Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In vitro Kokulturanalys för att bedöma patogeninducerad neutrofil transeptelmigration

Published: January 6, 2014 doi: 10.3791/50823
Automatic Translation
1,2,3, 1,3, 3, 1,3
1Department of Pediatrics, Harvard Medical School, 2Department of Pediatric Gastroenterology, MGH for Children, 3Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital

Summary

Neutrophil trans-epitelial migration som svar på mucosal bakteriell infektion bidrar till epitelial skada och klinisk sjukdom. En in vitro-modell har utvecklats som kombinerar patogen, mänskliga neutrofiler och polariserade mänskliga epitelcellslager som odlas på transwellfilter för att underlätta undersökningar mot att riva upp de molekylära mekanismerna som orkestrerar detta fenomen.

Abstract

Slemhinnor fungerar som skyddande barriärer mot patogena organismer. Medfödda immunsvar aktiveras vid avkänning av patogen vilket leder till infiltration av vävnader med migrerande inflammatoriska celler, främst neutrofiler. Denna process har potential att vara destruktiv för vävnader om överdriven eller hålls i ett olöst tillstånd.  Cocultured in vitro modeller kan användas för att studera de unika molekylära mekanismer som är involverade i patogen inducerad neutrophil trans-epitelial migration. Denna typ av modell ger mångsidighet i experimentell design med möjlighet till kontrollerad manipulering av patogen, epitelial barriär eller neutrofil. Patogena infektion av den apatiska ytan av polariserade epitelial monolayers odlas på genomsläppliga transwell filter anstiftar fysiologiskt relevanta basolateral till apical trans-epitelial migration av neutrophils tillämpas på den basolateral ytan.  In vitro-modellen som beskrivs häri visar de flera steg som krävs för att demonstrera neutrofilmigration över ett polariserat lungepitelatelmonalskikt som har infekterats med patogen p. aeruginosa (PAO1). Sådd och odling av genomsläppliga transwells med humant härledda lungepitela celler beskrivs, tillsammans med isolering av neutrofiler från helblod och odling av PAO1 och icke-patogen K12 E. coli (MC1000).  Emigrationsprocessen och kvantitativ analys av framgångsrikt migrerade neutrofiler som har mobiliserats som svar på patogena infektion visas med representativa data, inklusive positiva och negativa kontroller. Detta in vitro-modellsystem kan manipuleras och appliceras på andra slemhinnor. Inflammatoriska svar som innebär överdriven neutrofiltration kan vara destruktiva för att vara värd för vävnader och kan uppstå i avsaknad av patogena infektioner. En bättre förståelse för de molekylära mekanismer som främjar neutrofil transepitela migration genom experimentell manipulering av in vitro kokultur analyssystem beskrivs häri har betydande potential att identifiera nya terapeutiska mål för en rad slemhinnor infektiös samt inflammatoriska sjukdomar.

Introduction

Slemhinnor fungerar som fysiska och immunologiska barriärer som ger skydd mot yttre hot som är genomgripande i miljön1,2. Denna skyddande epitelbarriär kan äventyras när patogena organismer invaderar2. När det gäller en bakteriell patogen initierar detta möte ofta en inflammatorisk process genom att aktivera det medfödda immunsystemet och utlösa en snabb mobilisering av första respondergranulocyter som kallas neutrofiler2-4. Kemotactic agenter som underlättar neutrophil rekrytering produceras delvis av mucosal epitelial celler som försöker befria värden av den kränkandepatogenen 2-4. Överdriven eller olöst neutrofiltration av slemhinnan epitelial ytan kan orsaka betydande patologi1,5. Detta är en följd av ospecificerad vävnadsskada orsakad av antibakteriell neutrofilarsenal5-7. I sådana fall överskuggas bakteriell clearance kapacitet av neutrofiler av förstörelse av värdvävnad under en smittsam förolämpning.  Störningar i den skyddande epitelbarriärfunktionen kan leda till ökad exponering av underliggande vävnad för mikroorganismer och/eller toxiner, vilket ytterligare förvärrar sjukdomspatologin8,9. Dessa konsekvenser kan observeras i flera organsystem inklusive lungan och mag-tarmkanalen1,5. Dessutom kännetecknas icke-smittsamma inflammatoriska tillstånd såsom svåra anfall av astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL), akut respiratoriskt nödsyndrom (ARDS) och inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) av det patologiska brottet mot den mukosala epitelbarriären genom ett överdrivet neutrofiltsvar 4,5,10-12.

Den komplexa processen med neutrofilrekrytering efter slemhinna infektion innebär flera fackindelatsteg 1,5,13,14. För det första måste neutrofiler avvika från cirkulationen via en serie cell-till-cell-interaktioner som underlättar transendotelmigration1,13. Neutrofiler navigerar sedan i befintligt interstitiellt utrymme som innehåller extracellulärmatris 1,14. För att nå lumen i den infekterade slemhinnan måste neutrofiler sedan migrera över epitelbarriären1,4,5. Detta invecklade multistep fenomen undersöks ofta i aggregerat med hjälp av in vivo djurmodeller av infektion15. Sådana modeller är användbara för att fastställa behovet av specifika faktorer, såsom kemokiner, vidhäftningsmolekyler eller signalvägar som deltar i den övergripande processen men som till stor del är otillräckliga för att lösa molekylära bidrag som är kritiska för varje distinkt uppdelning steg16. Kokulerade in vitro-system som modellerar transendotel-, transmatris- eller transeptelmigration av neutrofiler har varit särskilt användbara i dettaavseende 1,14,16,17.

Ett robust kokultur analyssystem har utvecklats för att dechiffrera mekanismer som ansvarar för neutrofil trans-epitelial migration som svar på patogena infektion18-22. Denna modell innebär att infektera den apatiska ytan av polariserade mänskliga epitelcellslager med en bakteriell patogen följt av applicering av nyisolerade mänskliga neutrofiler på den basolateralaytan 18-22. Neutrofiler migrerar över epitelbarriären som svar på epitelial-härledda kemotactic produkter utsöndras efter patogenainfektion 18,21-23. Detta modellsystem har använts med hjälp av intestinala och lung epitelkulturer som utsätts för lämpliga vävnadsspecifika bakteriella patogener och har avslöjat nya molekylära mekanismer som sannolikt är viktiga för neutrofilrekryteringsprocessen under slemhinnainfektion3,8,19,24-28. Styrkan i denna in vitro-kokulturmodell är att ett reduktionistiskt tillvägagångssätt gör det möjligt för prövaren att experimentellt manipulera patogenen, epitelbarriären och/eller neutrofil i ett välkontrollerat, mycket reproducerbart, ganska billigt system. Insikt som samlats in från detta tillvägagångssätt kan effektivt utnyttjas för att genomföra fokuserad analys av uppdelningshändelser under neutrofilrekrytering med hjälp av in vivo-infektionsmodeller 22,29,30.

