Summary
Descrevemos aqui como executar uma microinjeção de uma única célula de Lucifer Yellow visualizar comunicação celular via gap-junções em células vivas, e fornecer algumas dicas úteis. Esperamos que este trabalho irá ajudar a todos para avaliar o grau de acoplamento celular devido à junções comunicantes funcionais. Tudo o descrito aqui pode ser, em princípio, adaptado para outros corantes fluorescentes com peso molecular inferior a 1.000 Daltons.
Introduction
As junções de hiato são canais intercelulares que permitem a intercomunicação entre células vizinhas 1. Esta comunicação conecta duas ou mais células vizinhas, onde cada um contribui com um connexon ou hemichannel para formar o canal intercelular. Em células de mamíferos, o connexon é formado por seis conexinas, monómeros com quatro domínios transmembranares e um terminal de C e N dentro do citoplasma 2. As junções de hiato não só permitir o fluxo de iões, segundos mensageiros e pequenos metabolitos, mas também contribuir para muitas formas de comunicação celular em muitos processos fisiológicos, tais como a transmissão sináptica, a contracção cardíaca, crescimento e diferenciação celular 3, 4, 5, 6, 7, 8. Além disso as junções de hiato foram associados commuitas doenças incluindo cancro 9, 10, 11, atrofia muscular, algumas doenças genéticas e doenças desmielinizantes 12.
Este tipo de interferência intercelular pode ser avaliada através de vários métodos 13, 14, 15, 16. Neste artigo, vamos mostrar como realizar uma microinjeção de uma única célula de Lucifer Yellow visualizar comunicação celular via gap-junções em células vivas. Discute-se como preparar as células e a micropipeta, a utilização do micromanipulador e a injecção do corante Amarelo Lúcifer em uma linha de células epiteliais do timo. Normalmente, este procedimento experimental poderia ser analisados pela média de células ligadas à célula carregado com corante. Além disso, este método pode ser usado com outros corantes fluorescentes com peso molecular inferior a lacunajunções de corte, que é cerca de 1.000 daltons.
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Protocol
1. Preparação de células
- Manter uma cultura de uma linha celular epitelial tímica (IT76M1) ou célula a ser testada numa incubadora (37 ° C / 5% de CO 2).
- Lave as células com PBS 1x (repetir este item 3x).
- Adicionar tripsina às células durante 5 min.
- Adicionar meio (o dobro do volume de tripsina adicionada no ponto 1.3) com 10% de FBS (soro fetal bovino) para as células com tripsina e centrifugação (800 xg durante 5 min).
- Contar as células num hemocitómetro.
- Ajustar a densidade de células de acordo com o tipo de células como as células têm que estar em estreito contacto umas com as outras para permitir o acoplamento. Nota: No nosso caso, usamos 3 x 10 5 células por 35 milímetros placa de Petri.
2. Preparação Micropipeta
- Puxar a micropipeta, conforme especificado a partir de uma micropipeta capilar de vidro (1,5 mm de diâmetro) para uma final de 0,2 um de diâmetro de modo a atingir uma resistência final de aproximadamente 30 mohmsf "> 17, 18.
NOTA: Alternativamente, as pipetas de injecção pode ser comprado. A resistência depende do tamanho da célula, por exemplo, seria necessário para células acinares pancreáticas um microeléctrodo resistência mais elevada, por exemplo (100-150 mohms) 19. Um problema comum é que pode ocorrer a precipitação da solução amarelo Lucifer, que pode, em seguida, obstruir a micropipeta e pode necessitar de filtração ou centrifugação antes. Antes da injecção, a micropipeta devem ser analisadas sob o microscópio para detectar se existe uma obstrução ou qualquer tipo de interrupção 13. A micropipeta pode ser testada através da injecção de LY com a ponta da micropipeta dentro de uma solução salina.
3. Teste a micropipeta
- Preparar a solução de Amarelo Lúcifer (5%) em 150 mmol / L de LiCl e carregar a micropipeta com uma seringa ou por enchimento (colocar nele LY solução).
- Coloque a micropipette ao longo de 35 mm placa de Petri com as células IT76M1 na estação de trabalho microinjecção e submergir a ponta da micropipeta de vidro para o meio celular. Concentre-se na micropipeta e executar um teste de corante fluindo através da aplicação de um pulso.
4. uma única célula Lucifer Yellow Microinjeção
- Concentre-se o microscópio logo acima da camada de células usando um grande aumento fi cação (40X) e desça lentamente a pipeta para as células usando o micromanipulador.
