Summary
Mikroinjektion er en almindelig teknik, der anvendes til at levere DNA-konstruktioner, mRNA'er, morpholino antisense-oligonucleotider eller andre behandlinger i æg, embryoner, og celler fra forskellige arter.
Abstract
Mikroinjektion i celler og embryoer er en almindelig teknik, der anvendes til at studere en bred vifte af biologiske processer. I denne fremgangsmåde en lille mængde af behandlingsopløsningen er indlæst i en mikroinjektion kanyle, der anvendes til fysisk at injicere individuelle immobiliserede celler eller embryoner. Trods behovet for indledende uddannelse til at udføre denne procedure for high-throughput levering, mikroinjektion giver maksimal effektivitet og reproducerbar afgivelse af en bred vifte af behandling løsninger (herunder komplekse blandinger af prøver) i celler, æg eller embryoner. Ansøgninger til microinjections omfatter levering af DNA-konstruktioner mRNAs, rekombinante proteiner, gevinst på funktion og tab af funktion reagenser. Fluorescerende eller kolorimetrisk farvestof tilsættes til den indsprøjtede opløsning at muliggøre øjeblikkelig visualisering af effektiv levering samt et redskab til pålidelig normalisering af mængden af den leverede løsning. Den beskrevne metode giver mulighed for mikroinjektion af 100-400 Søpindsvin zygotes inden for 10-15 min.
Introduction
Effektiv og reproducerbar behandling levering er en af de vigtigste metodiske udfordringer for forskere. Der er etableret flere metoder til forbigående levere behandling løsninger ind i de æg, embryoner og celler. Disse metoder omfatter elektroporation (baseret på en genererer forbigående porer i membranen ved hjælp af korte elektriske impulser) 1,2, lipofection (levering ved fusion af behandlings-holdige liposomer med membranen) 1, mikropartikelbombardement 1 (DNA udfældes på micron mellemstore metalpartikler, der derefter bruges til at trænge ind i cellerne ved høj hastighed) og transduktion (virus anvendes som fremføringsmiddel af transgener). I øjeblikket, mikroinjektion er den eneste metode, der besidder den fordel, at der afgives en opløsning med 100% effektivitet med minimale reagenser. Desuden kan en enkelt injektion opløsning består af en kompleks blanding af behandlinger. Denne teknik har været anvendt til vellykketly microinject æg og embryoner fra talrige arter såsom søpindsvin 3,4, zebra fisk 5, mus 6, frø 7 og kvæg 8, samt enkelte celler i vævskultur 9. Enlige blastomeres injektioner på senere udviklingsstadier er også blevet gennemført 10-12.
De nuværende metoder til microinjections er baseret på tryk-injektion metode, der oprindeligt blev beskrevet af Hiramoto 10, men er blevet gjort store fremskridt i retning af en optimering af denne proces. Fremragende Mikroinjektionsteknikker er blevet beskrevet andetsteds 11, og her beskriver vi en af de konkrete metoder, der i øjeblikket anvendes til microinject søpindsvin (Strongylocentrotus purpuratus) nyligt befrugtede æg. I over et århundrede har søpindsvin været en værdifuld eksperimentel model 15,16. Søpindsvin er evolutionært tæt knyttet til chordater (inklusive os) og analyse afderes genom afslørede, at de indeholder alle de store gen familier som den menneskelige 17. De producerer et stort antal synkront udvikling af gennemsigtige embryoner, der let kan manipuleres. Brug Søpindsvin som en model organisme har søpindsvin samfund bidraget til vores forståelse af befrugtning proces 18-21, cellebiologiske processer 22-24, og de regulerende netværk gen (GRNs) 25-28.