Denna artikel visar de flera steg som krävs för att framgångsrikt upprätta denna reproducerbara modell för att utforska patogen inducerad neutrophil trans-epitelial migration. Lung epitelial hinder infekterade med patogenen Pseudomonas aeruginosa presenteras i denna artikel; Andra vävnad epithelia och patogener kan dock ersättas med mindre modifieringar. Sådd och odling av polariserade lung epitelial cell lager på inverterade kollagen belagda permeable transwell filter är detaljerad häri, liksom tillväxten av patogena P. aeruginosa och isolering av neutrophils från helblod. Hur dessa komponenter kombineras för att observera patogen inducerad neutrofil trans-epitelial migration presenteras tillsammans med lämpliga positiva och negativa kontroller för att fastställa en reproducerbar analys. Mångsidigheten i detta tillvägagångssätt att undersöka olika aspekter av patogen inducerad neutrophil trans-epitelial migration diskuteras med hänvisning till specifika studier i litteraturen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Steg (1-3) ska utföras i steril miljö under en laminär flödeshuv.

1. Kollagenbeläggningstranswells

  1. Gör en 30 μg/ml kollagenlösning. Späd 3 mg/ml kollagenlager 1:100 i 60% etanol som har passerat genom en 0,2 μm filterenhet.
  2. Vortex spädde ut 30 μg/ml lösning. Obs: Det är inte nödvändigt att vibrerar 3 mg/ml kollagenbuljonglösning, eftersom denna lösning är ganska trögflytande och luftbubblor kan införas, vilket potentiellt minskar noggrannheten vid pipettering.
  3. Ta bort 0,33 cm2 tillväxtområdestranswells med en porstorlek på 3 μm från ytterförpackningen och placera 24-brunnsplattan som innehåller 12 transwells upp och ner inuti huven.
  4. Lyft av bottenplattan och lägg åt sidan. Obs: Transwells kommer nu att vara upp och ner vilande ovanpå locket på 24-brunnsplattan
  5. Sätt på Bunsenbrännaren. Flam hemostat för sterilitet och låt svalna.
  6. Överför transwells med steril hemostat till en petriskål på 150 mm x 25 mm och håll dem i inverterat läge. Obs: Var noga med att behålla steriliteten hos den tomma 24-brunnsplattan plus locket som ska användas för att hysa transwells när de har såts med epitelceller.
  7. Pipett 70 μl av 30 μg/ml kollagenlösning på filtermembranet i varje inverterat tvärgående. Obs: Ytspänningen bör hålla denna lösningsvolym på plats eftersom det inte finns några väggar runt filtermembranet när du kommer åt ytan på undersidan. Var försiktig så att kollagenlösningen inte droppar ner på sidan av givaren och undvik att flytta transwells under beläggningsproceduren.
  8. Låt locket på Petri-skålen vara avstängt i minst 4 timmar så att etanollösningen kan avdunsta. För att bibehålla steriliteten under denna process, håll huvfläkten och ultraviolett ljus på.
  9. När transwellsna har torkat kan de användas omedelbart eller förvaras i rumstemperatur i upp till en vecka förutsatt att Petri diskskydd är på plats och steriliteten bibehålls.

2. Passagekolv av epitelceller för sådd av transwells

(Detta protokoll beskriver specifikt hanteringen av lung epitelcellslinjen H292 för generering av epitelial hinder odlas på transwells. Andra epitelcelllinjer kan användas med smärre modifieringar.)

  1. Förbered odlingsmediet genom att tillsätta 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (HI-FBS) och 1x Penicillin/Streptomycin till RPMI 1640.
  2. Varma medier, trypsin-EDTA (T-EDTA) och D-PBS i 37 ºC vattenbad.
  3. Ta bort T-75-kolven som innehåller celler från inkubatorn och bedöm sammanflödet visuellt med inverterat mikroskop. Obs: Vid användning av H292-celler bör kolvarna vara nära eller helt sammanfloppade.
  4. Aspirera media från kolven. Minska den tid som cellerna är torra genom att ha nästa lösning i huva med locket lossat.
  5. Tillsätt 5 ml D-PBS till T-75-kolven och snurra. Undvik att skapa bubblor. Ta bort PBS efter aspiration.
  6. Tillsätt 3 ml T-EDTA till T-75-kolven och snurra för att täcka botten.
  7. Ta bort det mesta av T-EDTA och lämna ca 0,3 ml i T-75-kolv.
  8. Fördela den lilla återstående volymen T-EDTA över cellernas yta och placera den i en fuktad inkubator under standardkulturförhållanden (37 ºC, 5 % CO2).
  9. Ta bort kolven från inkubatorn efter en viss tid. Obs: Cellerna bör lätt lossna från kolvens yta genom att försiktigt knacka kolven på sidan. Cellerna ska nu avrundas och flyta när de visualiseras under mikroskopet. Den genomsnittliga tiden detta tar för H292 celler är 5-10 min.
  10. Tillsätt 10 ml odlingsmedier i kolven för att neutralisera T-EDTA- och återanvändbara celler. Dra upp celllösningen i pipettspetsen och mata ut den på ytan av kolven som innehåller celler ungefär fem gånger för att återanvända alla celler.
  11. Överför återanvändda celler till ett 15 ml-rör för sådd av transwells. Anm.: Koncentrationen av återanvända H292-celler som bereds på detta sätt bör variera mellan cirka 1 x 106-1,8 x 106 celler/ml.

