Hücre Takip için vivo ¹⁹ F MRG

Summary

Ex vivo olarak etiketlenmiş hücreler ile bir fare modelinde, MRI kullanılarak in vivo hücre takibi için genel bir protokol açıklar. Hücre etiketleme, görüntü alma ve işleme ölçümü için tipik bir protokol dahildir.

Abstract

^19, in vivo olarak F MRI iyonlaştırıcı radyasyon kullanılmadan niceliksel hücre izleme sağlar. Bu insanlara uygulanabilen bir invazif olmayan bir tekniktir. Burada, biz cep etiketleme, görüntüleme ve görüntü işleme için genel bir protokol açıklar. Burada kemirgen bağışıklık hücrelerini izleme için tipik bir fare modeli üzerinde durulacak, ancak bu teknik, hücre tipleri ve çeşitli hayvan modelleri için de geçerlidir. Bu tüm modeller alakalı olarak hücre etiketleme için en önemli sorunlar, tarif edilmiştir. Ayrıntılar MRI sistemi ve bireysel özelliklerine bağlı olarak değişir, ancak Benzer bir şekilde, önemli bir görüntüleme parametreleri listelenmiştir. Son olarak, miktar tayini için bir görüntü işleme protokolü bulunmaktadır. Bu için Çeşitlemeler, ve diğer protokol kısımları, Tartışma bölümünde değerlendirilir. Burada açıklanan detaylar prosedüre göre, kullanıcı her özel hücre tipi, hücre etiket, hayvan modeli ve görüntüleme kurulum için protokol uyarlamak gerekir. Not potokol da sürece klinik sınırlamaları karşılandığı gibi, insan kullanımı için uyarlanabilir.

Introduction

Vivo hücre izleme hücresel tedavilerin ¹ optimizasyonu ve izlenmesi için gereklidir. Nedeniyle invaziv olmayan doğası, görüntüleme in vivo hücreleri izlemek için mükemmel fırsatlar sunuyor. Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRG) iyonizan radyasyon bağımsız ve üstün bir görüntü çözünürlüğü ve içsel yumuşak doku kontrast sağlar. MR-esaslı hücre izleme zaten melanom hastalarında ² dendritik hücreler takip klinik olarak kullanılmıştır. Klasik klinik MRI dokularda mobil su içinde mevcut olan ¹ H çekirdeği üzerinde gerçekleştirilir. Bu, örneğin ¹³ ° C, ^{19 23,} F ve Na gibi diğer aktif çekirdekler, MRG gerçekleştirmek de mümkündür. Ancak, yalnızca ¹⁹ F MRI o ¹ H. sonra en yüksek hassasiyeti sunuyor in vivo hücre izleme başarıyla uygulandı Dokularda tespit endojen ^MR-19 F olmaması için yüksek sinyal seçiciliğe izin verireksojen ¹⁹ F kontrast maddelerin tespiti ve olanak görüntü verileri doğrudan flor konsantrasyon ölçümü. ¹⁹ F MR ayrıntılı bir tartışma için, ^3-5 bakın. ¹⁹ F MR ile önemli bir sorun birkaç etiketler modelli ajanları ⁶ yönünde bir eğilim ile, geliştirilmiş olmasına rağmen, uygun ¹⁹ F hücre etiketleri geliştirmek ve optimize etmek için ihtiyaçtır.

Biz burada açıklamak protokol ^10,11 izleme vivo niceliksel ¹⁹ F MR tabanlı hücre açıklanan ilk makalelerinde dahil olmak üzere grupları ^7-9, tarafından yapılan çalışmalara dayanmaktadır. ¹⁹ F MRI kullanılarak hücre izleme genel prosedür, Şekil 1 'de özetlenmiştir. Biz ısmarlama bir perflüorokarbon kontrast madde ⁸ kullanarak dendritik hücreler (DC) etiketleme ve görüntüleme için genel bir protokol açıklar. Görüntüleme protokol hücre tipleri, etiketler ve başka hayvan modelleri genel olarak uygulanabilir.Burada anlatılan hücre tipi ve hayvan modeli sadece bir örnek olarak alınmalı ve böylece hücre izolasyonu ve etiketleme ile ilgili ayrıntıları değil, görüntüleme protokolü odaklanmak değil. Değişiklikler, her etiket, hücre tipi, hayvan modeli ve görüntüleme kurulumu için gerekli olacaktır ve bu literatürde bulunabilir veya araştırmacılar tarafından optimize edilmesi gerekebilir. Bazı yaygın modifikasyonlar tartışma dahildir.

