Summary
在这里，我们将介绍如何执行路西法黄色的单细胞显微注射可视化在活细胞通过缝隙连接处蜂窝通信，并提供一些有用的提示。我们希望本文可以帮助大家来评估细胞耦合程度由于功能间隙连接。这里所描述的一切可能的，在原则上，适合于与低于1,000道尔顿分子量其它荧光染料。
Introduction
间隙连接是细胞间的通道，使相邻小区间1的互通。该通信连接的两个或更多个相邻小区，其中，每一个与一个连接子或半通道有助于形成细胞间通道。在哺乳动物细胞中，所述连接子由六个连接蛋白，单体与细胞质2内4个跨膜结构域和C和N末端形成。间隙连接不仅允许离子，第二信使和小的代谢物的流动，同时也有助于在许多生理过程许多形式的蜂窝通信，诸如突触传递，心脏收缩，细胞生长和分化3，4，5，6， 7，8。除了间隙连接已与相关联许多疾病，包括癌症9，10，肌萎缩11，某些遗传性疾病和脱髓鞘疾病12。
这种类型的细胞间的串扰可以通过多种方法13，14，15，16进行评估。在本文中，我们将展示如何执行路西法黄色的单细胞显微注射可视化在活细胞通过缝隙连接处蜂窝通信。我们将讨论如何准备细胞和微量的显微的使用情况和萤光黄染料在胸腺上皮细胞系的注入。一般，此实验过程可以由平均连接的单元向装有染料的细胞进行分析。此外，这种方法可与该间隙下方分子量其他荧光染料被用于路口切断这大约是1000道尔顿。
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Protocol
1.细胞的制备
- 保持胸腺上皮细胞系（IT76M1）或细胞的培养，以在培养箱进行测试（37℃/ 5％CO 2）。
- 用PBS洗涤1X细胞（重复此项目3倍）。
- 添加胰蛋白酶到细胞5分钟。
- 添加培养基（两次胰蛋白酶的项1.3添加的量的）有10％FBS（胎牛血清）与胰蛋白酶和离心机（800×g离心5分钟）的细胞。
- 算在血球细胞。
- 根据细胞类型的细胞具有在彼此紧密接触，以允许耦合调节细胞的密度。注：在我们的例子中，我们使用，有35毫米的培养皿3×10 5个细胞。
2，微管的制备
- 如从玻璃毛细管微量（直径为1.5mm）至最终为0.2μm直径的规定拉出微量以便达到大约30兆欧的最终电阻F“> 17,18。
注：另外，注射吸管就可以买到。的电阻依赖于细胞大小，例如更高的电阻微小电极将是必要的胰腺腺泡细胞，例如（100-150MΩ）19。可能出现的一个共同问题是萤光黄溶液然后可以妨碍微管，并且可能需要先过滤或离心沉淀。注射前，将微管应该在显微镜下进行分析，以检测是否存在障碍物或任何类型的中断13。微量可以通过用生理盐水溶液内的微量移液器尖端注入LY进行测试。
3.测试的微
- 准备在150毫摩尔/升的LiCl的萤光黄溶液（5％），并加载使用注射器微量或回填（投入它LY溶液）。
- 放置微管TTE在35毫米培养皿显微注射工作站上的IT76M1细胞和淹没玻璃微尖到细胞培养基。专注于微管，并通过施加脉冲进行的染料流出试验。
4.单细胞荧光黄显微注射
- 聚焦显微镜正确使用高放大倍数（40X）的细胞层上面，然后慢慢放下吸管使用显微细胞。
- 穿刺目标小区当尖端足够接近触摸细胞膜，并应用一个小极化脉冲引入LY到细胞中。所施加的电压将依赖于净电荷的染料被注入。或者，一些其它染料可以与本技术一起使用如表1所示。
注意：在原则上兆瓦任何亲水染料小于可以用来1KDa。然而，传输速率可以根据体重和亲水性变化。此外，U所使用的染料的nspecific转移必须进行评估。 - 捕获细胞图像染料注射后3分钟，或做一个小电影时间的推移显微镜（每秒30帧）。
注：类似的方法可以在瞳等人（2015）20中可以看出。为了避免如图2由间桥通信（不完全有丝分裂），罗丹明葡聚糖（从2到10千道尔顿），它不穿过间隙连接而是通过建议间桥和某些类型的纳米管组成的共注射。
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Representative Results
胸腺上皮细胞系IT-76MI用于通过缝隙连接来评估染料耦合，因为这些细胞被描述来表达连接蛋白43 21形成功能性缝隙连接。图1示出了当在吸液管的尖端下方的一个小区施加萤光黄的注入。几分钟后，连接的电池变成指示荧光染料通过间隙连接的扩散荧光（星号）。细胞和时间成为荧光的数量直接与这些细胞中的蜂窝通信的程度相关联。 图2示出LY的胸腺上皮细胞的注射和插入件（插入d）示LY和罗丹明葡聚糖（10KDa）的共注射。如预期的那样LY传递到相邻小区，尽管若丹明葡聚糖不其分子量高，因为。此外，GJ阻塞的存在（插入f）中，辛醇，一个BLOcked染料到周围细胞的通过。另外，可以评估一个特定的细胞或药物对GJ的功能的影响的耦合度。图3A示出LY的了TEC细胞有或无地塞米松的注入。然后100细胞注射，在地塞米松存在下和1或2个细胞进行通信的百分率是相对于无药物对照相似。然而相比，控制时3或4个细胞进行通信的数量较高。五个或6个细胞和7或8细胞与地塞米松存在下GJ通信中的控制，没有观察到，因此表明塞米松增加耦合了TEC细胞的程度。