3. Sådd kollagenbelagda transwells med epitelceller

  1. Tillsätt 70 μl återanvänd celllösning från 15 ml-röret till varje inverterat kollagenbelagt transwell. Obs: H292-celllösningar med ett koncentrationsområde mellan 1 x 106-1,8 x 106 celler/ml ger cirka 70 000-120 000 celler/transwell.
  2. Blanda cellfjädringen genom att försiktigt invertera röret regelbundet för att förhindra att celler sätter sig till botten av 15 ml-röret medan du sår transwellsna. Obs:Virka inte celler och var försiktig så att pipettspetsen inte kommer i direkt kontakt med kollagenbelagt membranfilter.
  3. När alla inverterade transwells har såts med epitelceller, byt petriskålskydd och placera försiktigt i vävnadskulturens inkubator, fuktad, 37 ºC, 5% CO2. Var noga med att undvika att störa cellfjädringen som har lagts till det kollagenbelagda filtermembranet.
  4. Håll inverterade transwells i vävnadskulturen inkubator, fuktad, 37 ºC, 5% CO2 över natten. Obs: Bubblan av flytande innehållande celler bör förbli förknippad med det genomsläppliga filtermembranet i transwellen under hela inkubationen över natten. Om filtermembranet blir torrt på grund av avdunstning av vätska eller på grund av att vätskan droppar ner på sidan av transwells, kanske epitelskikten inte växer ordentligt.
  5. Följande dag, tillsätt 1 ml media i den ursprungliga sterila 24-brunnsplattan och vänd varje inverterad transwell med en steriliserad hemostat i varje brunn som innehåller 1 ml media.
  6. Tillsätt 0,2 ml media i den övre kammaren i varje transwell och återgå till vävnadskulturinkubator, fuktad, 37   ºC, 5% CO2.
  7. H292 inverterade transwells kan användas från 8 dagar upp till 1 månad efter sådd. Obs: Vi föreslår att du väntar minst 8 dagar efter sådd av transwells för att säkerställa att epitelmonoskikten har bildats fullt ut och uppvisar en funktionell barriär. Man kan testa H292 epitelbarriären genom att avgöra om monoskiktet kan begränsa transepitela flödet av proteinhästens rädisaperoxidas (HRP) efter tillsats av den basolaterala ytan18.

4. Beredning av bakterier för infektion av epitellager på transwells

  1. En dag före experimentet, extrahera en koloni av P. aeruginosa PAO1 från en Pseudomonas Isolation Agar-platta och en koloni av K12 E. coli MC1000 från en Luria-Bertani (LB) Agar-platta och placera i separata rör som innehåller 3 ml LB-buljong. VARNING: P. aeruginosa är en humanpatogen, standard BSL2 säkerhetsåtgärder bör vidtas vid hantering av denna organism.
  2. Skaka över natten vid 225 varv/min i en 37 ºC-miljö.
  3. Nästa dag, ta bort 1 ml från de täta bakteriekulturerna och placera i 1,5 ml Eppendorf-rör.
  4. Snurra i mikrofugera vid 15 800 x g i 5 min och ta sedan bort supernatant.
  5. Förbered Hanks balanserade saltlösning med kalcium och magnesium (HBSS+) i förväg. Tillsätt 23,8 g HEPES och 97,5 g HBSS+-pulver till 9,5 L destillerat vatten. Tillsätt små mängder 10 M NaOH till lösningen, samtidigt som pH-talet övervakas tills ett stabilt pH-tal på 7,4 uppnås. Ta volym upp till 10 L och förvara vid 4 ºC.
  6. Återanvänd varje bakteriepellet med 1 ml HBSS+. Vortex för att vara säker på att en jämn bakteriell suspension uppnås.
  7. Snurra igen vid 15 800 x g i 5 min och ta bort supernatant.
  8. Återanvänd PAO1-pelleten med 0,6 ml HBSS+ och MC1000-pelleten med 0,5 ml HBSS+. Virvel bakteriella suspensioner.
  9. Späd ut PAO1 och MC1000 återanvända pellets 1:100 i HBSS+. Tillsätt till exempel 50 μl av den 0,6 ml PAO1 återanvända pelleten till 5 ml HBSS+. Obs: Med hjälp av optisk densitetsmätningar (OD) för att bestämma odlingstätheten samt standardmetoden för kolonibildande enhet (CFU) utspädningsplätering ger PAO1- och MC1000-lösningar som utarbetats på detta sätt konsekvent mellan 3 x 107-6 x 107 CFU/ml. Densiteten hos en bakteriekultur är positivt korrelerad med OD-mätningen av kulturen vid 600 nm och detta samband kan användas för att uppskatta bakteriecellskoncentrationen. För att bekräfta bakteriecellskoncentrationen kan kulturen spädas till en mycket låg uppskattad koncentration och pläteras på en agarplatta så att man kan förvänta sig att mellan 30-200 bakterieceller finns på plattan. Cellerna sprids över plattan och inkuberas över natten vid 37 ºC så att varje cell bildar en individuell koloni av celler som är tillräckligt stora för att vara synliga och kolonier kan sedan räknas.