Mikroinjektion i søpindsvin zygoter kræver flere trin. Først skal immobiliseres før injektioner (beskrevet nedenfor) æggene. Mikroinjektion retter overtrækkes med protaminsulfat (PS), som skaber et positivt ladet overflade, hvortil negativt ladede æg kan klæbe 3. Æggene dejellied ved inkubering i surt havvand (pH 5,15) i 10 minutter, efterfulgt af to vaske i naturligt havvand eller kunstigt havvand (pH 8,0). De dejellied æg er omhyggeligt roet i en lige linjei midten af PS-belagt skål i nærvær af 1 mM 3-aminotriazol (3-AT), som er nødvendig for at hæmme aktiviteten af ovoperoxidase der udskilles fra corticale granuler af ægget som et resultat af befrugtning 29. Dette trin er vigtigt for at forhindre hærdning af befrugtningen kuvert og lette mikroinjektion nål post. Som et alternativ til 1 mM 3-AT, kan 10 mM paraminobenzoic syre (PABA) anvendes. Injektionsvæsken er indlæst i en mikroinjektion nål ved hjælp af specialiserede microloading pipettespids og monteret på en holder fastgjort til mikromanipulator og trykenhed (figur 1). Hver nål kan anvendes til at microinject individuelle zygoter på flere forsøg på separate dage. Mikroinjektion kan udføres i 10-15 minutter, indtil zygoter hærde. De zygoter vaskes derefter med havvand og dyrket ved 15 ° C. Når embryonerne nå udrugning blastulaen tidspunkt de frigiver udrugning enzym, der fordøjer komponenter af fertilization kuvert 30 og give dem mulighed for at naturligt løsne sig fra PS-belagt fad. Hvis det er nødvendigt, kan embryonerne forsigtigt løsrevet fra skålen ved hjælp af en mund pipette eller Pasteur-pipette ved forsigtigt at blæse havvand på embryoner. Den beskrevne metode muliggør effektiv og pålidelig mikroinjektion af 100-400 nyligt befrugtede æg på et enkelt fad, hvilket giver en high-throughput metode til downstream analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Udarbejdelse af protaminsulfat (PS) Coated Dishes
- Klargør 1% opløsning af protaminsulfat (PS) ved tilsætning af 0,5 g PS i 50 ml deioniseret, destilleret vand (ddH2O) i en 50 ml konisk rør. Ryst godt ved høj hastighed på en bænk ryster ved stuetemperatur i 1-2 timer for at sikre fuldstændig opløsning af PS. Denne løsning kan opbevares ved 4 ° C i mindst 3 måneder (sørg for at opløse gel-lignende bundfald før hver brug) 3..
- Tag et ærme på 60 mm x 15 mm polystyren petriskåle og læg både låg og bunde på bænken.
- Hæld 1% PS opløsning i hvert fad (både bunde og låg kan bruges) lige nok til at dække overfladen, orlov i mindst 2 min. Sidesten PS opløsning kan genbruges mange gange inden for 3 måneder, når de opbevares ved 4 ° C.
- Place PS-behandlede retter i et bæger fyldt med destilleret vand (dH 2 O). Lad bægeret under rindende dH2O mindst10 min.
- PS-belagte retter kan straks eller lufttørre bruges til opbevaring. Dække dem for at forhindre ophobning af støv. De kan opbevares ved stuetemperatur i 1 måned 3.
2. Anskaf Søpindsvin Mælke og immobilisere Æg på en PS-belagt Fad til Mikroinjektion
- Spawn søpindsvin ved at ryste eller intracoelomic injektion af op til 1 ml 0,5% KCl at fremkalde sammentrækning af glatte muskler til at frigive kønsceller 3 (Figur 2).
- Hvis dyret er en mand, som angivet ved den hvide farve sæd, indsamle sæd tør fra overfladen af et dyr i et 1,5 ml rør. Dry sperm kan opbevares ved 4 ° C i en uge uden betydeligt tab af biologisk funktion.
- Hvis dyret er en kvinde, som angivet af den gule farve, der skyldes æggeblomme indhold, indsamle dens gameter ved at nedsænke gonopores i et bæger fyldt med havvand. Æggene vil blive frigjort fra gonopores og slå sig ned ved hjælp af tyngdekraften. </ Li>
- Filter æg fra affald, såsom dyre spines hjælp 80 um nylon filter mesh. De bedste resultater opnås, hvis æggene anvendes inden for 5-7 timer efter æglægningen.
- Dejelly æggene:
- Forbered 100 ml surt havvand til omkring 1 ml æg. Brug 0,5 M citronsyre for at justere pH af havvand fra pH 8,0 til 5,1-5,2. For lav pH vil falde befrugtning og for høj en pH-værdi vil ikke tillade æg til at knytte til PS-plader.