- Perfurar a célula alvo quando a ponta está perto o suficiente para tocar a membrana celular, e aplique uma pequena pulsação de hiperpolarização para introduzir o LY na célula. A tensão aplicada dependerá da carga líquida do corante a ser injectada. Alternativamente, alguns outros corantes podem ser usados com esta técnica, como mostrado na Tabela 1.
Nota: Em princípio, qualquer corante hidrofílico com um PM inferior a 1 kDa poderia ser usada. No entanto, a taxa de transferência pode variar de acordo com o peso e hidrofilicidade. Além disso, utransferência nspecific do corante utilizado deve ser avaliada. - Capturar imagens de células 3 min após a injeção de corante ou fazer um pequeno filme com microscopia de lapso de tempo (30 fps).
NOTA: Uma abordagem semelhante pode ser visto na Hitomi et al (2015) 20. Para evitar a comunicação por pontes intercelulares (mitose incompleto), um co-injecção de dextrano rodamina (de 2 a 10 kDa), que não passa através de junções de hiato, mas passa através de pontes intercelulares e certos tipos de nanotubules é recomendada como mostrado na Figura 2 .
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Representative Results
Tímico linha celular epitelial de TI-76MI foram usadas para avaliar corante de acoplamento por junções de hiato como estas células foram descritos para expressar junções de hiato funcionais formados por conexina 43 21. A Figura 1 mostra a injecção de Amarelo Lúcifer quando aplicado na uma célula abaixo da ponta da pipeta. Após alguns minutos, as células tornam-se ligados fluorescente (asteriscos), indicando a difusão do corante fluorescente através das junções de hiato. O número de células e tornou-se o tempo para fluorescente está directamente relacionado com o grau de comunicação celular entre estas células. A Figura 2 mostra a injecção de LY em células epiteliais tímicas e as inserções (inserção d) mostram a co-injecção de LY e Rodamina Dextrano (10 kDa). Como esperado, a LY passa para uma célula vizinha, embora a Rodamina dextrano não por causa do seu elevado peso molecular. Além disso, a presença de um bloqueador GJ (pastilha F), octanol, blocked a passagem do corante para as células circundantes. Alternativamente, pode-se avaliar o grau de acoplamento de uma célula específica, ou o efeito de uma droga sobre a função de GJ. A Figura 3A mostra a injecção de células LY em TEC com ou sem dexametasona. Em seguida, as células 100 foram injectados, na presença de dexametasona e a percentagem de células de 1 ou 2 comunicando foi semelhante em relação ao controlo sem o fármaco. No entanto, o número de 3 ou 4 células se comunicam foi maior quando comparado ao grupo controle. Cinco ou 6 células e 7 ou 8 com células de comunicação GJ na presença de dexametasona não foi observado no controlo, indicando assim que a dexametasona aumentou o grau de acoplamento em células de TEC.
Figura 1: Lucifer injecção amarela em células IT-76MI. (A) A micropipeta perto da membrana celular. (B (C) um pulso de teste foi gerado para verificar se o eléctrodo é na verdade, injectando o corante. (D) A pipeta tocou a membrana celular e foi acusado de Lucifer corante amarelo. (E) A célula carregada permitido o corante a passar através de junções de, pelo menos, cinco células vizinhas (indicado pelas setas), X20. F) Um zoom digital foi feito para permitir uma melhor visualização. Os asteriscos indicam as células que foram carregadas na microscopia de contraste de fase (Figura 1A). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Lucifer injecção amarela em células epiteliais do timo (TEC). O contraste de fase e microscopia de fluorescência. (A B) de células humanas epiteliais tímicos. (C e D) da enfermeira tímico celular, (E e F) Uma linha de células de rato epitelial tímico, respectivamente. A pastilha em (D) mostra a mesma célula (seta) após uma injecção de 10 kDa rodamina-dextrano (não permeável através de junções de hiato). Os insertos em (E) e (F) mostram a ausência de transferência de corante na linha TEC pré-tratados com octanol 1 mM (um intervalo de junção bloqueador) durante 10 min. Em todos os painéis asteriscos marcam as células injetadas. (AF) X 200. Reproduzido de Alves et al. , 1995 5. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Gap junção communication aumentou dexametasona numa linha celular epitelial de rato. TCE foram tratados com dexametasona 1 | iM, e o grau de ligação foi avaliada pelo ensaio de transferência de corante Amarelo Lúcifer. (A) (campos Microscopia de contraste de fase e de fluorescência, respectivamente, nos painéis esquerdo e direito) que descrevem a célula injectada e aqueles que foram acoplados quando LY foi injectado (320x). Em todos os painéis asteriscos marcam as células injetadas. (B) Os histogramas mostrando o padrão de acoplamento de controlo e as células tratadas com dexametasona. A análise é composta por 100 microinjeções por grupo. Reproduzido de Alves et al., 2000 23. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| CORANTE | MW | Excitação / emissão |
| ácido carboxílico hidroxicumarina | 206 | 386/488 |
| azul calceína | 321 | 360/449 |
| 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole dicloridrato | 279 | 358/461 |
| carboxifluoresce�a | 376 | 492/517 |
| iodeto de etídio (brometo) | 314 | 518/605 |
| Amarelo Lucifer CH | 443 | 428/536 |
| Alexa Fluor 488 | 570,5 | 495/519 |
| calceína | 622 | 494/517 |
| iodeto de propídio | 414 | 535/617 |
Tabela 1: Corantes actualmente utilizado para experiências de microinjecção. Aqui em,alguns corantes usados com peso molecular e o comprimento de onda de excitação / emissão.
