בF-MRI ¹⁹ vivo למעקב סלולרי

Summary

אנו מתארים פרוטוקול כללי לin vivo מעקב תא באמצעות MRI במודל של עכברים עם תאי שכותרתו לשעבר vivo. פרוטוקול טיפוסי לתיוג תא, עיבוד רכישת תמונה וכימות כלול.

Abstract

In vivo ¹⁹ F-MRI מאפשר מעקב תא כמותית ללא השימוש בקרינה מייננת. זוהי טכניקה לא פולשנית שיכול להיות מיושמת על בני אדם. כאן אנו מתארים פרוטוקול כללי לתיוג תא, הדמיה, ועיבוד תמונה. הטכניקה היא ישימה לסוגים שונים של תאים ומודלים של בעלי חיים, למרות שכאן אנחנו מתמקדים במודל של עכברים אופייני למעקב אחר תאי חיסון עכבריים. הנושאים החשובים ביותר לתיוג תא מתוארים, שהינם רלוונטיים לכל הדגמים. כמו כן, פרמטרים הדמיה מפתח מפורטים, אם כי הפרטים משתנים בהתאם למערכת ה-MRI וההתקנה בודדת. לבסוף, אנו כוללים פרוטוקול עיבוד תמונה לכימות. וריאציות לזה, ובחלקים אחרים של הפרוטוקול, נבחנים בסעיף הדיון. בהתבסס על הנוהל מפורט שתואר כאן, המשתמש יצטרך להתאים את הפרוטוקול לכל אחד מסוגי תאים מסוימים, תווית תא, מודל חיה, והתקנת הדמיה. שימו לב כי protocol גם יכול להיות מותאם לשימוש בבני אדם, כל עוד הגבלות קליניות הם נפגשו.

Introduction

במעקב תא vivo הוא חיוני לאופטימיזציה והניטור של תרופות תאיות ^1. בשל האופי פולשני שלה, הדמיה מציעה הזדמנויות מצוינות כדי לפקח על תאים בגוף חי. הדמיית תהודה מגנטית (MRI) אינה תלויה בקרינה מייננת ומאפשרת הדמיה ברזולוציה מעולה ולעומת זאת רקמות רכות פנימיות. מעקב סלולרי המבוסס על MRI כבר בשימוש קליני לעקוב תאי דנדריטים בחולים מלנומה ^2. MRI הקליני הקונבנציונלי מתבצע בגרעין H ^1, הנמצא במים ניידים ברקמות. כמו כן ניתן לבצע בדיקת MRI על גרעינים פעילים אחרים, כגון ¹³ C, נ ^{19 ו23} Na. עם זאת, רק ¹⁹ F-MRI כבר מיושם בהצלחה בvivo מעקב תא כפי שהוא מציע את הרגישות הגבוהה ביותר, לאחר ה ^'1 העדר בדיקת MRI לגילוי אנדוגני נ ¹⁹ ברקמות מאפשר סלקטיביות אות גבוהה עבורזיהוי של סוכנים בניגוד ¹⁹ F אקסוגניים ומאפשר כימות של ריכוז פלואור ישירות מנתוני התמונה. לדיון מפורט ^ביום 19 F-MRI, ראה ^3-5. נושא מרכזי עם ¹⁹ F-MRI הוא הצורך לפתח ולייעל את תוויות תא ¹⁹ F מתאימים, אם כי כמה תוויות פותחו, עם מגמה של סוכני multimodal ^6.

הפרוטוקול שאנו מתארים כאן מבוסס על מחקרים על ידי הקבוצות שלנו ^7-9, כולל המאמרים הראשונים שתיארו בvivo כמותיים ¹⁹ סלולריים מבוסס MRI F מעקב ^10,11. הנוהל הכללי של מעקב סלולרי באמצעות ¹⁹ F-MRI מסוכם באיור 1. אנו מתארים פרוטוקול כללי לתיוג והדמיה של תאים דנדריטים (DC) באמצעות סוכן לעומת perfluorocarbon מחוייט ^8. פרוטוקול ההדמיה הוא בדרך כלל ישים לסוגי תאים שונים, מדבקות ומודלים של בעלי חיים.מודל סוג התא ושל בעלי החיים שתואר כאן יש לקחת רק כדוגמא, ובכך אנחנו לא מספקים פרטים על בידוד התא ותיוג, אלא להתמקד בפרוטוקול ההדמיה. שינויים יהיו הכרחיים עבור כל תווית, סוג התא, מודל חיה, והתקנת הדמיה, וניתן למצוא את אלה בספרות או שצריכים להיות מותאם על ידי החוקרים. כמה שינויים נפוצים כלולים בדיון.