图1：荧光黄注射液在IT-76MI细胞。 （A）中的微量接近细胞膜。 （B （C）的测试脉冲来验证电极是否实际注入的染料。 （D）的移液器触摸细胞膜和它被充电与萤光黄染料。 （E）的充电的电池允许染料通过间隙连接传递到至少五个相邻小区（由箭头指示），X20。 F）数码变焦做是为了能够更好地可视化。星号指出的对比度相显微镜（图1A）中加入该细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：荧光黄注射胸腺上皮细胞（TEC）。相衬和荧光显微镜。 （A B）人类胸腺上皮细胞。 （C和D）胸腺细胞护士分别为（E和F）的小鼠胸腺上皮细胞系。 （D）中插入表示罗丹明-葡聚糖10KDa的注射（通过间隙连接不透）之后的相同的细胞（箭头）。在（E）和（F）的插入件显示没有在TEC符合辛醇为1mM（间隙连接阻断剂）10分钟预处理染料的转移。在所有面板星号标记注射细胞。 （AF）×200从阿尔维斯等人转载。 ，1995年5。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：缝隙连接交流沟通n的大鼠上皮细胞系增加了地塞米松。 TEC分别用1μM地塞米松治疗，和耦合程度是由荧光黄染料转移测定法进行评估。 （A）的显微字段（相衬和荧光，分别在左，右面板）描绘了注射细胞和那些当LY注射（倍率320X），该偶合。在所有面板星号标记注射细胞。 （B）的直方图表示控制和地塞米松处理的细胞的耦合的图案。该分析包括每组100显微注射的。从阿尔维斯等人，2000年23再现。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 染料 | MW | 激发/发射 |
| 羟基香豆素羧酸 | 206 | 488分之386 |
| 钙黄绿蓝 | 321 | 四百四十九分之三百六十○ |
| 4'，6-二脒基-2-苯基二盐酸盐 | 279种 | 461分之358 |
| 羧基 | 376 | 517分之492 |
| 碘化乙锭（溴） | 314 | 六百〇五分之五百一十八 |
| 荧光黄CH | 443 | 536分之428 |
| 的Alexa Fluor 488 | 570.5 | 519分之495 |
| 钙黄绿素 | 622 | 517分之494 |
| 碘化 | 414 | 617分之535 |
表1：染料目前用于显微注射实验。在这里，一些用于与分子量和激发/发射波长染料。
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Discussion
为了验证功能间的间隙连接的情况下，使用示踪剂，这是膜不可渗透的，尽管由间通道可渗透需要16。荧光素，所述第一荧光染料来观察细胞至细胞耦合22，是非交界膜3之间可渗透并因此被荧光黄染料15取代的。目前，要找到许多不同类型的荧光示踪剂之间的最佳选择取决于范围和实验条件。用荧光染料小区负载的过程允许形态学的评价中，单个细胞的功能和细胞之间转移的动力学速率。此外，染料显微注射可以更好地了解细胞21，23之间的间隙连接的生理作用，因为C的程度ellular通信与耦合单元的数量有关。
几个关键因素是成功获取显微注射的数据是至关重要的。正常细胞稳态和完整性必须保持，因而一个短的喷射时间（<1秒）染料并用显微注射技术专长的是必要的。在得到一个更好的分辨率的拍摄图像的关键因素是有一个冷却的CCD照相机中，代替荧光过滤器和使用高NA物镜14。 1）推荐使用网格细胞培养皿来可视化的特定注入细胞，也玻璃底菜应该用于高分辨率显微镜应用;：此外，作为一些提示可能是有益的2）建议开始前，显微注射，以10-20拉针; 3）根据电极尖端的电阻可以通过触摸枪头入染料溶液是非常有用的，采用毛细作用装载微量与染料; 4）就没有必要加载吸管的全身，几微升填充尖端和2〜3毫米以上的尖端就足够了; 5）用较少的放大镜头开始实验和尝试看看吸管城墙的影子。之后，移动至吸管尽可能接近和触摸细胞之前，转移到更高放大倍数的物镜，例如40倍或更高; 6）一些团体使用气动微量。气动喷射不是最好的选择，因为它是不准确的，可能注入未知卷;用脉冲的协议可以被标准化，以注入染料的已知体积。此外，建议注入因为深度的胞质溶胶上方的膜;注射细胞核上方的膜会造成人身伤害，并影响细胞生理学。最后，是不是太扁平细胞超过平坦那些最好。
总之，这种方法是有效的通过间隙连接，但需要研究细胞间通讯专业知识/经验和良好的材料和设备，以获得高质量的数据。我们希望这篇文章和视频帮助初学者理解和执行这种技术。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lucifer yellow | Sigma | L0259 | |
| Lithium Chloride | Sigma | L4408 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417 | |
| RPMI | Sigma | R4130 | |
| Bovine fetal serum | Cultilab | ||
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| vibration-insulated table | Newport | VH3036W-OPT | A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage |
| Micromanipulator | Narishige | MMO-203 | This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection. |
| Current Generator | Digitimer | DS2 | To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations. |
References
- Bennett, M. V., et al. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6 (3), 305-320 (1991).