5. Isolering av neutrofiler från helblod

  1. Syracitratdextroslösning (ACD) används som antikoagulantia och bereds genom tillsats av 6,9 g citronsyra, 12,5 g natriumcitrat och 10 g dextros till 500 ml destillerat vatten. När alla komponenter har lösts upp steriliseras ACD-lösningen genom att passera genom en filterenhet på 0,2 μm. Förvara ACD-lösningen vid 4 ºC.
  2. Tillsätt 5 ml ACD till 50 ml spruta innan du drar blod och fäst 21 x 3/4 G fjärilsnål med 12 i slangar.
  3. Applicera stass, torka venen med alkohol och sätt in nålen. Anm.: Alla forskningsprotokoll som omfattar människor måste godkännas av en institutionell granskningsnämnd och skriftligt informerat samtycke måste tillhandahållas från varje blodgivare. Till exempel godkändes experiment som utfördes med detta protokoll av Massachusetts General Hospital Institutional Review Board och tilldelade protokoll #1999-P-007782.
  4. Dra långsamt 45 ml blod för att säkerställa att blodet blandas med ACD en gång i sprutan.
  5. När 45 ml har dragits (50 ml total volym), lossa stassen innan nålen tas bort. Tryck omedelbart på sår med steril gasväv när nålen tas bort.
  6. Överför blod långsamt längs sidan av ett 50 ml rör under cirka 5-10 sek.
  7. Snurra i centrifugering vid 1 000 x g med bromsen avaktiverad i 20 minuter vid rumstemperatur. Anm.: Ett ytterligare steg som innebär utspädning av helblod i PBS- och noggrant överlägg av utspädd blod på Ficoll-Paque före centrifugering kan användas för att uppnå en något högre nivå av neutrofil renhet genom att mer effektivt separera buffy kappan från granulocyterna8. Att utelämna detta steg tjänar till att spara tid utan att drastiskt påverka utbytet eller renheten för denna analys, och därför föredrar vi att inte inkludera blodöverlägget på Ficoll-Paque-steget.
  8. Medan blodet snurrar, tillsätt mycket långsamt 1 g gelatin i 50 ml uppvärmd hanks balanserade saltlösning utan kalcium och magnesium (HBSS(-)) för att förbereda 2% gelatinlösning. Håll lösningen på 37 ºC.
  9. Aspirera och kassera plasma från 50 ml-röret med blod med en glaspipettspets som har behandlats med Sigmacote.
  10. Fortsätt aspirera mycket noggrant för att ta bort den buffy kappan, som innehåller vita blodkroppar, inklusive lymfocyter.
  11. När den buffiga kappan långsamt tas bort kommer det vitgula grumliga materialet ovanför rbc-skiktet (Red Blood Cell). Upphör med aspirationen när den buffiga kappan har tagits bort och RBC-skiktet tydligt kan visualiseras när du tittar uppifrån röret.
  12. Försök att inte störa RBC-skiktet eftersom granulocyter, mestadels neutrofiler, ligger nära ytan av RBC-skiktet, men är inte synliga.
  13. Tillsätt 30 ml varm 2% gelatinlösning (2x volym av RBC-skiktet) till en volym på 15 ml RBC-skikt.
  14. Invertera röret försiktigt för att blanda, var noga med att minimera bildandet av bubblor.
  15. Inkubera vid 37   ºC i 25 min. Obs: RBC bör aggregera och sätta sig till botten. Som ett alternativ till gelatin kan stor molekylviktsdextrans användas till sediment RBC8.
  16. Efter inkubation, överför toppskiktet ljus rödaktig lösning som innehåller granulocyter till ett nytt 50 ml-rör med pipett, var försiktig så att du inte stör det sedimenterade mörka RBC-skiktet under överföringen. När du har separerat, kassera mörkt RBC-lager.
  17. Spinn överförd lätt rödaktig lösning som innehåller granulocyter och vissa RBC i centrifuger vid 1 000 x g med broms aktiverad i 10 min vid rumstemperatur för att pelletsceller.
  18. Häll av eller aspirera supernatanten försiktigt, eftersom den rödaktiga cellpelleten som bildas efter centrifugation i allmänhet är lös.
  19. Förbered RBC lysis buffert i förväg och lagra vid 4 ºC genom att tillsätta 8,29 g ammoniumklorid (NH4Cl), 1 g natriumbikarbonat (NaHCO3)och 0,038 g EDTA till 1 L destillerat vatten i en bägare. Förvara RBC lysis buffert vid 4 ºC.
  20. Återanvänd och bryt upp rödaktig cellpellet med en liten volym kall RBC lysbuffert. När cellpelleten är i lösning, fyll röret till 50 ml med RBC lysbuffert. Obs: Håll cellerna på is eller vid 4 ºC vid denna tidpunkt och framåt.
  21. Snurra i centrifugera vid 300 x g i 10 min vid 4   ºC och häll sedan av eller aspirera supernaten. Supernaten kommer att vara något rödaktig och innehållande lysade RBCs. Pelleten ska vara gulvit vid denna tidpunkt. Om betydande RBC finns kvar i pelleten enligt en rödaktig pellet kan steg 5.20-5.21 upprepas. Betydande RBC finns kvar i cellpelleten om den rödaktiga pelleten från steg 5.20 inte bryts upp tillräckligt.
  22. Återanvänd och bryt upp vitaktig pellet med en liten volym HBSS(-) och fyll sedan röret till 50 ml med HBSS(-). Obs: HBSS(-) och inte HBSS+ ska användas för att återanvända vitaktig cellpellet. HBSS(-) saknar kalcium och magnesium.
  23. Snurra igen i centrifugera vid 300 x g i 10 min vid 4   ºC.
  24. Häll av supernatant och återanvänd pelleten till en slutlig volym av 1 ml HBSS(-).
  25. Tillsätt 5 μl av 1 ml cellfjädring till 250 μl HBSS(-) i ett 1,5 ml Eppendorfrör och blanda försiktigt upp och ner med pipett.
  26. Tillsätt 25 μl utspädd cellfjädring till 25 μl 0,4% Trypan blå.
  27. Tillsätt 12 μl blandning på varje sida av en vanlig hemocytometer.
  28. Räkna antalet levande celler som har uteslutit trypanblå färgämnet och finns i mitten av torget på båda sidor av hemocytometern.
  29. För att beräkna cellkoncentrationen multiplicerar du genomsnittet av de 2 kvadraterna med 100 (utspädningsfaktor) och multiplicerar sedan med 104 för att ge antalet celler/ml.
  30. Justera den slutliga koncentrationen till 5 x 107 celler/ml. Om det är större än 5 x 107 celler/ml, justera genom att tillsätta HBSS(-). Om mindre, pellet cellerna och återanvänd till lämplig volym.
  31. Håll cellerna på is tills de är redo för migreringsanalys. Dessa celler representerar granulocytpopulationen av vita blodkroppar. Majoriteten av de granulocyter som isolerats från helblod är neutrofiler. Celler hålls på is upphängda i HBSS(-) tills de tillförs migreringsanalysen för att bibehålla celler i ett quiescent tillstånd.

6. Förberedelse av epitelcellslager för migrationsanalys

(Dessa steg behöver inte utföras i en steril huva.)

  1. Ta bort från inkubatorn 24-brunnsplatta som stöder epitelskikt som har odlats på undersidan av transwellfiltermembran i minst åtta dagar.
  2. Ta tag i kanten på varje transwell med en hemostat, lyft ut ur 24-brunnsplattan och vänd upp försvinnet över en avfallshink för att kassera kulturmedia från transwellens inre kammare. Doppa varje transwell i en tvättbägare som innehåller HBSS+ för att fylla den inre kammaren i transwellen med HBSS+. Kasta vätska från innerkammaren i en avfallshink.
  3. Upprepa steg 6.2 för en andra tvätt i HBSS+. Efter två tvättar, placera transwells i en ny 24-brunnsplatta som innehåller 1 ml HBSS+ i varje brunn. Obs: Alla tvättar ska utföras med HBSS+ som värms upp till 37 ºC.
  4. Observera den övre kammaren i varje transwell för att bedöma epitelcellens cellskiktsintegritet. Obs: HBSS+ får inte läcka in i och fylla toppen av transwellen när den placeras i brunnen på en 24-brunnsplatta som innehåller 1 ml HBSS+.
  5. Efter att noggrant ha observerat varje transwell, tillsätt 0,2 ml HBSS+ i toppkammaren.
  6. Placera i inkubator vid 37   ºC, 5% CO2 i en fuktad kammare i 30-60 min för att balansera epitelcellsskikt.