Protocol

הערה: כל הניסויים וההליכים כרוכים בבעלי חיים חייבים להתבצע בהתאם לקווים מנחים אתיים רלוונטיים ובקנה אחד עם טיפול בבעלי חיים סטנדרטי ודרישות הומניות.

1. תיוג תא (תקן לפרוטוקול עם Coincubation)

1. הוספת ¹⁹ תווית F ⁸ לDCs בשלה בריכוז של 4 mg/10 ⁶ תאים (ב2 בינוני מיליליטר). מערבולת בעדינות לתערובת.
2. דגירה התאים עם התווית במשך 3 ימים לפני התבגרות וקציר DCS.
3. לאסוף DCs ולהסיר תווית עודפת על ידי שטיפה לפחות 3x ב PBS. ספירת התאים.
4. Resuspend בנפח קטן של PBS להזרקה או בדיקות נוספות.

הערה: פרוטוקול זה הוא רלוונטי לDCs הספציפי אלה והתווית. ההליך היה מותאם בפרסום אחר ⁸ וכלול כאן הם רק צעדים כדי להכין את מדגם לתמונה, שכן ההתמקדות של פרוטוקול זה היא בהדמיה. Hence, הפרוטוקול לבידוד, תרבות וסימון של סוג תא מסוים יצטרך גם ניתן למצוא בספרות או מותאם על ידי החוקר. סיכום של כל ¹⁹ תוויות F האחרות שהייתה בשימוש בספרות מוצג במקום אחר ^6.

2. קביעת ¹⁹ F / תא באמצעות ¹⁹ F NMR

1. הנח מספר ידוע של תאים שכותרתו (בדרך כלל יותר מ 0.5 x 10 ^6, או מספר, כי תוצאות באות חזקה מספיק) בצינור NMR.
2. הוסף 10 μl של 5% חומצת trifluoroacetic (TFA). אם תדר התהודה של TFA אינו מתאים בשל חפיפה עם התווית, השתמש מתחם מסיס חלופי, רצוי עם תהודה F ¹⁹ אחת.
3. הנח את הדוגמא בספקטרומטר תמ"ג ולקבל ספקטרום ¹⁹ F. ודא שרוחב הפס מספיק עבור שני TFA (ההפניה) והסוכן.

הערה: TR צריך להיות ארוך מספיק עבור fההרפיה ull של ההתייחסות ומדגם ספינים (בסביבות 5 פעמים זמן הרפיה ₁ T של הרכיב T ₁ הארוך ביותר בצינור, בדרך כלל TR ~ 5-8 שניות). ספקטרומטרים מסוימים דורשים D ₂ O לאות נעילת תדר. ספקטרום ¹⁹ F סטנדרטי הוא מספיק. מספרי מיצוע או תא גבוה יותר נרחבים יידרשו אם ספיגת תא של התווית היא עני או אם מספרי תא הם נמוכים. הספקטרום צריך להיות מרוכז בין ההתייחסות ופסגות תווית רלוונטיות, אלא אם תיקונים נעשים לחשבון עבור עירור חלקי.

4. לחשב את האזורים יחסית תחת הפסגות של ההתייחסות והמדגם (או השיא העיקרי של המדגם), ולאחר מכן לחשב את מספר / התא של נ ¹⁹ הממוצע במדגם.

הערה: כל התהליך חייב להיות חוזר ונשנה בממוצע בהרחבה מספיק כדי להגיע למובהקות סטטיסטיות. זה יכול להיעשות גם באמצעות ספקטרוסקופיית ישירות בסורק ה-MRI. However, יש לציין כי הליך זה חושף רק את טעינת ¹⁹ F הממוצעת למספר גדול של תאים, לא ההשתנות בין תאים. בדיקת אחידות של ספיגת תא דורשת את נוכחותו של מרכיב ניאון בסוכן F ^19, כך שספיגת התא ניתן לנתח באמצעות מיקרוסקופ או cytometry זרימה.

3. שיקולים לעיצוב ניסיוני - הזרקת תא

בשל העניים יחסית הרגישות של ¹⁹ F-MRI למעקב סלולרי, מודל של בעלי חיים שבו התאים יהיו למקם במספרים גדולים היא הכרחית להצלחה בתחום ההדמיה vivo. ערכי רגישות אופייניים נעים בין 1,000-100,000 שעה cells/voxel/1 זמן סריקת ^6, עם טעינה סלולרי בטווח של 10 ¹¹ -10 ¹³ אטומי פלואור.