Protocol

Not: hayvanları içeren tüm deneyler ve işlemler, ilgili etik kurallara uygun olarak yürütülen ve standart hayvan bakımı ve insani gereklilikleri ile uyumlu olmalıdır.

1.. Hücre Etiketleme (Coincubation Standart Protokolü)

1. (2 ml ortam içinde) 4 mg/10 ⁶ hücre konsantrasyonunda olgunlaşmamış DC'lerin ¹⁹ F etiket ⁸ ekleyin. Karıştırmak için hafifçe karıştırılır.
2. DH'lerin olgunlaşma ve hasat için 3 gün önce etiketli hücreleri inkübe.
3. DH'lerin toplayın ve PBS yıkama en az 3'lü tarafından aşırı etiketi çıkarın. Hücreleri saymak.
4. Enjeksiyon ya da daha fazla test için PBS küçük bir hacmi içinde yeniden süspanse edin.

Not: Bu protokol, bu özel DClerin ve etiket için geçerlidir. Bu protokolün odak görüntüleme üzerinde olduğundan prosedür, başka bir yayın ⁸ optimize edilmiş ve dahil burada görüntü için bir numune hazırlamak için sadece adım oldu. Hence, izolasyon, kültür ve belirli bir hücre tipi etiketleme için protokol literatürde bulunan veya araştırmacı tarafından optimize edilmesi gerekir ya. Literatürde kullanılmış olan diğer tüm ^19F etiketlerin bir özeti başka ⁶ sunulmuştur.

2. ^19F NMR kullanarak ¹⁹ F / hücre tayini

1. Bir NMR tüpü içinde etiketlenmiş hücre bilinen bir dizi (tipik olarak en fazla 0.5 x 10 ^6, ya da yeterli sinyali ile sonuçlanan bir dizi) koyun.
2. % 5 trifloroasetik asit (TFA) 10 ul ekle. TFA rezonans frekansı etiket ile üst üste nedeniyle uygun değilse, tercihen tek bir ¹⁹ K rezonans ile, alternatif bir çözünür bir bileşik kullanımı.
3. Bir NMR spektrometresinde örnek yerleştirin ve ¹⁹ F spektrumu elde. Bant genişliği TFA (referans) ve ajanın her ikisi için yeterli olduğundan emin olun.

Not: TR f için yeterince uzun olmalıdırull referans gevşeme ve örnek spin (tüp en uzun T ₁ bileşenin yaklaşık 5 kat T ₁ gevşeme süresi genellikle TR ~ 5-8 saniye). Bazı spektrometre bir frekans kilit sinyali için D ₂ O gerektirir. Standart bir ¹⁹ F spektrum yeterlidir. Hücre sayıları düşük ise etiketin hücre alımı yetersiz ise veya geniş ortalama veya yüksek hücre sayıları gerekli olacaktır. Düzeltmeler kısmi uyarma için hesap yapılmadıkça spektrumu, referans ve ilgili etiket zirveleri arasında merkezli olmalıdır.

4. Referans ve numune (ya da numune ana tepe noktası) tepe değeri altında bu alanlara göreli hesaplayın ve daha sonra numune ¹⁹ F'nin / hücre ortalama sayısını hesaplamak.

Not: Tüm işlem tekrarlandı ve istatistiksel anlamlılık ulaşmak için yeterli yoğun ortalama gerekir. Bu, MRI tarayıcı doğrudan spektroskopisi kullanılarak da yapılabilir. However, bu prosedür, hücrelerin geniş bir sayısı değil, hücreler arasındaki değişkenlik için yalnızca ortalama ¹⁹ F yükleme ortaya unutmayın. Hücre alımının kontrol edilmesi tekdüzelik ¹⁹ F maddenin bir floresan bileşeninin varlığını gerektirir, bu nedenle bu hücre alımı mikroskobu kullanarak ya da akış sitometrisi analiz edilebilir.