7. Neutrofil transeptaxiell migrationsanalys

  1. Ta bort från inkubatorn 24-brunnsplatta av tvättade transwells som balanserar i HBSS+.
  2. Ta tag i varje transwell med en hemostat och kasta vätska i toppen väl i en avfallshink.
  3. Placera varje transwell upp och ner i en 150 mm x 25 mm Petri-skål.
  4. Tillsätt 25 μl HBSS+till sex av de inverterade Transwells. Till tre av de inverterade transwellerna, infektera med 25 μl P. aeruginosa (PAO1) utspädd i HBSS+ beredd enligt beskrivningen i steg 4. Till de tre sista inverterade transwellerna, infektera med 25 μl E. coli K12 (MC1000) utspädda i HBSS+ beredda enligt beskrivningen i steg 4. Detta är cirka 0,8 x 106-1,5 x 106 CFUs/epitelskikt för varje bakterieart eftersom koncentrationen av bakteriella lösningar som framställs i steg 4 är cirka 3 x 107-6 x 107 CFU/ml.
  5. Inkubera vid 37   ºC, 5% CO2 i en fuktad kammare i 60 min.
  6. Förbered fMLP som en positiv kontroll för neutrofilmigration genom att tillsätta 5 μl 10 mM fMLP-lager till 5 ml HBSS+ vilket ger en 10 μM-lösning.
  7. Tvätta transwells genom att greppa med en hemostat och vända tillbaka till en 24-brunns tvättplatta som innehåller 1 ml HBSS+ i bottenkamrarna. Tillsätt 0,2 ml HBSS+ till de övre kamrarna.
  8. Ta tag i transwell med en hemostat och ta bort från den första tvättplattan. Innan du placerar transwells i en andra 24-brunns tvättplatta som innehåller 1 ml HBSS +, kasta vätska från översta kammaren i en avfallshink. Tillsätt 0,2 ml HBSS+ i den övre kammaren.
  9. Upprepa steg 7.8 en gång till för totalt 3 tvättar. Anm.: Alla transwells bör genomgå samma hanterings- och tvättregim, oavsett om de har smittats med bakterier eller inte, för att säkerställa att alla transwells som analyseras har manipulerats på samma sätt. En 60 min infektion med antingen PAO1 eller MC1000 minskar inte livskraften eller ändrar barriäregenskaperna hos H292 monoskiktet enligt en laktatdehydrogenasbaserad toxikologianalys respektive HRP-flödesanalysen18,22.
  10. Förbered 24-brunnsmigreringsplattan genom att tillsätta 1 ml HBSS+ i 12 brunnar på 24-brunnsplattan. Obs: Denna platta kan beredas i förväg.
  11. Efter den tredje tvätten, kassera vätska från de övre kamrarna av transwells i en avfallshink med en hemostat och placera tre av de oinfekterade transwellerna i tre brunnar på 24-brunnsmigreringsplattan som innehåller 1 ml HBSS +, vilket representerar den negativa kontrollen.
  12. Pipett 10 μl av en 10 μM-lösning av fMLP i var och en av tre brunnar på migrationsplattan med 24 brunnar som innehåller 1 ml HBSS+ (100 nM).
  13. Placera tre av de oinfekterade flyttningarna i tre brunnar på 24-brunnsmigreringsplattan som innehåller 100 nM fMLP, vilket representerar en positiv kontroll för isolerade neutrofilers förmåga att migrera.
  14. Placera tre transwells infekterade med PAO1 och tre transwells infekterade med MC1000 i tre brunnar vardera av 24-brunns migrationsplattan som innehåller 1 ml HBSS+. Tillsätt 0,1 ml HBSS+ i den övre kammaren i varje transwell.
  15. Lägg till 20 μl neutrofilsupphängning (5 x 107 celler/ml) som bereds enligt beskrivningen i steg 5 ovanpå 0,1 ml HBSS+ i varje transwell. Obs: Detta motsvarar cirka 1 x 106 neutrofiler/transwell.
  16. Inkubera vid 37 ºC, 5% CO2 i en fuktad kammare i 2 timmar för att möjliggöra transeptelmigration av neutrofiler.
  17. Förbered en standardkurva för att bestämma antalet neutrofiler som har migrerat efter 2 timmar. Tillsätt 40 μl neutrofilsupphängning (5 x 107 celler/ml) i 2 ml HBSS(+) och överför 1 ml till 1 ml HBSS(+) och utför seriella 2-faldiga utspädningar åtta ytterligare gånger för totalt 10 standarder som sträcker sig från cirka 2 000 celler/ml till 1 x 106 celler/ml. Inkludera 1 ml HBSS(+) för tomt.
  18. Efter 2 timmars migrering, lyft transwellsna genom att greppa med en hemostat och knacka försiktigt mot insidan av väggarna på 24-brunnsmigrationsplattan. Kassera transwells.
  19. Bedöma migreringen av neutrofiler grovt i brunnarna genom att titta på brunnar på 24-brunnsmigrationsplattan under ett inverterat mikroskop med 10X-målet (se figur 1 för bilder av migrerade neutrofiler i varje tillstånd).
  20. Tillsätt 50 μl 10% triton X-100 till varje brunn som används i 24-brunnsmigreringsplattan, varje standard och blind.
  21. Rotera 24-brunnsmigreringsplattan, standarderna och tom vid låg hastighet i 20 min vid 4   ºC.
  22. Förbered 1 M citratbuffert i förväg. Tillsätt 52,5 g citronsyra och 73,5 g natriumcitrat till 400 ml destillerat vatten i en bägare. Ta pH till 4,2. Tillsätt destillerat vatten för slutlig lösning på 500 ml. Förvara lösningen vid 4 ºC.
  23. Förbered ABTS substratlösning fräsch den dagen. Tillsätt 3 ABTS tabletter (10 mg vardera) och 5 ml 1 M citratbuffert till 45 ml destillerat vatten. Låt tabletterna lösas upp helt i lösningen. Undanhåller tillsats av 50 μl 30% väteperoxid tills ABTS-substratlösningen behövs (se steg 7.27).
  24. Tillsätt 50 μl citratbuffert till varje brunn som används i 24-brunnsmigreringsplattan, varje standard och blind.
  25. Överför 100 μl av varje provbrunn i duplikat till en 96-brunnsplatta. Obs: Det är mycket viktigt att noggrant blanda innehållet i varje prov väl innan du flyttar till 96-brunnsplattan. Pipett lösningen upp och ner minst fem gånger före överföring.
  26. Överför 100 μl av varje standard och blindt till 96-brunnsplattan efter blandning (tom i duplikat).
  27. Tillsätt 50 μl 30% väteperoxid till ABTS-lösningen och virveln.
  28. Tillsätt 100 μl ABTS substratlösning till varje prov på 96-brunnsplattan.
  29. Låt plattan utvecklas i 5-10 min i mörker. Obs: En grön färg bör utvecklas i vissa brunnar, korrelerar med antalet neutrofiler som finns i varje brunn.
  30. Läs vid våglängd på 405 nm med hjälp av en mikroplatta läsare.
  31. Beräkna antalet neutrofiler som har migrerat över epitelskiktet med hjälp av de standarder enligt vilka det finns ett linjärt positivt samband mellan det kända antalet neutrofiler som framställs som standarder och mängden peroxidasaktivitet mätt med optisk densitet vid 405 nm (se figurerna 2 och 3 för representativa data). Obs: Denna metod för neutrofil kvantifiering drar nytta av den stora mängd peroxidas verksamhet som uppvisas av neutrofiler på grund av myeloperoxidase uttryck. Alternativa metoder för att kvantifiera neutrofiler kan övervägas, såsom metoder som inbegriper förmärkning av neutrofiler med radioaktivitet eller fluorescensföreningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flera studier har visat att patogen-infekterade epitelial lager underlättar neutrophil trans-epitelial migration3,8,19,24-28,31,32. Detta sker via en patogenspecifik induktion av en epitelcell-härledd neutrofila kemotactic gradient3,23. Till exempel orsakar patogena P. aeruginosa interagerar med den apatiska ytan av lungepitela celler ett betydande antal neutrofiler att migrera över epitelskiktet18,22,25,26,33,34. Detta kliniskt relevanta analyssystem kan manipuleras på många sätt för att avtäcka nyckelpatogen och vara värd för molekylära bidragsgivare när de paras ihop med lämpliga kontroller.