המספר ותדירות מפגשי הדמיה חייב להיות מתוכננת בקפידה, שכן זה משפיע על הבחירה של חומר הרדמה. הערה isoflurane כי לא יכול להיות suitablדואר ^ל19 F-MRI אם תדר התהודה ¹⁹ F של isoflurane הוא קרוב לזה של מתחם התווית בשימוש. isoflurane עדיין עשוי להיות מתאים אם פגישות ההדמיה הן קצרות מספיק כדי למנוע הצטברות משמעותית. כמה הרדמה חלופית כבר בשימוש בספרות ^10,11; דוגמא כלולה בפרוטוקול ההדמיה. חומרי הרדמה הוא שצריכות להיות מותאמים לזנים שונים עכבר ומודלי מחלה.

4. עיצוב חיצוני ¹⁹ F Reference

1. השתמש בהפניה חיצונית המכילה כמות ידועה של ¹⁹ אות F לכימות ^12. בחר את עוצמת האות של ההתייחסות להיות דומה בערך לזה ציפה מהנושא.

הערה: באופן כללי, זה הפשוט ביותר אם מתחם ההתייחסות זהה לתווית התא, כדי להתאים את הפרמטרים ההרפיה. אם רצפים או רצפים ספקטרוסקופיות ללא לוקליזציה המרחבית משמשים, אז acompound עם היסט כימי שונה עשויים להיות נחוץ.

2. לשנות את המיקום, גודל וצורה של ההתייחסות כנדרש, תלוי באזור של העניין (ROI). הערה: זה בדרך כלל הקל ביותר לשימוש צינורות עם חתך אחיד להתייחסות.

5. הדמיה ועכבר הכנה

1. לדלל זמין מסחרי 1:10 V / V קטמין ו xylazine עם מי מלח פיסיולוגי להניב פתרונות מניות של 10 מ"ג קטמין / מיליליטר ו -2 מ"ג / מיליליטר xylazine.
2. הפעל את מערכת החימום בסורק (בדרך כלל אוויר חם), כדי להבטיח לשעמם יהיה חם לפני העכבר הוא הדמיה.
3. הזרק 100 מ"ג / קילוגרם קטמין ו10 מ"ג / קילוגרם xylazine intraperitoneal ליזום הרדמה. הערה: במינונים אלה נבדקו לCD1 (ICR) ^ונו נו Foxn1 עכברי זכרים בן 8 שבועות. זנים אחרים ייתכן שיהיו צורך במינונים שונים במקצת, שצריך להיות מותאם בניסוי נפרד. מינון זה יהיה לשמור את העכבר מורדםדקות התקף 45. הערה: עומק ההרדמה הוא בדרך כלל מספיק אם בעל החיים לא מראה שום תגובה לדחק רגל.
4. ברגע שהרדים, המקום חי בעריסת בעלי חיים ולשתק כדי למנוע תנועה במהלך בדיקת MRI. במידת הצורך, מקם את ההפניה החיצונית בסמוך לבעלי החיים. גם ההתייחסות ואת ההחזר על ההשקעה (מיקום צפוי של התאים המוזרקים) צריכה להיות במרכז הסליל. בעלי החיים צריכים להיות מחוברים לטמפרטורה ובקרת נשימה לניטור פיסיולוגי בזמן הסריקה.
5. כסה את העיניים של העכבר עם משחת עיני סטרילי כדי למנוע התייבשות במהלך פגישות הדמיה ארוכות.
6. אם זמן ההדמיה עולה 40 דקות, להכין צנתרים נוספים להזרקה של קטמין / xylazine נוסף לפני שבעל החיים עלולים להתעורר. שני צנתרים עמדה נפרדים תת עורי עם הפתרונות של קטמין ו xylazine עובדים. השתמש בצנתר זה כדי לתת את העכבר 2.5 מ"ג נוסף של קטמין כל 20 דקות לאחר דקות 40 הראשונות. במידת צורך, בהמשך להאריך את ההרדמה על ידי הזרקה של xylazine 0.5 מ"ג נוסף באמצעות קטטר, 100 דקות לאחר ההזרקה הראשונית. בכל המקרים, זמן ניסוי לא יעלה על 3 שעות, למעט אולי בהרדמה סופנית.
7. ודא שהעכבר חימם לאחר הזריקה הראשונה ישירות ומתוחזק על 37 טמפרטורת גוף מעלות צלזיוס. עם פרוטוקול זה, <80% חמצון דם התגלה מתחת לנשימת אוויר אטמוספרה. כדי למנוע תופעות לוואי של חמצון הדם הוריד, השתמש 100% חמצן (0.3 L / min). טמפרטורת גוף ונשימה צריכה להיות מבוקרת לאורך כל הניסוי ועד להחלמה מלאה של בעלי החיים. שים לב שקצב הנשימה הספונטני תחת קטמין / xylazine הוא גבוה מאוד (200-250/min). אי סדרים בדפוס הנשימה, ולא את קצב הנשימה, יכולים להעיד כי מינון גבוה יותר יש צורך לשמור על מצב מתאים של הרדמה. העכבר יתעורר באופן ספונטני בתוך 20-30 דקות after המנה האחרונה של חומר הרדמה.