3. Hücre Enjeksiyonu - Deneysel Tasarım Hususlar

Nedeniyle hücre takibi, hücreler, çok sayıda lokalize olacak bir hayvan modelinde boyunca ¹⁹ F MR nispeten zayıf hassasiyet vivo görüntüleme başarılı için gereklidir. Tipik duyarlılık değerleri 10 ^{11 13} -10 flor atomu aralığında bir hücre yükleme ile, 1,000-100,000 cells/voxel/1 saat ikinci tarama süresini ⁶ arasında değişir.

Bu anestezik seçimi etkiler gibi görüntüleme oturumları sayısı ve sıklığı dikkatle planlanmış olmalıdır. Isofloranın suitabl olmayabilir Not¹⁹ F MR için e izofluran ¹⁹ F rezonans frekansı kullanılan etiket bileşiğin buna yakın ise. görüntüleme oturumları önemli birikmesini önlemek için yeterince kısa ise izofluran hala uygun olabilir. Birçok alternatif anestezik literatürde ^10,11 kullanılmaktadır, bir örnek görüntüleme protokolü dahildir. Anestezikler farklı fare suşları ve hastalık modelleri için optimize edilmesi gerekebilir.

4. Harici ¹⁹ F Referans tasarım

1. ¹² ölçümü için ¹⁹ F sinyalinin bilinen bir miktarını içeren bir dış başvuru kullanın. Konuyla beklenen kabaca karşılaştırılabilir olması için referans sinyal yoğunluğunu seçin.

Not: referans bileşiği gevşeme parametreleri maç için, hücre etiket olarak aynı ise Genel olarak, basit,. Uzamsal lokalizasyonu olmayan spektroskopik sekansları veya dizilerinin kullanıldığı takdirde, o zaman acompound farklı kimyasal kayma ile gerekli olabilir.

2. Faiz (ROI) bölgeye bağımlı gerekli yerleştirme, boyut ve başvuru şekli, değiştirin. Not: Bu başvuru için üniform kesitli tüpler genellikle kullanımı kolay değildir.

5. Görüntüleme ve Fare Hazırlık

1. 10 mg / ml ketamin stok solüsyonları ve 2 mg / ml ksilazin elde etmek üzere fizyolojik tuzlu su ile ticari olarak temin edilebilir ketamin ve ksilazin 1:10 v / v seyreltin.
2. Fare görüntülü önce delik sıcak olacak sağlamak için tarayıcı (genellikle sıcak hava) ısıtma sistemi açın.
3. 100 mg / kg ketamin enjekte edilir ve 10 mg / kg xylazine intraperitoneal anestezi başlatmak için. Not: Bu dozlar CD1 (ICR) ve NU-Foxn1 ^nu 8 haftalık erkek fareler için test edilmiştir. Diğer suşlar ayrı deneyde optimize edilmelidir biraz farklı dozlar gerekebilir. Bu doz için anestezi fare tutacakmaçın 45 dk. Not: Hayvan bir ayak tutam herhangi bir tepki gösterirse anestezi derinliği normal olarak yeterlidir.
4. Anestezi sonra, bir hayvan beşiği hayvan koyun ve MRI sırasında hareket etmesini önlemek için hareketsiz. Gerekirse, yanındaki hayvana dış başvuru yerleştirin. Referans ile ROI (enjekte edilen hücrelerin beklenen konumu) Her iki bobinin merkezinde olmalıdır. Hayvan tarama sırasında fizyolojik izlenmesi için sıcaklık ve nefes kontrol bağlı olmalıdır.
5. Uzun görüntüleme oturumları sırasında kurumasını önlemek için steril göz merhemi ile fare gözlerini örtün.
6. Görüntüleme süresi 40 dakika geçerse hayvan uyanabilir önce ek ketamin / ksilizin enjeksiyon için ek kateterler hazırlamak. Ketamin ve ksilizin çalışma çözümleri ile pozisyon iki ayrı cilt altı kateter. Fareye ilk 40 dakika sonra, ketamin ek 2.5 mg, her 20 dakika vermek için bu kateter. Eğer gerekirse, bundan başka, ilk enjeksiyondan sonra, kateter yoluyla ek 0.5 mg ksilazin enjeksiyonu ile 100 dakika anestezi uzatır. Her durumda, deney süresi muhtemelen terminali anestezi altında 3 saat dışında, geçmemelidir.
7. Fare, ilk enjeksiyondan hemen sonra ısıtılmış ve 37 ° C vücut sıcaklığında muhafaza olduğundan emin olun. Bu protokol ile, <% 80, kan oksijenlenme atmosfer havası nefes altında tespit edildi. , Indirdi kan oksijenlenme yan etkileri önlemek% 100 oksijen (0.3 L / dk) kullanın. Vücut sıcaklığı ve nefes bütün deney boyunca ve hayvanın tam iyileşme kadar kontrol edilmelidir. Ketamin / xylazine altında spontan solunum oranı (200-250/min) çok yüksek olduğunu unutmayın. Solunum model yerine, solunum oranı düzensizlikler, daha yüksek bir doz, uygun bir anestezi durumunu korumak için gerekli olduğunu gösterebilir. Fare nere 20-30 dakika içinde kendiliğinden uyanacakr anestezik son dozu.