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Discussion
A fim de verificar a presença de junções de hiato funcionais intercelular, a utilização de marcadores, que são membrana impermeável, embora permeável por meio de canais intercelulares são necessários 16. Fluoresceína, o primeiro corante fluorescente para observar célula-a-célula de acoplamento 22, é permeável entre membranas não juncionais 3 e, por conseguinte, tem sido substituído por Lúcifer corante Amarelo 15. Atualmente, para encontrar a melhor escolha entre os muitos tipos diferentes de marcadores fluorescentes depende do escopo e condições do experimento. O procedimento de carregamento de células com corantes fluorescentes possibilita a avaliação da morfologia, a função de células individuais e a taxa de cinética de transferência entre as células. Além disso, microinjecção corante permite uma melhor compreensão do papel fisiológico das junções de hiato entre as células 21, 23, uma vez que o grau de Cellular comunicação está relacionada com o número de células acopladas.
Vários fatores-chave são cruciais para a obtenção de dados com sucesso microinjeção. homeostase celular normal e integridade deve ser mantida, portanto, um tempo de injeção curto (<1 s) de corante e conhecimentos técnicos com microinjeção é necessário. Fatores-chave para obter uma melhor resolução das imagens capturadas é ter uma câmera CCD refrigerado, os filtros de fluorescência no lugar e o uso de um alto objetivo NA 14. Além disso, algumas pontas poderiam ser úteis como: 1) placas de cultura celular com grades são recomendados para visualizar uma célula injectada particular, também pratos de vidro de fundo deve ser utilizado para aplicações de microscopia de alta resolução; 2) é recomendado para fazer 10-20 agulhas puxadas antes de iniciar microinjeções; 3), dependendo da resistência da ponta do eléctrodo pode ser muito útil, o carregamento da micropipeta com o corante utilizando capilaridade tocando a ponta da pipeta na solução corante; 4) não é necessário para carregar todo o corpo da pipeta, alguns microlitros para encher a ponta e 2 a 3 mm acima da ponta é suficiente; 5) iniciar a experiência com uma lente menos ampliada e tentar ver a sombra das paredes pipeta. Em seguida, mover a pipeta tão próximo quanto possível antes de tocar e a célula, mudar para o objectivo maior ampliação, tais como 40x ou maior; 6) Alguns grupos usar um microinjector pneumático. injeção pneumática não é a melhor escolha, pois não é preciso e pode injetar volumes desconhecidos; com um impulso o protocolo pode ser padronizado para injectar um volume conhecido de corante. Além disso, recomenda-se a injectar dentro da membrana acima do citosol por causa da profundidade; injeção na membrana acima do núcleo poderia prejudicá-lo e afetar a fisiologia celular. Finalmente, as células que não são muito plana são preferíveis sobre os planos.
Em resumo, este método é eficaz para estudar a comunicação intercelular por junções de hiato, mas precisas especialização / experiência e bom material e equipamento para obter dados de alta qualidade. Esperamos que este artigo e ajuda vídeo iniciantes para entender e executar esta técnica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lucifer yellow | Sigma | L0259 | |
| Lithium Chloride | Sigma | L4408 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417 | |
| RPMI | Sigma | R4130 | |
| Bovine fetal serum | Cultilab | ||
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| vibration-insulated table | Newport | VH3036W-OPT | A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage |
| Micromanipulator | Narishige | MMO-203 | This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection. |
| Current Generator | Digitimer | DS2 | To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations. |
References
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