- Tilsæt æg (højst 1 ml) til surt hav vand, og lad æggene at slå sig ned på is i 10 min. Alternativt kan fjernelsen af gelé coat lettes ved forsigtig skvulpen af æggene under behandlingen. Man kan effektivt dejelly S. purpuratus æg i 3-4 min på denne måde.
- Hæld forsigtigt surt havvand, tilsættes frisk havvand og lad æggene slå sig ned på is igen. Dejellied æg kan opbevares på is i op til 6 timer uden befrugtning problemer
3. Række af æg
- Klargør 1 M stamopløsning af 3-aminotriazol (3-AT, MW = 84.08) ved at opløse 0,84 g af 3-AT i 10 ml dobbeltdestilleret 2 O. Denne opløsning kan opbevares ved 4 ° C i op til 6 måneder.
- Klargør 1 mM arbejder opløsning af 3-AT ved tilsætning af 50 pi 1 M stamopløsning i 50 ml forafkølet havvand. Opløsningen opbevares på is.
- Forbered mund pipette (figur 3) til skånsom håndtering af æg:
- Pipettespids trækkes manuelt fra glas mikropipetter (100 x OD 1,09 mm). Hold mikropipette med begge hænder over åben ild. Da glasset begynder at smelte, forsigtigt trække enderne af pipetten i modsatte retninger.
- Slut den ene trak pipette til en plastslange (ID 1,14 mm), forsegle stram med Parafilm. Længden af røret skal være ca 50-70 cm.
- Indsæt en sterilfiltreret P20 eller P200 spids ved enden af røret modsat glasrøret tilanvendes som mundstykket.
- Clip enden af glas mikropipette med en saks for at justere diameteren af spidsen. Den optimale diameter lidt større end diameteren af ægget (80 um).
- Hæld 4 ml 1 mM 3-AT havvand i hvert PS-belagt skål (bund eller låg).
- Tag munden pipette, satte P20/P200 spids i munden og sikre det med tænderne. At aspirere æg, først aspireres en lille mængde af havvand. Ved at have en væskesøjle forud for lastning af æg, vil man have maksimal kontrol over munden pipetteringsteknik.
- Placer mikropipettespidsen nær æggene og forsigtigt aspireres i flere hundrede æg i pipette. Begrænse æggene i glasmikropipette.
- Række dejellied æg i en lige linje på et fad ved forsigtigt at blæse dem ud af munden pipetten, mens du flytter spidsen i en lige linje. Række æggene lige før injektioner, fordi befrugtning problemer kan opstå på grund af prolonged eksponering for 3-AT havvand 3.. Desuden kan kationiske lim som PS være giftigt for æg, og det er ikke tilrådeligt at udsætte embryoner til disse reagenser i lange perioder, især hvis befrugtning kuverter er blevet fjernet.
- Lav en ridse på fadet nær rækken af roede æg ved hjælp af en glas pipette. Denne ridse vil være vigtigt at bryde injektionsnålen at justere strømmen af opløsning efter behov. Alternativt kan bunden gøres før hælde 3-AT havvand til fadet.
4.. Mikroinjektion af søpindsvin Zygoter
- Tænd mikroinjektion station. Her beskriver vi brug af FemtoJet indsprøjtningssystem.
- Træk injektion kapillærer hjælp af en nål aftrækker. Et eksempel på en god nål er afbildet i fig. 4. Bemærk: RNA injektioner bør injektion kapillærer forbehandles for at undgå RNAase kontaminering 31:
- Placer injektion kapillærer i 50 ml koniskrør og tilsættes 50 ml filtreret methanol / HCl (9:1). Ryst godt og lad natten ikke længere end 10 timer.
- Hæld methanol / HCI og skylles kapillærer 2x med filtreret methanol i det samme rør.
- Drain methanol som meget som muligt og lyofiliseres kapillærer natten over for at sikre fuldstændig fjernelse af methanol.