Not: Hücre takibi için, birden fazla aynı hayvan görüntü için gereklidir. Bu durumda, görüntüleme oturumları enstitü sistemi ve hayvan kullanımı kılavuzlardan anestezi temizlenmesi için gerekli süre dikkate alınarak planlanmalıdır.

6. Görüntüleme

^1H ayarlamaları ve görüntüleme

1. ROI farklı dilim yönelimleri ile düşük çözünürlüklü, anatomik tarama (a yerelleştirici) kullanarak İzomerkez olduğunu böylece tarayıcı içinde hayvan yerleştirin.
2. Örneğin bobin içindeki bütün hacmi üzerinde küresel altlıkla ¹ H üzerinde düzenli layneri protokolünü kullanın.
3. Satıcı tarafından sağlanan ayar tarama kullanarak, Hermite 90 ° RF pulse 1 msn için dB olarak ölçülen verici gücü, yani referans darbe kazanç (RG), ayarlayın.

Not: Bu ayar olacakRF bobin türüne göre değişir ve ¹⁹ F frekansta sinyal doğrudan ayarlamalar için genellikle çok düşük olduğu için ¹⁹ F MRI için gereklidir. Bunun bir sonucu olarak, RG bir tahmin ^1H sinyali üzerinde ölçümler yapılmalıdır. Bir yüzey bobin ile RF iletim için, ¹ H RG homojen B ₁ profili ile bir hacim bobin için, faiz kısmından bobinine bir düzleme paralel ayarlanabilir olmalıdır, ayarı tam ayarları daha az önemlidir.

4. ^1H ve ^19F RF iletim her ikisi de aynı (tek veya çift-ayarlı) RF bobini ile gerçekleştirilir sadece ^19F referans nabız kazanç ayarlaması aşağıdaki protokol çalışır. Böyle bir görüntüleme kurulum için, ¹ H üzerinde bobin profil (B ₁ iletim alanı) sabit RG uygulanan ¹⁹ F bobin profili, orantılı olmalıdır, yani B _{1,1 H} = C * B _{1,19 F} bir pervane ileortionality sabit C.
   1. Bu bobin profilleri belirli bir kurulum için orantılıdır onaylamak için, ¹ H ve ¹⁹ F fiske açısı haritayı kazanmak derece (1:1 v suda ¹⁹ F, örneğin TFA konsantre olan bir tüp (B ₁ düzeltme üzerine aşağıdaki bölüme bakınız) / v) (Şekil 3) önceden,) özdeş alanlar-view (FOVs kullanarak.
   2. Aynı RG kullanarak, her iki haritanın küresel faktörü C haricinde aynıdır kontrol
   3. ¹ H RG belirlendikten sonra, bu numarayı not.
5. Yürütmek geleneksel ^1H MR ¹⁹ F görüntüleme için bir anatomik referans olarak tarayın. Hücre marker ¹⁹ F frekans ayar sistemi ve ¹⁹ F MR tarama yürütmek. İdeal ¹⁹ F MRI taraması olacaktır aynı alan-görünümü ve ^1H MR gibi dilim seçimi, genellikle daha düşük çözünürlüğe sahip olmasına rağmen. Hayvan kısa sürede IMAGI olarak canlandırıldı edilebilirng tamamlandı. Görüntü işleme sonra çevrimdışı yapılabilir.
6. Ilgili dB _19F = dB _1H yoluyla ¹⁹ F RG belirlemek -20 * ₁₀ (C) log. Ayrı bir in vitro deneyde ¹⁹ F madde frekans tahmin.