- Orellana, J. A., Martinez, A. D., Retamal, M. A. Gap junction channels and hemichannels in the CNS: Regulation by signaling molecules. Neuropharmacology. , (2013).
- Peracchia, C. Structural correlates of gap junction permeation. Int Rev Cytol. 66, 81-146 (1980).
- Loewenstein, W. R. Junctional intercellular communication and the control of growth. Biochim Biophys Acta. 560 (1), 1-65 (1979).
- Alves, L. A., et al. Functional gap junctions in thymic epithelial cells are formed by connexin 43. Eur.J Immunol. 25 (2), 431-437 (1995).
- Alves, L. A., et al. Are there functional gap junctions or junctional hemichannels in macrophages? Blood. 88 (1), 328-334 (1996).
- Fonseca, P. C., et al. Characterization of connexin 30.3 and 43 in thymocytes. Immunology letters. 94 (1-2), 65-75 (2004).
- Nihei, O. K., et al. Modulatory effects of cAMP and PKC activation on gap junctional intercellular communication among thymic epithelial cells. BMC Cell Biol. 11, 3 (2010).
- Czyz, J., Szpak, K., Madeja, Z. The role of connexins in prostate cancer promotion and progression. Nat Rev Urol. 9 (5), 274-282 (2012).
- El-Saghir, J. A., El-Habre, E. T., El-Sabban, M. E., Talhouk, R. S. Connexins: a junctional crossroad to breast cancer. Int J Dev Biol. 55 (7-9), 773-780 (2011).
- Cea, L. A., et al. Connexin- and pannexin-based channels in normal skeletal muscles and their possible role in muscle atrophy. J Membr Biol. 245 (8), 423-436 (2012).
- Cotrina, M. L., Nedergaard, M. Brain connexins in demyelinating diseases: therapeutic potential of glial targets. Brain Res. 1487, 61-68 (2012).
- Park, H. an-A., R, S., Khanna, S. avita, Sen, C. handan K. Current Technologies in Single-Cell Microinjection and Application to Study Signal Transduction. Methods in Redox Signaling. , Chapter 10 (2010).
- Abbaci, M., Barberi-Heyob, M., Blondel, W., Guillemin, F., Didelon, J. Advantages and limitations of commonly used methods to assay the molecular permeability of gap junctional intercellular communication. Biotechniques. 45 (1), 33-52 (2008).
- Stewart, W. W. Functional connections between cells as revealed by dye-coupling with a highly fluorescent naphthalimide tracer. Cell. 14 (3), 741-759 (1978).
- Meda, P. Probing the function of connexin channels in primary tissues. Methods. 20 (2), 232-244 (2000).
- Klaunig, J. E., Shi, Y. Assessment of gap junctional intercellular communication. Curr Protoc Toxicol. , Chapter 2 Unit2 17 (2009).
- Hanani, M. Lucifer yellow - an angel rather than the devil. J Cell Mol Med. 16 (1), 22-31 (2012).
- Orci, L., Biochemistry, C. Blockage of Cell-to-Cell Communication within Pancreatic Acini Is Associated with Increased Basal Release of Amylase Materials and Methods Preparation of Acini. Cell. 103 (August), 475-483 (1986).
- Hitomi, M., et al. Differential connexin function enhances self-renewal in glioblastoma. Cell Rep. 11 (7), 1031-1042 (2015).
- Nihei, O. K., Campos de Carvalho,, C, A., Spray, D. C., Savino, W., Alves, L. A. A novel form of cellular communication among thymic epithelial cells: intercellular calcium wave propagation. Am J Physiol Cell Physiol. 285 (5), C1304-C1313 (2003).
- Kanno, Y., Loewenstein, W. R.
- Alves, L. A., Nihei, O. K., Fonseca, P. C., Carvalho, A. C., Savino, W. Gap junction modulation by extracellular signaling molecules: the thymus model. Braz J Med Biol Res. 33 (4), 457-465 (2000).
