de flesta celler som inte färgning för holme hormoner. Emellertid efter transplantation och vidvivo mognad, en stor majoritet av celler uttrycker endokrina markörer 6,25. Resultaten från dessa studier genom ekade i dag med hESC differentieringsprotokoll som endast kan generera små populationer av enstaka hormon positiva endokrina celler efter in vitro differentiering. In vitro-metoder för att förbättra populationer av hormon positiva celler kommer sannolikt att ge insikt i in vivo-holme mognad. Dessutom förstå de molekylära händelser som driver mänsklig fosterpankreas utveckling kommer sannolikt att förbättra arbetet med att härleda insulinproducerande celler från stamceller från mänskliga embryon och ytterligare avgränsa de mekanismer som reglerar β cellförnyelsen och pankreascelltransdifferentiering.
Likheterna mellan human fetal pankreatisk cell och hESC mognad kan utvidgas till cellfunktion. Liksom murina celler, både humana fetala celler och differentierade hESC är oförmögna att frisätta insulin som svar på glukosefter holme nybildning in vitro 26,27. Men efter transplantation in i nakna möss och mognad, både mänskliga holme-liknande kluster och insulinproducerande celler från stamceller från mänskliga embryon uppvisar en endokrin fenotyp. Tre månader efter transplantation, nästan 90% av de transplanterade cellerna från antingen befolkningen är insulin positiva, och fungera normalt bestämt med lanseringen av C-peptid 17,26. Dessa resultat tyder på att transplantation ger sammanhang och oidentifierade signaler som främjar holme mognad. Optimerad avbildningsprotokoll som den som beskrivs här, för humana fetala pankreasceller kommer att hjälpa till i sökandet för att identifiera faktorer som modulerar och påskynda mognad. Grundläggande biokemiska utforskning av humana fetala pankreasceller och stamceller från mänskliga embryon differentierade mot en endokrin härstamning i detta skede av utveckling är avgörande för att mäta effektiviteten av mognad.
Följande protokoll, som beskrivs i Figure 1, ger vår nuvarande metod för isolering av humana fetala pankreasceller, som kallas ICCs från hela den mänskliga foster bukspottkörteln och avbildning av dessa celler. Detta protokoll kräver en initial beredning av celler från vävnad, som därefter kan odlas som ett monoskikt eller i suspension. Beredning av celler för avbildning av vanliga markörer för endokrin celltillväxt och mognad beskrivs.
Generering och avbildning av ICCs i frånvaro eller närvaro av en mängd olika kemiska modifieringsmedel ger en snabb metod, jämfört med transplantationsmodeller för att identifiera odlingsbetingelser och föreningar som påskyndar mognaden av humana fetala bukspottkörtelceller i fullt fungerande exokrin, duktal, eller hormonproducerande celler i bukspottkörteln.
Protocol
Notes innan du sätter igång:
- Mänskliga foster pankreata erhölls från fosterskador Research Laboratory, University of Washington (Seattle, Washington, USA) som skördade vävnaden. Informerat samtycke för vävnadsdonation, lagring och användning av de prover som erhölls från donatorer genom mitten. Protokollet samtycke uttalande lämnades skriftligen och University of California, San Diego Human Research Skydd Program godkände hela studien (Protokoll # 081237XT).
- Det är nödvändigt att bibehålla både human fetal pancreas och behållaren som håller bukspottkörteln på is under hela förfarandet. Den dissociation och matsmältning bör utföras så snabbt som möjligt.
- Skicka den klinik där den human fetal pancreas erhölls från bufferten för lagring och transport av bukspottkörteln. (RPMI-1640 + 10% normalt humanserum (NHS), 300 mM trehalos SG, penicillin / streptomycin och fungizon).