Not: in vivo, tam frekans farklı layneri koşulları nedeniyle deneme deney biraz değişebilir. Mümkünse tam frekans nedenle, ¹⁹ F MRS her deneyde tespit edilmelidir kimyasal kayma eserler önlemek için. Çok düşük ¹⁹ F sinyali için tipik bir tarama küresel (darbe edinin) spektroskopisi (TR = 200 msn, NEX = 3,000, TA = 10 dk, BW = 50 kHz) olacaktır. NEX, bu nedenle TA, önemli ölçüde yüksek ^19F sinyali için azaltılabilir. ¹⁹ F madde frekans Fourier dönüşümü ve faz düzeltme sonra spektrumundan belirlenir. NEX uyarılmalar sayısını ifade eder, TA elde etme zamanı ve BW olduğubant genişliği.

Not: Bir 11.7T/16 cm adanmış hayvan tarayıcıya Tipik görüntüleme parametreleri ⁹ şunlardır: Bir anatomik ^1H görüntüleme bir turbo spin eko (TSE) dizi TR / etkili eko zamanı (TE _eff) ile kullanarak tarama = 2.200 msec/42.8 msn, uyarma başına 8 yankıları, NEX = 2, 10 ardışık, 1 mm kalınlığında dilimler, FOV = 1.92 x 1.92 cm ^2, 128 x 128 matris, yani 150 x 150 x 1.000 mikron ^3, TA = 1 dak, BW = 50 çözünürlük kHz ve doğrusal bir faz kodlama düzeni. ^19. F görüntüler aynı sırayla ve uygun geometri ile elde, ancak edildi alt düzlem çözünürlük ve düşük BW (NEX = 256, 48 x 48 matris, yani 400 x 400 x 1000 çözünürlüğe um ^3, TA = 57 dakika, BW = 10 kHz).

7. B ₁ düzeltme
   Sinyal bağlıdır çünkü homojen olmayan B ₁ profili, örneğin bir yüzey bobini ile RF bobini kullanılarak, ¹⁹ F veri miktarının engel olabilirsadece ¹⁹ F konsantrasyonuna hem de bobinden mesafe. Retrospektif doğru ¹⁹ F veri amacıyla ^1H kanalda B ₁ harita edinin. Bu, ^1H ve ^19F bobin profilleri orantılılık faktörü C haricinde aynı olduğu gerektirir ve yeterli ^1H arka plan sinyali ¹⁹ F bölgelerde sağlanmaktadır ¹⁹ F spin eko dizisinin düzeltilmesi için bir örnek protokol ¹ H ve ¹⁹ F hem de bir tek ayarlı Tx / Rx yüzey bobin ayarlanabilir kullanarak, sunulan ve oransal B ₁ profil ¹³ ile almaktadır.
   1. Iki fiske açısı yöntemi ¹⁴ ile ^1H çevirme açısı haritası edinin. Hemen altında 90 ° 'lik bir tahmini çevirme açısına sahip bir degrade yankı tarama ile çok uzun TR (> 3 kez ¹ HT ₁₎ edinin. Bobinine kapatın. Bir RG ile ikinci bir gradyan eko taraması Edinme = dB _1H -6, yani iki kez kapakİlk tarama açısı.
   2. ^1H çevirme açısı hesaplayın, α, vokselin birinci ve ikinci gradiyent eko taramasından sinyal yoğunluklarının (SI) ile (x, y, z): α (x, y, z) = arcos (SI _{GE (1,} x, y, z) / _{GE 2Si, 2} (x, y, z)) ^{14. 19} F fiske açısı nedeniyle oransal B ₁ profiller için (faktör 1 / C hariç) aynıdır. Karşılıklılık ^15, sinyal alımı sırasında spin eko sekansı (uyarma çevirme açısı α, sapma açısı 2α refocusing) ¹⁹ F sinyal yoğunluğu zayıflama Faraday ilkesine göre _Rx (x, y, z) ~ α (x, y att olduğunu , z). Nedeniyle kusurlu uyarım zayıflama _Tx (x, y, z) ~ ³ sin (α (x, y, z)) ¹⁶ bir att. Genel zayıflama att = attRx * attTx = α * günah ³ (α) / 90 ° olarak yazılır. Mükemmel 90 ° / 180 ° uyarma / odaklanma çevirmek açısı durumunda 1'e normalize olduğunu unutmayın. B ₁ düzeltilmiş19 F görüntü sinyal yoğunlukları SI _{19F, 19F corr SI, corr} (x, y, z) = SI _19F (x, y, z) / att (x, y, z) üzerinden hesaplanmaktadır.
   3. Farklı deneylerden elde edilen sinyal yoğunluklarını karşılaştırmak görüş alanında tanımlanan F ¹⁹ konsantrasyonuna sahip bir referans tüpü yerleştirin ve referans ortalama sinyali SI _{19F, corr} normalleştirmek için.