הערה: למעקב סלולרי, יש צורך לתמונה זהה של בעלי החיים יותר מפעם אחת. במקרה זה, צריכים להיות מתוכנן פגישות ההדמיה תוך התחשבות בזמן הדרוש לקבלת אישור של הרדמה מהנחיות השימוש במערכת ובעלי חיים של המכון.

6. הדמיה

התאמות H ¹ והדמיה

1. מקם את החיה בתוך הסורק, כך שההחזר על ההשקעה היא בisocenter שימוש ברזולוציה נמוכה, סריקה אנטומית עם אוריינטציות הפרוסה שונות (מאתר).
2. שימוש בפרוטוקול shimming הקבוע על ¹ H, למשל פחית עולמית על כל הנפח בתוך הסליל.
3. התאם את רווח דופק התייחסות (RG), כלומר משדר הכוח נמדד בדציבלים ל1 msec הרמיט 90 ° דופק RF, באמצעות סריקת ההתאמה המסופקת על ידי הספק.

הערה: התאמה זו תהיהמשתנה בהתאם לסוג של סליל RF וחיוני ^ל19 F-MRI שכן האות על תדר F ¹⁹ היא בדרך כלל נמוכה מדי עבור התאמות ישירות. כתוצאה מכך, אומדן של RG חייב להיות עשוי ממדידות על אות H ^1. לשידור RF עם סליל פני השטח, RG H ¹ צריך להיות מותאם במקביל מטוס לסליל דרך החלק של עניין, לסליל נפח עם פרופיל של B ₁ הומוגנית, את ההגדרות של ההתאמה המדויקות הן פחות חשובות.

4. הפרוטוקול של ¹⁹ התאמת רווח F התייחסות דופק הבא עובד רק אם שני H ^{1 ו19} שידור F RF מתבצע עם אותו סליל RF (יחיד או כפול מכוון). להתקנה כגון הדמיה, פרופיל הסליל (שידור שדה ב _'1) בגובה ¹ צריך להיות פרופורציונאלי לפרופיל הסליל ¹⁹ F, כאשר RG קבוע מוחל, כלומר B _{1,1 H} = C * B _{1,19 F} עם אבזרortionality ג המתמיד
   1. כדי לוודא שפרופילי הסליל הם יחסי להגדרה מסוימת, לרכוש H ¹ ומפת זווית ¹⁹ F להעיף (ראה סעיף ב 'תיקון ₁ הבא) על צינור עם מאוד מרוכז ¹⁹ F, למשל TFA במים (v 1:01 / V) באמצעות (FOVs שדות של הנוף זהה), לפני כן (איור 3).
   2. שימוש באותה RG, בדוק ששני המפות זהות, פרט לג הגורם הגלובלי
   3. ברגע שגובה RG ¹ נקבע, שים לב למספר זה למטה.
5. לבצע H-MRI קונבנציונלי ¹ לסרוק כהתייחסות אנטומית להדמית ¹⁹ F. כוון את המערכת לתדר F ¹⁹ של סמן התא ולבצע F MR ¹⁹ לסרוק. באופן אידיאלי סריקת ¹⁹ F-MRI תהיה זהה אם כי בדרך כלל ברזולוציה נמוכה יותר. שדה של נוף ובחירת פרוסה כH-MRI ^1, בעלי החיים ניתן להחיות בהקדם Imaging הושלם. עיבוד תמונה ואז יכול להתבצע במצב לא מקוון.
6. לקבוע את נ ¹⁹ RG דרך ביחס dB _19F = dB _1H -20 * להיכנס ₁₀ (C). לאמוד את שכיחות סוכן נ ¹⁹ בניסוי נפרד במבחנה.