- Montere forsigtigt nålen kapillarrøret på en nål lastning holder og indlæse den med <0,5 pi af en prøveopløsning ved hjælp microloader tips. Prøveopløsninger indeholder sædvanligvis 20% glycerol, afhængigt af den injicerede materiale 3.
- Sæt fadet med roede æg på mikroskopbordet (æg bør tilpasses lodret, når den ses gennem okularer) og fokusere på æggene.
- Montere forsigtigt læsset nål på nål mikroinjektion holderen og justere placeringen af nålen til at have en perfekt fokuseret spids i midten af feltet.
- Tryk på knappen for at anvende det maksimale tryk for nål rengøring. Opløsningen skal komme ud af nålen. Justere trykket om nødvendigt: indsprøjtningstryk bør være i intervallet fra 90 til 360 hPa, med kompensation tryk på cirka 1/3 af injektionstrykket.
- Juster løsning flow ved indsprøjtning i ubefrugtede æg. Ved hjælp af et joystick mikromanipulator, rette spidsen af kanylen til ubefrugtede æg. For at lette nål indrejse, skabe en svag rysten ved en let banken på scenen med en hård genstand, såsom en skruetrækker. En injektion bolus dannelse inde i ægget skal ses (figur 5).
- Hvis injektionen bolus ikke er synlig, let hæve spidsen af nålen over æggene, find ridse på fad og justere den til at blive placeret i midten af feltet. Bank forsigtigt på nålespidsen til ridsemærke at bryde spidsen af kanylen. Juster indsprøjtning og kompensationsordninger pres for at sikre, at injektionen bolus ikke overstiger 1/5 af than diameter af ægget (1-2 pm).
- Når injektionen bolus er kalibreret, befrugte æggene ved at tilsætte fortyndet sæd (1:1000), eller 1-2 ul af sperm. Bland godt forsigtigt for at undgå løsner rækken af æg.
- Start injektioner umiddelbart efter befrugtningen kuvert bliver synlig (figur 5). Flyt langs linjen af roede æg ved hjælp af scene controller og injicere så mange zygoter som muligt ved at stikke dem med nålen styres af joystick mikromanipulator.
- Efter 10-15 min, vil de nyligt befrugtede æg bliver hærdet og kan ikke injiceres længere. Tag fadet fra scenen og forsigtigt aspireres ud sperm i 3-AT havvand ved hjælp af en plastik Pasteur pipette.
- Lad ikke zygoter tørre. Hurtigt tilføje frisk forafkølet havvand til at dække fadet. Inkuber embryoner ved 15 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GFP og mCherry reporterkonstruktioner blev in vitro-transkriberet og mikroinjiceret i de nyligt befrugtede æg. Embryoer blev inkuberet ved 15 ° C i 24 timer (indtil blastulaen etape) og afbildet ved hjælp af Zeiss Observer Z1 mikroskop. Injektion af reporterkonstruktioner førte ikke til nogen udviklingsmæssige defekter (figur 6). Til kvantificering af fluorescerende signaler blev billede erhvervelse udføres ved lav forstørrelse (100X) til maksimalt optage fluorescerende pixel (figur 6D-F). Fluorescerende signaler blev kvantificeret ved hjælp AxioVision 4.8.2.0. Standardfejlene for intensiteten af fluorescerende signaler i populationen 100-200 blastulae ikke overstige 1,5% (data ikke vist).
Figur 1. Mikroinjektionen setup. (A) En PS-belagt dish med immobiliserede æg er placeret på den fase af (B) et inverteret mikroskop. Mikroinjektion nål er fastgjort til (C) en nåleholder, som er forbundet til en (D) trykenhed. Bevægelse i x-, y-og z-dimensionerne er rettet med anvendelse af (E) har en mikromanipulator eller (F) den grove manipulator. (G) En skruetrækker omviklet med papirservietter bruges til forsigtigt at trykke mikroskopbordet at fremkalde svag rysten at lette nål indrejse i den nyligt befrugtede æg.
Figur 2. Gydning af søpindsvin. (A) Søpindsvin induceres til at kaste med intracoelomic injektion af 0,5% KCl. Nålen peger til peristomial membran, der omgiver mundingen af dyret, det eneste bløde del af dyret.(B) Kvinde søpindsvin er placeret med sine gonapores nedsænket i havvand i et plastbæger til at indsamle gule æg. (C) Hvid sæd frigives fra gonapores af det mandlige søpindsvin.
Figur 3. . Mund pipette En mund pipette består af tre dele: (A) glasmikropipette nål, (B) plastslange, og (C) et sterilt filtreret P20 eller P200 spids. Den glasmikropipette indsættes i plastslanger, der er forbundet med P20 eller P200 mundstykke.
Figur 4.. Mikroinjektion nål. (A) mikroinjektion nålen er pulført under anvendelse af en nål aftrækker med en bestemt indstilling. Indstillingen af nål aftrækker skal bestemmes empirisk. Ved hjælp af en Narishege PC-10 nål aftrækker, bruger vi 72,8 ° C varme indstilling 1 og 83,7 ° C varme indstilling 2. Brug af bunden på pladen vi bryde spidsen af nålen for at lette løsning flow. (B) Den gode nålen skal have en længde på 500-600 um fra en bredde på 50 um ved skulderen til 5 um ved spidsen.
Figur 5. Injektion af de nyligt befrugtede søpindsvineæg. Dejellied æg blev roet på en PS-belagt fad og befrugtet. Nyligt befrugtede æg blev injiceret én efter én, mens bevæge objektbordet langs linien af zygoter (fra top til bund). (A) Injektion bolus ses tydeligt at danne inde i nyligt befrugtetæg på spidsen af nålen. (B) Transparent befrugtning kuvert dannes ved befrugtningen. (C) Sperm vises som små sorte prikker i baggrunden. Målestokken er 50 mM. Klik her for at se større billede.
Figur 6. Mikroinjiceret zygoter udviklet i blastulae uden udviklingsmæssige eller morfologiske defekter. Nyligt befrugtede æg blev injiceret med fluorescerende markører, som tillader dem at være klart adskilt fra de ikke-injicerede embryoner (vist med pile). (AC) Embryoner afbildet ved 400X forstørrelse. (DF) Embryoner er afbildet på 100X forstørrelse til at fange de fleste af de udsendte fluorescenssignaler for pålidelig kvantificering. Efter 24 timer pOST befrugtning, blastulae blev indsamlet og behandlet med 2x havvand i 2 min for at immobilisere svømning embryoner 3, efterfulgt af 1x havvand vask. Billederne blev optaget med Zeiss Observer Z1 mikroskop og AxioCam monochromic kamera. (A, D) DIC billeder af blastulae. (B, E) Overlay billeder af embryoner injiceret med in vitro-transskriberet mCherry i fluorescens og DIC-kanaler. (C, F) Overlay billeder af embryoner injiceret med in vitro-transskriberede GFP i fluorescens og DIC-kanaler. Målestokken er 50 mM. Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroinjektion er en kraftfuld teknik til at levere forskellige behandlinger såsom DNA, mRNA, rekombinante proteiner, tab af funktion og forstærkning funktions reagenser, farvestoffer og kombinationer i æg, embryoner, og celler af forskellige organismer 1-7. Dog bør flere overvejelser skal holdes i tankerne, når designe en mikroinjektion eksperiment.
Det er kritisk vigtigt at overveje opløseligheden af den leverede behandling og injektionsvolumen. Hvis mikroinjiceret løsning har en tendens til at danne endnu en lille bundfald vil mikroinjektion nålen være tilstoppet. Det anbefales generelt at centrifugere opløsningen i mere end 15 minutter før de lægges i nålen for at sikre eventuelt bundfald fjernes fra Løsning 3. Den anden tilgang er at passere opløsningen gennem Millipore spinkolonner. Hvis det ikke er muligt at undgå tilstopning, kan det være muligt at rense nålen ved forsigtigt at bryde spidsen igen,men det bliver svært at styre strømmen af den opløsning, hvis spidsen er for bred. Den store mængde af den injicerede opløsning kan være giftige embryonet, og desuden den brede spids indføres større variationer blandt rumfang af opløsning injiceret i individuelle embryoer. Det er også vigtigt, at mængden af indsprøjtet mængde i de nyligt befrugtede æg justeret. Den injicerede volumen kan kalibreres ved at trække nåle på forskellige indstillinger, efterfulgt af injektion af opløsningen i olien. Dette giver mulighed for måling af diameteren (og dermed volumen) af dråben 32. Vi finder, at en acceptabel mængde injektionsopløsning i den nyligt befrugtet æg ikke bør overstige 1/5 diameter zygote som vist i figur 5.