Not: Diğer ¹ HB ₁ / flip açısı, haritalama yöntemleri kullanılabilir ve farklı ¹⁹ F darbe dizileri _{Tx, 19F} att değişiklikler yapmak da gerekebilir. B1 düzeltme düzeni her türlü hücre miktar prosedüre ek hata tanıtacak. Doğru hücre miktar ana öncül ise, homojen B1 profili olan bir RF bobin protokol bu bölümü aşmak için kullanılabilir.

7. Görüntü İşleme

1. ¹ H ve ¹⁹ F bindirme görüntüleri Yapımı
   1. Resim verilerinison ¹ H ve tarayıcıdan ¹⁹ F büyüklüğü görüntüler için.
   2. Böyle ImageJ (ücretsiz, NIH) gibi bir görüntü işleme programında dosyaları açın.
   3. Tüm görüntüler için aynı ayarlamaları tutarak gerekli (kırpma, parlaklık, kontrast) gibi görüntü ayarlamaları yapınız. ¹⁹ F görüntüler genellikle karşılık gelen ¹ H görüntüleri maç için daha yüksek bir çözünürlüğe yükseltilmiş olması gerekir.
   4. (Görüntü J "görüntü" menüsü altında, farklı bir görünüm tablosunu seçin) ve ardından sinyal lokalize amacıyla gelen ¹ H görüntülerin üzerine bindirmek yanlış renkte ¹⁹ F görüntüleri Render.
2. ¹⁹ F Kantitasyonu
   1. Ilgili hücreler ve görünür referans ile ¹⁹ F görüntüsü (büyüklüğü görüntü) seçin.
   2. Gibi Image J gibi bir programda, ilgili hücreler, konu (gürültü) dışında referans ve bir bölge üzerinde İB'leri çizin.
   3. Komut analiz kullanınve sonra ölçün (veya basitçe Ctrl + M) bu bölgeler içinde ortalama piksel yoğunluğunu hesaplamak ve bunların alan. S (hücreler) hücrelerin üzerine ROI içindeki ortalama piksel yoğunluğunun bakınız olsun. Toplam sinyalini hesaplamak için hacim (= alan x dilim kalınlığı) ile çarpın.
   4. SNR hesaplayın, formül SNR kullanarak, örneğin = 0.65 x S (hücre) / σ, burada σ (tipik olarak arka havada) herhangi bir kimyasal kayma dışlayıcı serbest olan örnek bir dış ROI içinde piksel yoğunluğunun standart sapmasıdır ^17. SNR 5 altında ise, gürültü nedeniyle sinyal için bir düzeltme gerekli olabilir ve başka bir yerde ^{11, 10} tarif edildiği gibi gerçekleştirilebilir.
   5. Aksi takdirde, referans ¹⁹ F konsantrasyonuna göre dilim kalınlığında (hacmi hesaplamak için) ile dilim referans alanı ile çarpılarak, referansa kıyasla ROI sinyal sorumlu ¹⁹ F toplam miktarının hesaplanması,bilinen ve homojen olduğu kabul edilmektedir.
   6. Hücrelerin ¹⁹ F miktarını hesaplamak için, referansa kıyasla toplam sinyali ile bölünmesiyle hücreleri üzerinde ROI toplam sinyali, bu değeri çarpın.
   7. Bölüm 2'de hesaplanmıştır ¹⁹ F / hücre değeri tarafından bu sayı bölünerek hücre sayısını hesaplayın.