הערה: בחי, בתדר המדויק יכול להשתנות מעט מניסוי לניסוי בשל תנאי shimming שונים. כדי למנוע חפצי היסט כימי התדר המדויק ולכן צריך להיקבע בכל ניסוי על ידי נ ¹⁹ MRS, במידת האפשר. סריקה אופיינית לאות נמוך מאוד ¹⁹ F תהיה ספקטרוסקופיה הגלובלית (דופק לרכוש) (אלפיות שני TR = 200, NEX = 3,000, ת"א = 10 דקות, BW = 50 קילוהרץ). NEX, ובכך ת"א, יכול להיות מופחת באופן דרמטי לאות הגבוהה ¹⁹ F. תדירות סוכן F ¹⁹ נקבעה מהספקטרום לאחר שינוי פורייה ותיקון שלב. NEX מתייחס למספר של עירורי ת"א היא זמן הרכישה וBW הוארוחב פס.

הערה: פרמטרים הדמיה אופייניים ⁹ על סורק בעלי חיים ייעודי 11.7T/16 סנטימטר הם: סריקה אנטומיים הדמיה H ¹ באמצעות הד ספין טורבו רצף (TSE) עם TR / שעת הד יעילה _(EFF TE) = 2,200 msec/42.8 אלפיות שני, 8 הדים לעירור, NEX = 2, 10 פרוסות עבות ברציפות, 1 מ"מ, FOV = 1.92 x 1.92 ² סנטימטר, 128 x 128 מטריצה, כלומר רזולוציה של 150 x 150 x 1,000 מיקרומטר ^3, ת"א = 1 דקות, BW = 50 קילוהרץ ושיטת קידוד שלב ליניארי. ¹⁹ תמונות F נרכשו עם אותו הרצף והגיאומטריה התאמה, אבל ברזולוציה נמוכה יותר במטוס וBW הנמוך (NEX = 256, 48 x 48 מטריצה, כלומר רזולוציה של 400 x 400 x 1,000 מיקרומטר ^3, ת"א = 57 דקות, BW = 10 קילוהרץ).

7. תיקון ₁ B
   באמצעות סליל RF עם הומוגניות פרופיל ב _'1, למשל סליל פני השטח, יכול לעכב כימות של ¹⁹ נתוני F מאז האות תלויהלא רק ^ביום 19 בריכוז F אלא גם על המרחק מהסליל. תרכוש מפה ב _'1 בערוץ H ¹ כדי ¹⁹ נתוני F נכונים בדיעבד. זה דורש שH ^{1 ו19} פרופילי סליל F זהים, למעט C הגורם המידתיות, וכי אות רקע H ¹ מספיק מסופקת באזורים של ¹⁹ פ פרוטוקול דוגמא לתיקון של רצף הד ¹⁹ ספין F מוצג, באמצעות מתכונן סליל משטח מכוון אחת Tx / Rx לשני H ^{1 ו19} F ועם B הפרופורציונלי ₁ פרופילים ^13.
   1. לרכוש מפת זווית להעיף H ¹ עם שיטת הזווית להעיף שתי ^14. לרכוש שיפוע הד סריקת TR עם ארוך מאוד (> 3 פעמים ¹ HT ₁₎ עם זווית להעיף משוער של ממש מתחת 90 מעלות. סגור לסליל. לרכוש סריקת הד שיפוע שנייה עם RG = dB _1H -6, כלומר פעמיים להעיףזווית של הסריקה הראשונה.
   2. לחשב את הזווית להעיף H ^1, α, בvoxel (x, y, z) באמצעות עוצמות האות (SI) של סריקות הד השיפוע הראשונות ושנייה: α (x, y, z) = Arcos _{(SI-GE, 1} ( x, y, z) / 2SI _{GE, 2} (x, y, z)) ^14. הזווית להעיף ¹⁹ F היא זהה (פרט לגורם 1 / ג) בשל B הפרופורציונלי ₁ פרופילים. על פי העיקרון של פאראדיי הדדיות ^15, הנחתה של ¹⁹ עוצמת אות F מתוך רצף הד ספין (α זווית להעיף עירור, ממקד מחדש 2α זווית להעיף) במהלך קבלת אות הוא עו"ד _Rx (x, y, z) ~ α (x, y , Z). הנחתה עקב עירור מושלם היא עו"ד _Tx (x, y, z) ~ חטא ³ (α (x, y, z)) ^16. הנחתה הכוללת כתובה כעו"ד = attRx * attTx = * α חטא ³ (α) / 90 מעלות. שים לב שזה מנורמל ל -1 במקרה של זווית 90 ° / 180 ° להעיף עירור / מיקוד מחודש מושלמת. B ₁ מתוקן19 עוצמות אות תמונת F SI _{19F, קור} מחושבות באמצעות SI _{19F, שיתוך} (x, y, z) = SI _19F (x, y, z) / עו"ד (x, y, z).
   3. על מנת להשוות עוצמות אות מניסויים שונים, למקם את צינור התייחסות עם ריכוז F ¹⁹ שהוגדר בשדה הראייה, ולנרמל את SI _{19F, הקור} לאות הממוצעת בהתייחסות.

הערה: ניתן להשתמש בשיטות ₁ / מיפוי זווית להעיף HB ¹ אחרות ורצפי דופק ¹⁹ F שונים דורשים שינויים של עו"ד _{Tx, 19F.} כל סוג של ערכת תיקון B1 יציג שגיאה נוספת בהליך כימות תא. אם כימות תא מדויק הוא הנחת היסוד העיקרית, סליל RF עם פרופיל B1 הומוגני יכול לשמש כדי לעקוף חלק זה של הפרוטוקול.

7. עיבוד תמונה

1. מה שהופך את H ^{1 ו19} תמונות כיסוי F
   1. לייצא את נתוני תמונהעבור H ¹ הסופי ^ו19 תמונות גודל F מהסורק.
   2. לפתוח את הקבצים בתוכנת עיבוד תמונה, כגון ImageJ (freeware, NIH).
   3. לבצע התאמות תמונה לפי צורך (חיתוך, בהירות, ניגודיות) שמירה על ההתאמות זהות לכל התמונות. ¹⁹ תמונות F בדרך כלל תהיינה צורך לשדרג לרזולוציה גבוהה יותר כדי להתאים את תמונות H ¹ המתאימה.
   4. Render ¹⁹ תמונות F בצבע שווא (בחר שולחן להסתכל למעלה שונה, תחת תפריט "תמונה" בJ תמונה) ולאחר מכן כיסוי על תמונות H ¹ המתאים כדי למקם את האות.
2. ¹⁹ כימות F
   1. בחר תמונת ¹⁹ F (תמונה בסדר גודל) עם התאים הרלוונטיים וההתייחסות גלויה לעין.
   2. בתכנית כגון התמונה J, לצייר ROIs על התאים הרלוונטיים, ההתייחסות ואזור שמחוץ לנושא (רעש).
   3. השתמש בפקודה לנתחולאחר מכן למדוד (או פשוט על Ctrl + M) כדי לחשב את עוצמת פיקסל הממוצע באזורים אלה, והאזור שלהם. בואו S (תאים) מתייחסים לעוצמת פיקסל הממוצע בהחזר על ההשקעה על פני התאים. תכפיל את זה בנפח (= העובי פרוס x שטח) כדי לחשב את האות בסך הכל.
   4. חשב את יחס האות לרעש, למשל באמצעות SNR הנוסחה = S 0.65 x (תאים) / σ, שבו σ הוא סטיית התקן של עוצמת פיקסל בהחזר על השקעה מחוץ למדגם שהוא נקי מכל חפץ היסט כימי (בדרך כלל באוויר ברקע) ^17. אם יחס האות לרעש הוא מתחת לגיל 5, תיקון לאות בשל הרעש עשוי להיות נחוץ ויכול להתבצע כפי שמתואר במקומות אחרים ^{11 10.}
   5. אחרת, לחשב את הסכום הכולל של נ ¹⁹ האחראי לאות בהחזר על ההשקעה על ההתייחסות על ידי הכפלת השטח של ההתייחסות בפרוסה בעובי פרוס (כדי לחשב את הנפח) על ידי הריכוז של נ ¹⁹ בהתייחסות,אשר ידועה והניח להיות הומוגנית.
   6. הכפל את הערך שעל ידי האותות הכולל בהחזר על ההשקעה על פני התאים, מחולקים באות המלאה על ההתייחסות כדי לחשב את הסכום של נ ¹⁹ בתאים.
   7. לחשב את מספר התאים על ידי חלוקת מספר זה ב הערך עבור ¹⁹ F / תא, שחושב בסעיף 2.

Representative Results

כאן אנו מראים את התוצאות האופייניות לפרוטוקול של ההעברה ¹⁹ תאים שכותרתו-F ביות לבלוטות לימפה ניקוז. איור 2 מראה ספקטרום ¹⁹ F תמ"ג של 10 ⁶ תאים שכותרתו באמצעות התייחסות TFA. התקנת ההדמיה בוצעה כפי שתוארה בפרוטוקול (איור 3). עבור vivo ההדמיה, השתמשנו התייחסות המורכבת מצילינדר אטום של אותה התווית המשמש לתאים ממוקמים בין רגליו של העכבר. תמונה מעובדת נציג מוצגת באיור 4. על ידי יישום הפרוטוקול מתואר בסעיף 7.2, חישבנו את מספר סלולרי של כ. 1.2 x 10 ⁶ מבוסס על תמונת גודל ¹⁹ F גלם.

איור 1. שלבים עיקריים למעקב סלולרי מבוסס MRI ¹⁹ F. in vivo נתונים. איור לשכפל באישור ^6. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 2. ספקטרום F NMR נציג ^19. הספקטרום מראה את אות נ ¹⁹ הושגהבשל הכמות הידועה של התייחסות, במקרה זה TFA, והמספר הידוע של תאים, שכותרתו "מדגם". זה יכול לשמש כדי לחשב את הסכום של פלואור לכל תא, אשר הוא הכרחי עבור כימות in vivo מנתוני תמונת MR.

איור 3. מפות זווית שניות של צינורות עם TFA במים נרכשו בH ^{1 ו19} ערוץ F. הגורם המידתיות היה מחושבת להיות 1.03 ± 0.08 עבור התקנה זו. FA: להעיף את הזווית.

איור 4. בvivo ¹ H / ¹⁹ תמונת F של תאים הדנדריטים ביות לבלוטות לימפה ניקוז. איור מציג תמונה מייצגת של עכבר, עם ¹⁹ אות F נראה לעין,בצבע שווא, בהתייחסות (R) והתאים שכותרתו. רק הרגליים של העכבר הם צילמו כאן. בדוגמא זו, הזריקו התאים שכותרתו הגרו לבלוטות לימפה ניקוז. הפרמטרים ההדמיה מסוכמים בטקסט הראשי. הנתון הוא להמחשה בלבד.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מתאר את הנוהל הכללי לin vivo ¹⁹ מעקב תא F-MRI. למרות שיטת שיתוף דגירה שתוארה, ישנם מספר פרוטוקולים שונים לתיוג תאים עם סוכן F ^19. עם זאת, שיתוף הדגירה משמשת לרוב ויכולה להיות מותאם לדוגמא עוד יותר על ידי תוספת של סוכני transfection ^6. פרוטוקול תיוג תא בפועל יהיה תלוי בסוג התא. רק צעדי תיוג מפתח מתוארים בפרוטוקול כאן. באופן כללי, את התווית מוכנה והוסיפה לתאים לזמן שנבחר נע בין כמה שעות לכמה ימים. לבסוף, התאים יש לרחוץ בזהירות כדי להסיר כל עודף של תווית, במיוחד אם כימות מנתוני התמונה יבוצע ^3. אם סוכן F ¹⁹ כולל תג הקרינה, הנוכחות של תווית בחוץ (או לא מחויבת) ניתן לאתר התאים באמצעות מיקרוסקופ. לאחר סימון, יש צורך ללמוד את התאכדאיות ופונקציונליות, ביחס לתאי nonlabeled (למשל על ידי assay הרחקת trypan הכחול). בדיקות פונקציונליות תא ספציפי, כגון היכולת להפעיל תאי T במקרה של DCS, חייבים להיות גם ביצעו. לבסוף, כפי שיש לי כמה תוויות F-MRI שאינם ¹⁹ השפעה על תא הגירה ^18, בדיקות כאלה צריכים להיות כלולים גם ^ל19 תוויות F, במיוחד עם טעינה גבוהה תא.