1. Dissekering av mänskliga Fostrets Bukspottkörteln
- Lös upp 5 mg av RT koUagenas XI i HBSS för att ge en slutlig koncentration av 2,5 mg / ml. Filtrera sterilisera lösningen med ett 0,22 | im sprutfilter i en steril (autoklaverad) scintillationsflaska och förvara vid 4 ° C. I en vävnadskultur huva, anges två sterila petriskålar, en steril liten degel (om en degel inte är tillgänglig, kan en liten bägare ersättas), steriliserade sax och pincett. Tillsätt 2 ml HBSS till en petriskål för att tvätta bukspottkörteln. Aspirera vätska från röret med foster bukspottkörteln, lämnar ungefär 1 ml.
- Ta bort bukspottkörteln med pincett i 60 mm petriskål utan HBSS. För dessa experiment är fetala ICCs genereras från färsk pancreata med gestational åldrar 9-23 veckor. Isolering från pancreata vid tidigare gestionational åldrar är svårt på grund av storleken på bukspottkörteln. Protokollet kommer sannolikt gäller för graviditetstiden längre än 23 veckor, men förvärv av pancreata efter denna tid är svårt på grund av den federala (US) begränsningar. Ibland kommer fostrets bukspottkörteln med mjälten, fett eller bindväv fäst från den ursprungliga dissektion. Den extra vävnad är väl synlig för blotta ögat och bör tas bort från bukspottkörteln före start av protokollet.
- Skölj bukspottkörteln i en minimal volym av kall HBSS (~ 0,5 ml) i en petriskål.
- Flytta de rengjorda bukspottkörteln till den lilla sterila degeln med hjälp av steril pincett och placera i en ishink. Placera degeln i en hållare för en 50 ml centrifugrör och, med hjälp av 2 saxar, kraftigt skära bukspottkörteln i flera minuter. (Vanligtvis 2-5 min, men den tid som beror på storleken och fastheten hos vävnaden). Skärtekniken är viktig. Håll en sida av saxen i ett fast läge i rörelse endast de motstående handtag. Spetsarna på saxen bör vila på botten av degeln. Fortsätt med snabba sax rörelse för att bryta bukspottkörteln i småbitar. Ju mindre bitar av vävnad, desto bättre kollagenas kommer att fungera.
- Lägg till 1,5 ml HBSS + de hackade upp bukspottkörteln till injektionsflaskan med kollagenas och placera i ett vattenbad skakapparat till 37 ° C vid 200 varv per minut i upp till 10 minuter. Kontrollera inte oftare än en gång under de första 5 min. Uppslutningstiden beror på vävnadskvalitet kan så litet som 6 minuter vara tillräcklig. Slutpunkten är då partiklarna är små och likformiga.
- Fyll flaskan (10-15 ml) med kall HBSS att stoppa kollagenas aktiviteten. Placera på is och låt klumparna att sedimentera under 10 min. Ofta på denna punkt, har viss celldöd inträffade och DNA frisätts i medierna. Detta kan göra media "trådiga"; i det här fallet, tillsätt 100 l DNas (10 mg / ml lager) till lösningen.
- När vävnaden i scintillationsflaska har lagt sig under 10 minuter, aspirera bort det översta lagret lämnar den knappt halvfullt (7-8 ml). Överför celler till ett 15 ml koniskt rör, Tillsätt 5 ml HBSS. Centrifugera i 5 minuter vid 300 x g..
- Aspirera HBSS och återsuspendera cellerna i 5 ml medium innehållande RPMI-1640, glutamax, 10% normalt humant serum (NHS), 10 mM HEPES pH 7,2, penicillin / streptomycin och fungizon. Platta på 60 mm petriskål. För forskare som försöker generera β celler, till HGF (10 ng / ml slutlig) till medierna. Dessutom har ett antal grupper har visat att komplettera odlingsmediet med inkretinhormon GLP-1 ökar också β-celler 28. Celler bör vara kvar i suspension i 72 timmar för att aggregera och bilda ICCs.
- Efter 72 h i suspension kan celler utströks på matrisen av den humana cellinjen HTB9 matrisen som beskrivits tidigare 29. Oavsett tillväxtförhållanden, bör medierna bytas varje 48 timmar.
2. Immunfluorescens av markörer för Endocrine Cell Proliferation och Mognad i ICCs Odlas i Suspension, Monolayer, eller på täckglas
- För att mäta cellproliferation, är BrdU-märkning av antingen vidhäftande celler eller celler i suspension utförs under 12 h före PFA fixation. BrdU reagens späds 1:100 och filtersteriliseras i RPMI-1640, glutamax, 10% NHS, 10 mM HEPES pH 7,0, penicillin / streptomycin och fungizon.
- För celler i suspension: Centrifugera i 5 minuter vid 300 xg och aspirera odlingsmedium. Tillsätt 10 ml PBS för att tvätta ICCs, centrifugera under 5 minuter vid 300 xg och aspirera. Om ICCs ska bäddas in i paraffin, följ frivilligt protokoll 3,1-3,17 För vidhäftande celler:. Avlägsna odlingsmedium och tvätta cellerna med PBS enligt ovan. Fix-celler under 20 minuter med 4% PFA vid RT, sedan tvätta två gånger med PBS. Vid denna punkt, kan plattorna lindas med Parafilm och förvaras i PBS vid 4 ° C i upp till en vecka.
- Inkubera cellerna med 0,2% Triton-X-100 i PBS under 10 min vid rumstemperatur. Tvätta cellerna två gånger med PBS och applicera blockeringsbuffert (2% donkey serum, 2% bovint serumalbumin, 50 mM glycin spätt i PBS) under en timme. Tvätta cellerna med Working Buffer (Blocking Buffer utspädd 1:10). Späd antikroppen i arbetsbufferten. För celler odlade på täckglas av glas, utspädd antikroppen i 60 ^ il total volym. För celler i en 6-brunnsskål, späd antikropp i 600 ul total volym. För att fläcka flera epitoper kan en cocktail av antikroppar användas. Som kontroll använder IgG eller pre-immunserum i stället för den specifika antikroppen. Kontrollprover måste inkuberas med kontroll-IgG från samma art som den primära antikroppen som används.
- Inkubera den primära antikroppen antingen 1,5 h vid RT eller O / N vid 4 ° C. Aspirera den primära antikroppen och tvätta 3x med Working Buffer vid RT.
- Späd den sekundära antikroppen på 1:200 för Rhodamine och FITC konjugerade antikroppar, 1:500 - 1:1000 för Alexa konjugerade antikroppar. Det är viktigt att notera att alla sekundära antikroppar är ljuskänsliga. Täck provernai aluminiumfolie för att förhindra förlust av signal. Inkubera under en timme vid RT.
EXTRA: För att visualisera kärnor, kan DAPI läggas till 1:500 under den sekundära inkubation. Detta är användbart för kvantifiering av proteinuttryck i den totala cellpopulationen. - Aspirera den sekundära antikroppen och tvätta 3x med Working Buffer vid RT. För celler som odlats på ett täckglas, försiktigt lyfta täckglas med pincett medan nedsänkt i bufferten; tvätta den genom nedsänkning i PBS. För celler odlade i en platta med 6 brunnar, till PBS för att tvätta och aspirera. Vid denna punkt är de redo att undersöka, under ett inverterat mikroskop.
- Peka på kanten av täckglas försiktigt på en Kimwipe att bli av med överflödigt PBS. Lägg en droppe monterings gel på en glasskiva och invertera täckglas på objektglaset. Ta bort överflödigt monterings gel genom aspiration. Knacka täckglas försiktigt med baksidan av en 200 l pipett spets för att ta bort bubblor.
- Torka i rumstemperatur i ca 20 min eller O / N vid 4 ° C och undersök provet i ett fllysrör eller konfokalmikroskop.
3. (Valfritt) immunofluorescensfärgning av proteiner från paraffin ICCs
- Förbered en 3% agaros-lösning och låt svalna till 55-60 ° C.
- Överför ICCs inkuberade i suspension i ett 15 ml koniskt rör och centrifugera vid 1500 xg under 5 min vid rumstemperatur.
- Aspirera media från cellerna och fixa med 500 l 4% PFA i 10 min vid RT. Blanda inte pelleten, om pelleten är mycket stor.
- Tvätta pelleten två gånger med 750 pl PBS. Liksom 4% PFA, är detta avfall anses vara farliga och ska kasseras enligt institutionens farligt avfall specifikationer.
- Flick försiktigt cellpelleten att lossa och lägga 150-200 pl av agaros ner väggen i 15 ml koniska rör.
- Blanda genom att försiktigt ställa röret, men inte bildar bubblor.
- Låt stelna vid 4 ° C under 5-10 min.
- Använd en 21 G-nål för att lösgörapelleten och plats i en färsk 15 ml koniska rör.
- Paraffininbäddning och utarbetandet av avsnitten på objektglas kan göras på plats med hjälp av en mikrotom eller din kärna mikroskopifaciliteter.
- Avparaffinera vävnad, hydrat och tvätta med vatten snabbt.
- Lägg till 0,2 M glycin under 30 min vid RT för att släcka återstående aldehyd.
- Tvätta sliden två gånger med PBS under 2 min vardera.
- För antigenåtervinning, ta med 10 mM citratbuffert (pH 6,0) för att koka över värmeplatta. Doppa glasen i bufferten, vänta på att komma tillbaka till en koka, och vänta 15 min.
- Ta bort bägaren från värmeplattan. Vänta ca 40 min för bilderna svalna i bufferten.
- Tvätta sliderna två gånger med H2O under 5 min vardera, tvätta objektglasen två gånger med PBS under 5 min vardera, block med 2% normal donkey serum i PBS under 1 timme.
- Inkubera med primär antikropp, utspädd till rätt koncentration i arbetsbuffert innehållande 0,2% Triton X-100.Generellt är den primära antikroppen inkuberas över natten vid färgning för transkriptionsfaktorer och för 1,5 timmar om färgning för hormoner, markörer för proliferation, och / eller differentiering.
- Följ steg 2,3-2,9 beskrivits ovan.
Representative Results
Noggrann förberedelse av foster ICCs är avgörande för framgång i detta protokoll. Representativa bilder av hur cellerna ser vanligtvis vid bestämda perioder efter utstrykning visas i figur 2. Efter rening de nyligen pläterade cellaggregat visas som små, glesa tydliga kluster som innehåller några få celler (Figur 2A). Efter den första 24 h (figur 2B), många av de cellkluster bli större, men många små kluster kvar. Av 48 timmar har de kluster expanderat kraftigt, men förblir asymmetriska (figur 2C). Vid 72 timmar, bör ICCs vara klar, relativt likformig i storlek och form (figur 2D). Det är vid denna punkt som cellerna kan antingen pläterade på matriser, såsom HTB-9, till 24 h före immunofluorescens eller fick växa under ytterligare 72 h i frånvaro eller närvaro av kemikalier eller droger, som kan förändra uttrycket av gener krävs för bukspottkörtel endokrina cell generation. Figur 3 belyser ett antal vanliga antikroppar vid bedömning ICC proliferation eller differentiering mot bukspottkörtel endoderm. I figur 3A har ICCs utströks på HTB-9, odlades under 4 dagar, och färgades för PDX1, en kritisk markör av pankreatisk utveckling. Även om in vitro-färgning av ICCs utförs rutinmässigt i vårt laboratorium, oftare, är humana fetala ICCs transplanterats under njurkapseln hos nakna möss och får föröka sig och differentiera in vivo 6,9,30-32. Vid bestämda tidpunkter efter transplantation, är mössen och njuren som innehåller de transplanterade ICCs avlägsnas, fixeras i 4% paraformaldehyd, och bäddas in i paraffin. Sekventiell 5-ìm sektioner genereras antingen på plats med hjälp av en mikrotom eller av en kärna mikroskopi anläggning. Epitope avslöjandet och färgning av proteinerna från paraffininbäddade vävnader för immunfluorescensmikroskopi beskrivs i valfri protokoll 3,10-3.. 17 I figur 3B, var transplanterade ICCs färgas med den epitelceller markör pan cytokeratin (PanCK, grön) och med Ki67 (röd) för att bedöma celltillväxt. I ett annat exempel var båda humaninsulin (grön) och glukagon (röd) detekterades efter transplantation och mognad under njurkapseln hos en naken mus (Figur 3C).
Figur 1. Flödesschema av mänskliga foster ICC förberedelse och färgning för immunofluorescens.
Figur 2. Representant foster ICCs förberedelse vid 0, 24, 48, eller 72 timmar efter plätering. (A) ICCsi suspension avbildades omedelbart efter plätering, (B) 24 h efter plätering, (C) 48 h efter plätering, eller (D) 72 h efter plätering. Skala bar för AC, 10x förstoring = 300 um, skala bar för D, 20 förstoring = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
.. Figur 3 Immunfluorescens av pläterade ICCs Rutinmässigt är ICCs avbildas för (A) i bukspottskörteln endoderm markör PDX1 (grön), (B) endokrina celler (pan-CK, grön) och proliferation (Ki67, röd), (C) insulin (grön) och glukagon (röd). Scale bar för AC, 40X förstoring = 20 | im.
Discussion
De metoder som presenteras här möjliggör en att generera ICCs från mänskliga foster bukspottkörteln och därefter bild för markörer för celltillväxt och pankreas endoderm. Processen för mänskliga foster bukspottkörteln dissociation krävs ca 90 min, följt av en 72 hr ICC bildningsperiod, en strategi som skiljer sig avsevärt från protokoll för att isolera β cell stamceller från mus. Protokollet som presenteras här ger en reproducerbar metod som gör det möjligt för forskare att undersöka human fetal pankreatisk utveckling. Två olika typer av longitudinella studier kan utföras. För det första kan den potential att generera funktionella pankreascelltyper (duktal celler, exokrina celler, och hormon positiva celler) från olika gestational åldrar bedömas efter transplantation. För det andra kan ICCs från en enda gestationsålder odlas i kultur, behandlades med utvalda farmakologiska medel och transplanteras vid olika tidpunkter under ICC-kultur för att utforska skillnadernai cell öde. Med de enorma ansträngningar som för närvarande riktas mot hESC differentiering till insulinproducerande celler, är problemen med insulinutsöndring som svar på fysiologiska stimuli igen återupplivas. Mänskliga ICCs ger ett unikt modellsystem för att studera denna kritiska aspekten av foster bukspottkörteln celltillväxt och β cellutveckling.
Som med alla protokoll för att isolera celler från vävnader, detaljer är avgörande för framgång. Ett antal parametrar finns tyvärr utanför kontroll av den laboratoriepersonal som utför experimentet. Två problem som detta laboratorium inkluderar dålig kvalitet på utgångsmaterial och tillhandahållande av icke-pankreatisk vävnad. Friska foster pankreasvävnad är fast till en sax klippa. Om styckningsdelar, vävnads för lätt, är det ett tecken på att de pankreasenzymer har börjat smälta bukspottkörteln själv. Från detta finns det tyvärr ingen återhämtning och förberedelser är bäst avbryts. Sällan, en ierfaren tekniker att ta bort bukspottkörteln kommer att förvirra delar av tarmen för bukspottkörteln. Dessa prover kommer att ha mycket mer elasticitet än en bukspottkörtel och en anmärkningsvärd lumen kommer att närvara. Återigen bör dessa prover kasseras.
När protokollet ovan följs som beskrivs, det finns sällan några problem som uppstår för att kasta isoleringen ur spår. Några punkter att komma ihåg för att säkerställa en smidig isolering ingår, för att använda vass sax för exakt bukspottkörteln skärning och för att se till att inte lämna någon vävnadsprov för stor för att smälta. Om snitten inte är tillräckligt små, då kollagenas inte fungerar effektivt, och få ICCs bildas. Omvänt, när en ny kull av kollagenas, börja med en liknande nivå om IE (internationella enheter) för matsmältningen som tidigare använts. Emellertid minska inkubationstiden för att säkerställa att över matsmältningen inte sker. Denna felsökningsteknik säkerställer att IU etiketten inte varierar kraftigt från parti till batch.