Representative Results

Burada bir lenf düğümüne güdümlü ^{19F-işaretli} hücrelerin transferini içeren bir protokol için tipik sonuçları gösterir. Şekil 2, bir TFA referans kullanarak 10 ⁶ etiketli hücre ^19F NMR spektrumunu göstermektedir. Protokolü (Şekil 3) 'de tarif edildiği gibi görüntü ayar gerçekleştirilmiştir. In vivo görüntüleme için, fare ayakları arasına yerleştirilen hücreler için kullanılan aynı etiketin sızdırmaz şekilde kapalı bir silindir içeren bir referans olarak kullanılmıştır. Temsili bir işlenen görüntü, Şekil 4 'de gösterilmiştir. Bölüm 7.2 açıklanan protokol uygulayarak, biz yaklaşık bir hücre sayısı hesaplandı. 1,2 x 10 ⁶ ham ¹⁹ F büyüklüğünde görüntü dayalı.

Şekil 1. ¹⁹ F MR-bazlı hücre takibi için önemli adımlar. in vivo verileri doğrulamak için gerçekleştirilebilir. Şekil izni ⁶ çoğaltılamaz. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2. Örnek ^19F NMR spektrumu. Spektrumu elde edilen ¹⁹ F sinyalini göstermektedirnedeniyle bu durumda TFA içinde referans bilinen miktarı, ve "örnek" olarak etiketlenmiş hücrelerin bilinen sayısı için. Bu MR görüntü verilerinden in vivo ölçümü için gerekli olan hücre başına flor miktarını hesaplamak için kullanılabilir.

Şekil 3,. Su içinde TFA ile boruların Kapak açısı haritaları ¹ H ve ¹⁹ F kanalda elde edildi. Orantı faktörü, bu kurulum için 1.03 ± 0.08 olduğu hesaplandı. FA: açısı çevirin.

Şekil 4. In vivo ^1H / ¹⁹ bir lenf düğümü güdümlü dendritik hücrelerin F görüntü. Şekil ¹⁹ F sinyali görünür olan, bir fare temsili bir görüntüsünü gösterir,yanlış renk, referans (R) ve işaretlenmiş hücreleri. Fare sadece ayakları burada görüntülendi. Bu örnekte, enjekte edilen işaretli hücrelerin lenf düğümü göç etmiştir. Görüntüleme parametreleri ana metin özetlenmiştir. Şekil örnek amaçlıdır.

Discussion

Burada belirtilen protokol in vivo ^19F MRI hücre takibi için genel prosedür açıklanmaktadır. Tarif edilen birlikte kuluçka yöntemi rağmen, ^19F madde ile hücrelerin etiketlenmesi için çeşitli protokoller mevcuttur. Bununla birlikte, ko-inkubasyon en sık kullanılan ve daha fazla transfeksiyon ajanları ⁶ ilavesiyle, örneğin optimize edilebilir. Gerçek hücre etiketleme protokol, hücre tipine bağlı olacaktır. Sadece anahtar etiketleme adımları burada protokolde tarif edilmektedir. Genel olarak, etiket, bir kaç saatten bir kaç güne kadar değişen seçilmiş bir süre için hazırlanmış ve hücrelere eklenir. Son olarak, hücreler, görüntü verilerinden miktar ³ yürütülecektir, özellikle de herhangi bir etiket fazlasının ayrılması için dikkatli bir şekilde yıkanmalıdır. ¹⁹ F madde, bir floresan etiket, dış (veya bağlı) Etiketin varlığı içeriyorsa hücreler mikroskopi kullanılarak tespit edilebilir. Etiketlemeden sonra, bu hücre çalışma için gerekli olan(tripan mavi dışlama deneyi ile) nonlabeled hücrelere ilişkin olarak canlılığı ve işlevsellik. Bu tür DC'lerin durumunda T hücrelerini aktive etmek gibi, hücre-özel işlevler testler de gerçekleştirilmelidir. Bir ^non-19 F MRI etiket hücre göçü ¹⁸ üzerinde bir etkiye sahip olarak, son olarak, bu testler aynı zamanda, özellikle yüksek hücre yükleme ile ¹⁹ F etiket için, dahil edilmelidir.

Hayvan modeli için protokol, aynı zamanda, kullanıcının ihtiyaçlarına bağlıdır. Ancak, bu deneyler planlarken ¹⁹ F MRG sıkı duyarlılık sınırlarını hatırlamak önemlidir. Yayın duyarlılık değerleri 10 ^{11 13 19} -10 F aralığında bir hücre yükleme ile, 1,000-00,000 cells/voxel/1 saat süre ⁶ arasında değişir Ilgilenilen bölgesinde duyarlılık ve beklenen etiket konsantrasyonu da görüntüleme parametreleri etkileyebilir. Örneğin, ^19F görüntü için kullanılan kesit kalınlığı i edilebilir usted ^1H görüntüleri ile aynı ya da (örneğin, tüm lenf düğümü veya tek bir dilim ilgi bölgesi), bir daha kalın bir alanı kapsayacak şekilde. Tipik olarak, ¹⁹ F görüntüleme yüksek çözünürlüklü genellikle lenf düğümleri gibi yapıları ayırt etmek için gerekli değildir, özellikle de, sinyal algılama maksimize etmek için daha düşük bir çözünürlükte gerçekleştirilir. Sinyal yeterli ise, ince dilimlerin bir daha fazla sayıda alınan ve bu hesaplanan ilgilenilen hacmi üzerinden toplam bir sinyal olabilir. Bununla birlikte, en iyi parametreleri, her bir uygulama için elde edilmesi gerekir.

Biz ketamin / ksilizin izofluran gibi florlu inhalasyon gazlar kaçınarak bir enjeksiyon anestezi protokol açıklar. Diğer protokoller literatürde ^10,11 kullanılmıştır. Bununla birlikte, tüm durumlarda, bu protokoller fare soyu, yaş, cinsiyet, sağlık ve görüntüleme oturumları uzunluğu ve frekans için ayarlanması gerekir.

"ontent> Çeşitli ^19F MRI görüntüleme sekansları ^{6 ya} bakınız inceleme için, hücre takibi için kullanılmaktadır. Bizim görüntüleme protokol hali hazırda başka bir görüntüleme dizileri içerecek şekilde modifiye edilebilir. Bununla birlikte, burada açıklanan yöntem miktar dikkate herhangi bir kısmi hacim almaz etkileri, İB'nin seçiminde farklılıklar, in vivo olarak etiketin gevşeme parametreleri değişiklikler veya hücresel ^19F yükleme değişir. bu sorunlar başka ³ açıklanmaktadır. Kısaca, hata uzunlamasına hücre takibi için kabul edilebilir limitler içinde olduğu bulunmuştur ^10. önceki bu eserlerin karşılaştırıldığında biz ayrıca B1 alanı haritalama yüzey RF bobinleri kullanmak için bir resim düzeltme düzeni öneriyoruz. özel RF bobin kurulum bağlı olarak, olmuştur B1 haritalama teknikleri sınırlamaları, farkında olmak önemlidir . Örneğin, burada B1 sunulan çift açılı yöntemi için ¹ H MR ¹⁶ bağlamında iyi çalışılmışharita sadece 90 ° -180 ° ¹⁴ altında ve önemli hata diğer bölgelerde sokulabilir fiske açısı çiftleri için en doğrusudur. Yine in vitro uygun doğrulama sonra, böyle geriye dönük düzeltme daha fazla hücre kantifikasyonunu artırabilir. Genel olarak, biz, en azından başlangıçta, daha kurulmuş teknikleri ile verilerin doğrulanmasını tavsiye. Bu, tipik olarak, büyük hataları dahil etmek için diğer in vivo görüntüleme teknikleri, örneğin optik görüntüleme ile kombinasyon halinde yapılır. Çoğu durumda, histolojik değerlendirme tam ¹⁹ F etiket konumunu değerlendirmek ve görüntüleme verileri ile korelasyonu sağlamak için gereklidir. Bu, F ¹⁹ maddesi için bir floresan boya eklenmesini gerektirebilir.

¹⁹ F MRI henüz klinik hücre takibi uygulanmış olmasına karşın, son olarak, insan kullanımı için bu protokolü değiştirmek mümkün olacaktır. Gerekli temel değişiklikler Çin mutfağı kadar çok yürütmek olacaktır-laşma ve önceden mümkün kurulumu (konu tarayıcı olan süreyi en aza indirmek için), ve klinik özgül soğurma oranı (SAR) kısıtlamalar içinde tutmak için görüntüleme parametrelerini ayarlamak için.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
PBS	Sigma-Aldrich	MFCD00131855
TFA	Sigma-Aldrich	76-05-1
Ketamine (Ketavet)	Pfizer	778-551
Xylazine (Rompun)	Bayer	QN05 cm92
Ophtosan	Produlab Pharma	2702	eye ointment
Material name
MRI scanner	Bruker Biospec
NMR spectrometer	Bruker Biospec