Neutrofiler som läggs till polariserade epitelcellslager som inte har preinfekterats misslyckas med att migrera över i märkbara tal. Tillämpningen av en kemo-attractant gradient över ett oinfekterat epitelskikt kommer dock att driva betydande antal neutrofiler över. Det är viktigt att inkludera både dessa negativa respektive positiva kontroller inom varje analys när man undersöker neutrofilmigration över patogeninfekterade epitelskikt. Den negativa kontrollen fastställer bakgrundsnumret av neutrofiler som korsar epitelskiktet i avsaknad av signal. Detta antal bör vara mycket lågt när odlade epitelceller har etablerat en funktionell barriär. Hög bakgrund migration komplicerar tolkningen av resultat som uppnåtts med patogen-infekterade epitel. Den positiva kontrollen innebär att man applicerar en gradient av ett neutrofil chemo-attractant såsom fMLP över epitelskiktet och tjänar till att bekräfta att de isolerade neutrofiler är funktionella. Om epitelskikt förbehandlas med vissa reagenser för att bedöma deras inverkan på patogeninducerad transeptelmigration, tjänar fMLP-gradienten till att kontrollera eventuella effekter reagenset kan ha på neutrofilernas förmåga att navigera i epitelskiktet oavsett patogena medierade effekter. En ytterligare kontroll som ofta används inom detta analyssystem innebär infektion av epitelskikt med nonpathogenic bakterier parallellt med patogen. Denna kontroll kan utnyttjas för att skilja relevanta epitelial svar efter interaktion med bakterier samt hjälpa till med identifiering av patogena faktorer som är nödvändiga för att stimulera neutrofil trans-epitelial migration.

Neutrophil trans-epitelial migration kan bedömas både kvalitativt och kvantitativt. Vid slutförandet av 2 timmars inkubation efter tillsats av neutrofiler till den basolateral ytan avlägsnas transwells och neutrofiler som har migrerat helt över epitelskiktet till den apatiska kammaren kan ses i bottenbrunnen på 24-brunnen migrationsplattan. En representativ bild av varje villkor visas i figur 1, visualiserad med hjälp av ett inverterat ljusmikroskop. Mycket få neutrofiler observerades migrera över ett oinfekterat epitelskikt utan en påtvingad kemotaktisk gradient (HBSS+) och representera bakgrundsnivåer i analysen (Figur 1A). Däremot var ett överflöd av transmigrerade neutrofiler uppenbart när en fMLP-gradient tillhandahålls (figur 1B). Infektion i epitel med nonpathogenic E. coli MC1000 resulterade i få synliga transmigrerade neutrofiler, medan många transmigrerade neutrofiler kunde observeras när epitelial lager var smittade med lung patogena P. aeruginosa (PAO1) (figurerna 1C och 1D).

De neutrofiler som har migrerat i experimentet kvantifieras genom att mäta deras myelooxidasaktivitet. En standardkurva används för att möjliggöra en uppskattning av antalet transmigrerade neutrofiler. Antalet neutrofiler korrelerar positivt med mängden peroxidasaktivitet som mäts efter lys av neutrofiler med värden som uppvisar ett linjärt förhållande inom det intervall av neutrofiltal som valts för standardkurvan (2 x 103-1 x 106 celler/ml) (figur 2). Ett betydande antal neutrofiler migrerar över epitelskikt som svar på en medföljande fMLP-gradient eller som svar på ett epitelskikt infekterat med PAO1 (figur 3). Antalet neutrofiler som migrerar i avsaknad av stimuli (HBSS+) eller efter apisk epitelinfektion med nonpathogenic E. coli MC1000 ligger under detektionsgränsen för analysen (figur 3). Data som presenteras i figur 3 representerar det genomsnittliga antalet transmigrerade neutrofiler med felstaplar som representerar standardavvikelse för tre oberoende brunnar / tillstånd. Kvantitativa data som avbildas i figur 3 överensstämmer med representativa brunnsbilder som visas i figur 1.

Figure 1
Figur 1. Bild av neutrophils efter trans-epitelial migration. Bilder sågs med ett inverterat ljusmikroskop vid 10X förstoring av bottenbrunnen (apical chamber) i 24-brunnsmigrationsplattan efter inkubationsperioden på 2 timmar med neutrofiler som läggs till toppbrunnen (basolateralkammare). (A) Negativ kontroll HBSS+. B)Positiv kontroll införde fMLP-kemotaktisk lutning. C)Epitelcellslager infekterade med icke-apatiska E. coli K12 (MC1000). D)Epitelcellsskikt infekterade med patogen p. aeruginosa (PAO1). Klicka här om du vill visa större bild.

Figure 2
Figur 2. Neutrofiler vid en startkoncentration på 1 x 106 utsattes för nio 2-faldiga utspädningar. Efter lysis fastställdes mängden peroxidasaktivitet och antalet neutrofiler graferades på x-axeln med peroxidasaktivitet på y-axeln. Ekvationen som avbildas kan användas för att bestämma antalet neutrofiler som finns i varje brunn efter transmigration baserat på mängden peroxidasaktivitet som mäts i varje brunn. Klicka här om du vill visa större bild.