Det vigtigste råd er at indlæse nålen lige før injektion, for at arbejde hurtigt, og at ofte bruger rengøring knapfunktionen af injektoren, der udløser anvendelsen af den maksimale tilgængelige tryk til stikkontakten iFor at skylle ud blokeret kanylen.
Undertiden nålen kan tilstoppe udefra, når sæd og vragdele fra de tidligere injicerede æg holde sig til spidsen af nålen. I dette tilfælde, er det nyttigt at hæve nålen hele vejen op fra 3-AT vand i indsprøjte fad. Normalt spændinger forårsaget af væske-luft-grænsefladen er nok til at fjerne snavs. Alternativt forsigtigt børste kanylen mod ridse på injektion pladen kan også hjælpe. I det ekstreme tilfælde er det muligt at tørre spidsen af nålen med den dryppende våd Kimwipe. Men sådan aftørring kræver ekstrem forsigtighed og praksis.
Fluorescerende farvestoffer, såsom 10.000 MW Texas Red lysin opladet dextran (2 mg / ml) frembringe et stærkt signal, som kan påvises og anvendes til pålidelig normalisering af den injicerede opløsning. Når mRNA skal injiceres, anbefales det at coinject med mCherry eller GFP mRNA'er sammen med mRNA irente for at sikre, at ingen mRNA nedbrydning fandt sted. I dette tilfælde visualisering af fluorescerende signal er afhængig af oversættelsen af mCherry eller GFP. Hvis brugen af farvestoffer eller fluorescerende konstruktioner ikke er muligt, anbefales det at ro en lille mængde æg på hver enkelt fad til at sørge for, at alle de nyligt befrugtede æg på at skålen injiceres.
Konklusionen er, mikroinjektion er et værdifuldt redskab til forskning i genetik, molekylære, cellulære og udviklingsmæssige biologi. Ved at bruge denne teknik, har søpindsvin samfund gjort betydelige bidrag til vores forståelse af celle-og udviklingsmæssige biologi, såsom celle skæbne specifikation, gen-funktion, genregulering og biokemiske veje underliggende embryonale udvikling 16..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Santiago Suarez for kritisk læsning af manuskriptet og Betty Cowgill om støtte i fotografering. Vi takker også de anonyme anmeldere for deres kritisk feedback. Dette arbejde understøttes af University of Delaware Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-043 | |
| Inverted microscope Axiovert 40 °C | Zeiss | 4109431007990000 | Injection microscope |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | Load injection solution |
| Nylon filter mesh 80 μm | Amazon.com | 03-80-37 | Filter eggs to get rid of debris |
| P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips | Fisher Scientific | 02707432 or 02707430 | Part of a mouth pipette |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13 374 12 | Part of a mouth pipette |
| Polyethylene tubing | Intramedic | PE-160 | Part of a mouth pipette |
| Protamine sulfate | MP Biomedicals, LLC | 194729 | Attach dejellied eggs to injection dishes |
| Sea urchins S. purpuratus | Pt. Loma Marine Invertebrate Lab | N/A | |
| Sea water | any pet store | Instant Ocean | |
| Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | Injection dishes |
| Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 | Narishige | 9124 | Manipulate injection needle |
| Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND | Narishige | 9212 | Manipulate injection needle |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Vertical needle puller | Narishige | PC-10 | Pull injection needles |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y. Efficient Delivery of DNA and Morpholinos into Mouse Preimplantation Embryos by Electroporation. Plos One. 7, 13 (2012).
- Ettensohn, C. A., Wray, G. A., Wessel, G. M. eds. Development of sea urchins, ascidians, and other invertebrate deuterostomes: experimental approaches. 74, Elsevier Academic Press. (2004).