Taget i perspektiv, är relativt vanlig denna teknik för isolering av humana fetala ICCs i fält. De flesta laboratorier bekräftade våra iakttagelser att tillägg av HGF till media hjälper cellerna att överleva och föröka sig 33. Sammanfattningsvis har vi utvecklat en metod för att isolera mänskliga foster ICCs frisk pancreata med gestational åldrar 9-23 veckor. Cellerna kan odlas som ett monolager eller i suspension för försök att visualisera pankreas endokrina transkriptionsfaktorer och humant insulin.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av California Institute för regenerativ medicin (RB3-02266) och NIH (DK54441).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trehalose SG | Hayashibara | Trehalose SG | |
| Collagenase XI | Sigma | C-9407 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 24020-117 | |
| RPMI 1640 with glutamate | Life Technologies | 11879020 | no glucose or HEPES |
| Human AB Sera, Male Donors | Omega Scientific | HS-30 | |
| Fungizone | Life Technologies | 15290018 | |
| Gentamicin Solution 50 mg/ml | Invitrogen | 15750060 | |
| 1 M Hepes, pH 7.0 | Life Technologies | 15630080 | |
| Penicillin/streptomycin 100x solution | Life Technologies | 15070063 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Peprotech | 100-39 | |
| GLP-1 | Peprotech | 130-08 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Dnase | Sigma | DN25 | |
| Sterile Petri dishes, 60 x 15 mm; stackable, venting ribs | Spectrum Laboratory Products, Inc. | D210-13 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| BrdU | Life Technologies | 00-0103 | |
| anti-insulin (mouse monclonal; 1:1,000) | Sigma | I2018 | |
| anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2,000) | Sigma | G2654 | |
| PDX1 (mouse monoclonal) | Novus Biologicals | NBP1-47910 | |
| PDX1 (goat polyclonal) | AbCam | 47383 | |
| PDX1 (rabbit polyclonal) | AbCam | 47267 | |
| Alexa Fluor 546 (rabbit) | Invitrogen | A11010 | |
| Alexa Fluor 546 (mouse) | Invitrogen | A11003 | |
| Alexa Fluor 488 (rabbit) | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa Fluor 488 (mouse) | Invitrogen | A11001 | |
| Ki67 | Lab Vision Neomarkers | RM 9016-50 | |
| pan-CK (mouse monoclonal; 1:100) | Immunotech | 2128 | |
| CK19 | AbD Serotech | MCA 2145 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
| HTB9 cell line | ATCC | 5637 | see Beattie 1997 reference to generate matrix |
| Agarose | Sigma | A-6013 |
References
- Tuch, B. E., Ng, A. B. P., Jones, A., Turtle, J. R. Histologic differentiation of human fetal pancreatic explants transplanted into nude mice. Diabetes. 33, 1180-1187 (1984).
- Tuch, B. E., Grigoriou, S., Turtle, J. R. Growth and hormonal content of human fetal pancreas passaged in athymic mice. Diabetes. 35, 464-469 (1986).
- Hullett, D. A., Falany, J. L., Love, R. B., Butler, J. A., Sollinger, H. W. Human fetal pancreas: Potential for transplantation. Transplantation Proceedings. XIX (1), 909-910 (1987).
- Hullett, D. A., Bethke, K. P., Landry, A. S., Leonard, D. K., Sollinger, H. W. Successful long-term cryopreservation and transplantation of human fetal pancreas. Diabetes. 38, 448-453 (1989).
- Tuch, B. E. Reversal of diabetes by human fetal pancreas. Transplantation. 51, 557-562 (1991).
- Beattie, G. M., Lopez, A. D., Otonkoski, T., Hayek, A. Transplantation of human fetal pancreas: fresh vs. cultured fetal islets or ICCS. J Mol Med. 77, 70-73 (1999).
- Joglekar, M. V., et al. The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells. Islets. 1, 137-147 (2009).
- Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Joglekar, S. V., Hardikar, A. A. Human fetal pancreatic insulin-producing cells proliferate in vitro. J Endocrinol. 201, 27-36 (2009).
- Kayali, A. G., et al. The SDF-1alpha/CXCR4 Axis is Required for Proliferation and Maturation of Human Fetal Pancreatic Endocrine Progenitor Cells. PLoS One. 7, (2012).
- Otonkoski, T., et al. Hepatocyte growth factor/scatter factor has insulinotropic activity in human fetal pancreatic cells. Diabetes. 43, 947-953 (1994).
- D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24, 1392-1401 (2006).
- Xu, X., et al. Endoderm and pancreatic islet lineage differentiation from human embryonic stem cells. Cloning Stem Cells. 8, 96-107 (2006).
- Jiang, J., et al. Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1940-1953 (2007).
- Shim, J. H., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells towards a pancreatic cell fate. Diabetologia. 50, 1228-1238 (2007).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26, 443-452 (2008).
- Van Hoof, D., D'Amour, K. A., German, M. S. Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).
- Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lees, J. G., Tuch, B. E. Conversion of embryonic stem cells into pancreatic beta-cell surrogates guided by ontogeny. Regen Med. 1, 327-336 (2006).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61, 2016-2029 (2012).
- Bai, L., Meredith, G., Tuch, B. E. Glucagon-like peptide-1 enhances production of insulin in insulin-producing cells derived from mouse embryonic stem cells. J Endocrinol. 186, 343-352 (2005).
- Semb, H. Definitive endoderm: a key step in coaxing human embryonic stem cells into transplantable beta-cells. Biochem Soc Trans. 36, 272-275 (2008).
- Van Hoof, D., Mendelsohn, A. D., Seerke, R., Desai, T. A., German, M. S. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endoderm in patterned size-controlled clusters. Stem Cell Res. 6, 276-285 (2011).
- Beattie, G. M., Otonkoski, T., Lopez, A. D., Hayek, A. Maturation and function of human fetal pancreatic cells after cryopreservation. Transplantation. 56, 1340-1343 (1993).
- Sandler, S., et al. Tissue culture of human fetal pancreas. Effects of nicotinamide on insulin production and formation of isletlike cell clusters. Diabetes. 38 Suppl 1, 168-171 (1989).
- Otonkoski, T., Beattie, G. M., Cirulli, V., Mally, M. I., Hayek, A. Pancreatic regeneration. Sharvetnick, N., Landes, R. G. , (1997).
- Otonkoski, T., Beattie, G. M., Mally, M. I., Ricordi, C., Hayek, A. Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells. J Clin Invest. 92, 1459-1466 (1993).
- Xie, R., et al. Dynamic chromatin remodeling mediated by polycomb proteins orchestrates pancreatic differentiation of human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 224-237 (2013).
- Hardikar, A. A., et al. Functional maturation of fetal porcine beta-cells by glucagon-like peptide 1 and cholecystokinin. Endocrinology. 143, 3505-3514 (2002).
- Beattie, G. M., Cirulli, V., Lopez, A. D., Hayek, A. Ex vivo expansion of human pancreatic endocrine cells. J Clin Endocrinol Metab. 82, 1852-1856 (1997).
- Beattie, G. M., et al. Trehalose: a cryoprotectant that enhances recovery and preserves function of human pancreatic islets after long-term storage. Diabetes. 46, 519-523 (1997).
- Hayek, A., Beattie, G. M. Experimental transplantation of human fetal and adult pancreatic islets. J Clin Endocrinol Metab. 82, 2471-2475 (1997).
- Otonkoski, T., Beattie, G. M., Lopez, A. D., Hayek, A. Use of hepatocyte growth factor/scatter factor to increase transplantable human fetal islet cell mass. Transplant. Proc. 26, 33-34 (1994).
- Beattie, G. M., et al. A novel approach to increase human islet cell mass while preserving beta-cell function. Diabetes. 51, 3435-3439 (2002).