Figure 3
Figur 3. Kvantifiering av transmigrerade neutrofiler. Antalet transmigrerade neutrofiler kvantifieras genom relativ myeloperoxidasaktivitet till en linjär standardkurva av kända antal neutrofiler. Ett betydande antal transmigrerade neutrophils observerades efter epitelial cell infektion med patogena P. aeruginosa (PAO1) eller upprättande av en apical till basolateral gradient av neutrophil chemo-attractant fMLP. Oidentifierbara antal transmigrerade neutrofiler observerades efter epitelcellsinfektion med icke-apapatigen E. coli K12 (MC1000) behandling eller endast negativ kontrollbuffert (HBSS+). Klicka här om du vill visa större bild.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neutrofil migration över mucosal epitelial ytor är en vanlig egenskap i sjukdomen patologi efter infektion med bakteriella patogener3. Den metodik som beskrivs häri erbjuder ett snabbt, enkelt tillvägagångssätt för att experimentellt isolera denna diskreta händelse med hjälp av en mänsklig cell härledd in vitro kokultur analyssystem som modellerar en funktion av den inflammatoriska processen utlöses av bakteriella infektioner. Detta system utvecklades ursprungligen med polariserade intestinala epitelceller infekterade med enteriska patogener inklusive Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, och olika patogena E. coli8,19,24,27,28. Var och en av dessa patogena organismer kan driva neutrofiler över polariserade intestinala epitelmonalskikt som odlas på inverterade kollagenbelagda genomsläppliga transwellfilter. Detta experimentella system har anpassats med modifieringar för att utforska lung epitelial hinder och patogen inducerad neutrophil trans-epitelial migration18,26. Flera luftvägarna epitelial cellinjer bortsett från H292 har använts för dessa studier inklusive ofta citerade A549, BEAS-2B och Calu-3 lung epitelial cellinjer22,26. P. aeruginosa anstiftar inflammation i lungan och orsakar betydande skador som kännetecknar sjukdomar som akut lunginflammation och cystisk fibros35,36. Som beskrivits inducerar lungpatogen P. aeruginosa lätt neutrofil transeptaxiell migration vid infektion i lungepitela celler, ett anmärkningsvärt inslag i den inflammatoriska processen som observerats i lunginflammation och cystisk fibros. Dessutom har flera ytterligare stammar av P. aeruginosa inklusive kliniska isolat från cystisk fibros patienter validerats som inducerare i denna analys25. Streptokocker pneumoniae och Klebsiella pneumoniae,Gram-positiva respektive Gram-negativa bakteriella patogener, är ofta associerade med lunginflammation och har visat sig kunna inducera neutrofil trans-epitelial migration med hjälp av in vitro-kokulturmodellen 26,32. Således erbjuder detta modellsystem en robust in vitro-metod med hjälp av mänskliga härledda celler för att utforska inflammatoriska processer som initierats av slemhinnor.

Standard vävnad kultur baserade modeller som ofta används för att utforska värd patogen interaktioner använder i allmänhet epitelceller odlas på plana plastytor16. In vitro-kokulturtestet erbjuder en större grad av komplexitet som ger mångsidighet i experimentell design16,37,38. Polariserade epitelceller som odlas på undersidan av genomsläppliga transwellfilter skapar ett apatiskt fack som vetter mot bottenkammaren när de placeras i en 24-brunnsplatta och ett basolateralt fack som vetter mot den inre övre brunnen i transwell14,17. Denna diskreta uppdelning och riktningsorientering möjliggör analys av fysiologisk basolateral till apical migration av neutrofiler som svar på påtvingade eller epitelial cellgenererade kemotactic gradienter14,17,23. In vitro-kokultursystemet möjliggör undersökning av specifika molekylära mekanismer som kan hänföras till transeptaxiell migration, vilket kan vara svårt att lösa i den komplexa miljön hos en in vivo-modell av lunginfektion1,15. Alla fynd om identifiering av nyckelfaktorer som är involverade i neutrofil transeptaxiell migration med hjälp av in vitro-kokulturmodellen kan därefter valideras för relevans med hjälp av in vivo-modeller av akutlunginflammation 15,22.

In vitro-kokulturtestet kan manipuleras på många sätt för att studera en rad fenomen. Studier inriktade på bakteriegener som bidrar till neutrofilrekrytering kan utföras genom att analysera tillgängliga mutantbibliotek för specifika patogener av intresse25,39,40. Gener som avslöjas från sådan analys kan representera nya virulensfaktorer och potentiella terapeutiska mål för antiinfektiva medel. Neutrofen kan också representera analysens fokus. Till exempel använder neutrofiler flera cellytans vidhäftningsmolekyler för att underlätta transeptaxiell migration5,14,34,41,42. Viktiga cell-till-cell interaktioner kan variera beroende på kemo-attractant kör migrering och vävnaden med vilken neutrofiler interagerar34. Neutrofiler kan förbehandlas med inhibitorer, antikroppar eller antagonister innan patogeninducerad transepitela migration utvärderas för att identifiera ytmolekyler eller signalvägar som är kritiska för denna process22,34. Epitelceller spelar en avgörande roll vid infektion och inflammation genom att känna av signaler och kommunicera med immunceller genom lösliga medlare43. Signalvägar, polariserad utsöndring av kemo-attractants och epitelial yta vidhäftningsmolekyler som interagerar med antingen bakterier eller neutrofiler som påverkar patogen inducerad neutrofil transeptelial migration kan alla undersökas med hjälp av in vitro kokultur analys. Tillämpningen av denna kokultur modell visade vikten av en tidigare ouppskattad lipid eicosanoid kemo-attractant känd som hepoxilin A3,18,21. Hepoxilin A3 produceras av både lung- och tarmepitela celler som svar på infektion med specifika patogener och är ansvarig för att driva neutrofiler över det polariserade epitelmonoskiktet från basolateral till den infekterade apoliska sidan3. Således fungerar in vitro-kokulturanalysen som ett robust undersökande verktyg med potential att identifiera kritiska mekanismer som förmedlar värdpatogena interaktioner och orkestrera inflammation. Dessutom har detta modellsystem potential att anpassas som en screeningmetod med hög genomströmning för att bedöma effektiviteten hos selektiva antiinfektiva eller antiinflammatoriska terapier.