- Franks, R. R., Houghevans, B. R., Britten, R. J., Davidson, E. H. Direct introduction of cloned DNA into the sea urchin zygote nucleus, and fate of injected DNA. Development. 102, 287-299 (1988).
- Kinsey, W. H. Analysis of signaling pathways in zebrafish development by microinjection. Methods Mol. Biol. 518, 67-76 (2009).
- Kola, I., Sumarsono, S. H. Microinjection of in vitro transcribed RNA and antisense oligonucleotides in mouse oocytes and early embryos to study the gain- and loss-of-function of genes. Mol. Biotechnol. 6, 191-199 (1996).
- Mishina, T., Fuchimukai, K., Igarashi, K., Tashiro, K., Shiokawa, K. Modification of secondary head-forming activity of microinjected a dagger beta-catenin mRNA by co-injected spermine and spermidine in Xenopus early embryos. Amino Acids. 42, 791-801 (2012).
- O'Meara, C. M., et al. Gene silencing in bovine zygotes: siRNA transfection versus microinjection. Reprod. Fertil. Dev. 23, 534-543 (2011).
- Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z.
- Hiramoto, Y. Cell division without mitotic apparatus in sea urchin eggs. Exp. Cell Res. 11, 630-636 (1956).
- Wilson, L. Methods in Cell Biology. 25, Elsevier. (1982).
- Gross, J. M., McClay, D. R. The role of Brachyury (T) during gastrulation movements in the sea urchin Lytechinus variegatus. Dev. Biol. 239, 132-147 (2001).
- Yajima M, W. G. Autonomy in specification of primordial germ cells and their passive translocation in the sea urchin. Development. 139, 3786-3794 (2012).
- Duboc, V., et al. Nodal and BMP2/4 pattern the mesoderm and endoderm during development of the sea urchin embryo. Development. 137, 223-235 (2010).
- Ernst, S. G.
- McClay, D. R. Evolutionary crossroads in developmental biology: sea urchins. Development. 138, 2639-2648 (2011).
- Sodergren, E., et al. Research article - The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
- Roux, M. M., et al. A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation. Dev. Biol. 300, 416-433 (2006).
- Turner, P. R., Sheetz, M. P., Jaffe, L. A. Fertilization increases the polyphosphoinositide content of sea urchin eggs. Nature. 310, 414-415 (1984).
- Voronina, E., Marzluff, W. F., Wessel, G. M. Cyclin B synthesis is required for sea urchin oocyte maturation. Dev. Biol. 256, 258-275 (2003).
- Wong, J. L., Wessel, G. M. Extracellular matrix modifications at fertilization: regulation of dityrosine crosslinking by transamidation. Development. 136, 1835-1847 (2009).
- Shuster, C. B., Burgess, D. R. Transitions regulating the timing of cytokinesis in embryonic cells. Curr. Biol. 12, 854-858 (2002).
- Morris, R. L., et al. Analysis of cytoskeletal and motility proteins in the sea urchin genome assembly. Dev. Biol. 300, 219-237 (2006).
- Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of Cell Geometry on Division-Plane Positioning. Cell. 144, 414-426 (2011).
- Davidson, E. H., et al. A genomic regulatory network for development. Science. 295, 1669-1678 (2002).
- Oliveri, P., Tu, Q., Davidson, E. H. Global regulatory logic for specification of an embryonic cell lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5955-5962 (2008).
- Peter, I. S., Davidson, E. H. A gene regulatory network controlling the embryonic specification of endoderm. Nature. 474, (2011).
- Nam, J. M., Dong, P., Tarpine, R., Istrail, S., Davidson, E. H. Functional cis-regulatory genomics for systems biology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3930-3935 (2010).
- Showman, R. M., Foerder, C. A. Removal of the fertilization membrane of sea-urchin embryos employing aminotriazole. Exp. Cell Res. 120, 253-255 (1979).
- Lepage, T., Sardet, C., Gache, C. Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea-urchin embryo. Dev. Biol. 150, 23-32 (1992).
- Jaffe, L. A., Terasaki, M. Quantitative microinjection of oocytes, eggs, and embryos. Development of Sea Urchins, Ascidians, and Other Invertebrate Deuterostomes: Experimental Approaches. 74, 219-242 (2004).