הפרוטוקול למודל החיה הוא גם תלוי בצרכים של המשתמש. עם זאת, חשוב לזכור את גבולות רגישות הקפדניות של ¹⁹ F-MRI בעת תכנון ניסויים. ערכי רגישות פורסם נעים בין 1,000-00,000 זמן hr cells/voxel/1 ^6, עם טעינה סלולרי בטווח של 10 ¹¹ -10 ^{13 19} פ רגישות וריכוז תווית צפויה באזור של עניין גם להשפיע על הפרמטרים ההדמיה. לדוגמא, יכול להיות, מתכוונן העובי פרוס המשמש לתמונת F ¹⁹ usted כדי להתאים את זה של תמונות H ¹ או כדי לכסות שטח הרבה יותר עבה (כמו כל הבלוטה לימפה או האזור של עניין בפרוסה אחת). בדרך כלל, ההדמיה F ¹⁹ מתבצעת ברזולוציה נמוכה יותר כדי למקסם את זיהוי אות, במיוחד לאור עובדה ברזולוציה גבוהה בדרך כלל אין צורך להבחין בין מבנים כגון בלוטות הלימפה. אם האות מספיק, מספר גדול יותר של פרוסות דקות יותר ניתן לרכוש ואות המלאה על ההיקף של עניין מחושב מאלה. עם זאת, הפרמטרים אופטימליים צריכים להיות נגזרים עבור כל יישום בנפרד.

אנו מתארים פרוטוקול הרדמה זריקה עם קטמין / xylazine הימנעות גזי משאיפת פלואור כמו isoflurane. פרוטוקולים אחרים שימשו ^ב10,11 הספרות. עם זאת, בכל המקרים, פרוטוקולים אלה צריכים להיות מותאמים לזן העכבר, גיל, מין, בריאות והאורך ותדירות מפגשי ההדמיה.

ontent "> כמה ¹⁹ רצפי ההדמיה F-MRI שימשו למעקב סלולרי, לסקירה ראו ^6. פרוטוקול ההדמיה שלנו יכול להיות שונה בקלות לכלול רצפי הדמיה אחרים. עם זאת, שיטת הכימות שתוארה כאן אינה לוקח בחשבון את כל נפח חלקי אפקטים, פערים בבחירה של ROIs, שינויים בפרמטרי הרפיה של התווית in vivo, או שינויים בטעינת F ¹⁹ סלולרית. בעיות אלה מתוארים במקומות אחרים ^3. בקיצור, הטעות כבר נמצאה להיות בגבולות נסבלים עבור מעקב סלולארי של אורכי ^10. בהשוואה לעבודות המוקדמות אלה אנו בנוסף מציעים ערכת תיקון תמונה לשימוש בסלילי RF פני השטח על ידי מיפוי שדה B1. בהתאם להגדרת סליל RF הספציפית זה חשוב להיות מודע למגבלות של טכניקות מיפוי B1, אשר היו למד היטב בהקשר של ¹ H-MRI ^16. לדוגמא, עבור שיטת הזווית הכפולה שהוצגה כאן B1המפה היא מדויקת ביותר לזוגות זווית להעיף ממש מתחת 90 ° -180 ° ¹⁴ וטעייה משמעותית יכולה להיות הציגה באזורים אחרים. ובכל זאת, לאחר אימות תקינה במבחנה, תיקון למפרע כזה יכול לשפר עוד יותר את כימות תא. באופן כללי, אנו ממליצים תימוכין של נתונים טכניקות מבוססות יותר, לפחות בהתחלה. זה נעשה בדרך כלל בשילוב עם in vivo טכניקות אחרות הדמיה, הדמיה אופטית לדוגמא, כדי לסייע להוציא שגיאות גדולות. ברוב המקרים, הערכה היסטולוגית יש צורך להעריך ¹⁹ מיקום תווית F בדיוק וכדי לאפשר התאמה עם נתוני ההדמיה. זה עשוי לדרוש תוספת של צבע פלואורסצנטי לסוכן F ^19.

לבסוף, למרות ^ש19 F-MRI טרם הוחל על מעקב תא קליני, אפשר יהיה לשנות את הפרוטוקול זה לשימוש בבני אדם. השינויים העיקריים יהיו הצורך לבצע כמה שיותר optimנפל על קרקע פורה והגדרה מראש ככל האפשר (כדי למזער את משך הזמן שהנושא הוא בסורק), וכדי להתאים את הפרמטרים הדמיה לשמור בתוך שיעור ספיגה ספציפי קליני הגבלות (SAR).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
PBS	Sigma-Aldrich	MFCD00131855
TFA	Sigma-Aldrich	76-05-1
Ketamine (Ketavet)	Pfizer	778-551
Xylazine (Rompun)	Bayer	QN05 cm92
Ophtosan	Produlab Pharma	2702	eye ointment
Material name
MRI scanner	Bruker Biospec
NMR spectrometer	Bruker Biospec