Sammanfattningsvis tillhandahåller vi ett detaljerat steg-för-steg-protokoll för att undersöka migrationen av neutrofiler över ett monolager av patogeninfekterade lungepitela celllager som odlas på genomsläppliga transwellfilter. Tekniker som beskrivs häri kan modifieras för att studera neutrofil migration över andra slemhinnor där neutrofiler infiltrerar i sjukdom stater såsom mag-tarmkanalen eller genitourinary systemet. Dessutom är insikter som erhållits med hjälp av in vitro-kokulturanalyssystemet sannolikt relevanta för ett brett spektrum av inflammatoriska sjukdomar som inte drivs av specifika smittämnen. Inflammatoriska sjukdomar i slemhinnorna som har neutrofiler som korsar den skyddande epitelbarriären i patologisk grad inkluderar KOL, ARDS, astma och IBD5,10-12. En djupare förståelse av de molekylära mekanismer som styr neutrofil transepitela migration kommer sannolikt att informera terapeutiska strategier inriktade på att lindra destruktiva inflammatoriska processer i samband med dessa vanliga sjukdomar, vilket ger nya vägar för att förbättra människors hälsa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes ekonomiskt av NIH (1 R01 AI095338-01A1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NCl-H292 cells ATCC CRL-1848
RPMI-1640 medium ATCC 30-2001
Pseudomonas aeruginosa PAO1 ATCC #47085
Escherichia coli MC1000 ATCC #39531
D-PBS (1x) liquid Invitrogen 14190-144 without calcium and magnesium
Heat Inactivated Fetal bovine serum Invitrogen 10082-147 10% added to culture medium
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-122 100x: 10,000 units of penicillin and 10,000 µg of streptomycin per ml.
Trypsin-EDTA (0.05%) Invitrogen 25300-062 50 ml aliquots are stored frozen at -20 ºC.  Aliquot in use can be stored at 4 ºC short-term.  
Hank's Balanced Salt Solution - HBSS(-) Invitrogen 14175-079 Sterile, without calcium and magnesium
Trypan Blue Solution Invitrogen 15250-061. Stock = 0.4%
Collagen, Rat Tail Invitrogen A10483-01 Can also be isolated in the laboratory directly from the tails of rats using standard protocols
Citric acid Sigma-Aldrich C1909-500G Component of 1 M citrate buffer and acid citrate dextrose (ACD) solution
Sodium Citrate Sigma-Aldrich S4641-500G Component of 1 M citrate buffer
Dextrose anhydrous Sigma-Aldrich D8066-250G Component of acid citrate dextrose (ACD) solution
Ammonium Chloride Sigma-Aldrich 213330-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
EDTA Sigma-Aldrich ED-100G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
HBSS(+) powder Sigma-Aldrich H1387-10L Key component of HBSS+
HEPES Sigma-Aldrich H3375-500G Component of HBSS+
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-25ML Follow vendor instructions to coat glass pipette tips
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) Sigma-Aldrich A9941-50TAB Key component of ABTS substrate solution
30% Hydrogen Peroxide Solution Sigma-Aldrich H1009-100ML Component of ABTS substrate solution
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP or fMLF) Sigma-Aldrich F-3506 A Stock solution of 10 mM in DMSO should be prepared and aliquots stored at -20 ºC.
Gelatin Type B Fisher Scientific M-12026
Pseudomonas isolation agar  Fisher Scientific DF0927-17-1 Follow manufacturer’s instructions to make PIA plates
Ficoll-Paque PLUS  Fisher Scientific 45-001-749 Optional, can improve neutrophil purity
24-well migration plate Corning Incorporated #3524
24-well wash plate Falcon 35-1147 Can be reused if soaked in 70% ethanol and washed thoroughly prior to reuse
96-well plate Fisher Scientific #12565501
Transwell Permeable Supports  Corning Incorporated #3415 Polycarbonate; Diameter: 6.5 mm; Growth area: 0.33 cm2; Dish style: 24-well plate; Pore size: 3.0 µm
Petri dish Falcon 35-1013 Each Petri dish holds 24 inverted 0.33 cm2 Transwells.  
500 ml 0.2 μm filter / flask Fisher Scientific 09-740-25A To sterilize acid citrate dextrose (ACD) solution
5-3/4 in glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20A Coat tips with Sigmacote prior to use
Hemostat Fisher Scientific 13-812-14 Curved, Serrated
Invertoskop Inverted Microscope Zeiss #342222
Versa-Max Microplate Reader Molecular Devices #432789

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung. Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).
  2. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats. Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).
  3. McCormick, B. A. Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator. FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).
  4. Mumy, K. L., McCormick, B. A. The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).
  5. Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
  6. Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. The paradox of the neutrophil's role in tissue injury. J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).
  7. Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).
  8. Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration. Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).
  9. Kohler, H., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).
  10. Gane, J., Stockley, R. Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD. Thorax. 67, 553-561 (2012).
  11. Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol. Med. 17, 293-307 (2011).
  12. Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. Neutrophilic inflammation in severe asthma. Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).
  13. Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. Mechanisms of neutrophil transendothelial migration. Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).
  14. Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).
  15. Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).
  16. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium. Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).
  17. Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
  18. Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3. J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).
  19. McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils. J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).
  20. McCormick, B. A., et al. Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils. J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).
  21. Mrsny, R. J., et al. Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).
  22. Tamang, D. L., et al. Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers. J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).
  23. McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium. J. Immunol. 160, 455-466 (1998).
  24. Boll, E. J., et al. Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway. Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).
  25. Hurley, B. P., et al. The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells. Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).
  26. Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).
  27. McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium. Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).
  28. Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils. Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).
  29. Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection. Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).
  30. Pazos, M., et al. Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3. J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).
  31. Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
  32. Bhowmick, R., et al. Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation. J. Immunol. , (2013).
  33. Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).
  34. Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration. Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).
  35. Frank, D. W. Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions. Front. Microbiol. 3, 20 (2012).
  36. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Lung infections associated with cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).
  37. Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium. Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).
  38. Kierbel, A., et al. Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane. J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).
  39. Lee, C. A., et al. A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).
  40. Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein. Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).
  41. Brazil, J. C., et al. Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface. J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).
  42. Lawrence, D. W., et al. Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia. J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).
  43. Hodges, K., Hecht, G. Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response. J. Physiol. 590, 433-440 (2012).

Tags

Infektion utgåva 83 cellbiologi epitel neutrofiler Pseudomonas aeruginosa,luftvägssjukdomar neutrofiler epitelbarriärer patogener transmigration
<em>In vitro</em> Kokulturanalys för att bedöma patogeninducerad neutrofil transeptelmigration
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kusek, M. E., Pazos, M. A., Pirzai,… More

Kusek, M. E., Pazos, M. A., Pirzai, W., Hurley, B. P. In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration. J. Vis. Exp. (83), e50823, doi:10.3791/50823 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter