Summary
La micro-injection est une technique couramment utilisée pour fournir des constructions d'ADN, ARNm, des oligonucléotides morpholino antisens ou d'autres traitements dans les œufs, les embryons et les cellules de diverses espèces.
Abstract
La micro-injection dans des cellules et des embryons est une technique couramment utilisée pour étudier un grand nombre de processus biologiques. Dans ce procédé, une petite quantité de solution de traitement est chargée dans une aiguille de micro-injection qui est utilisée pour injecter physiquement les cellules immobilisées ou des embryons individuels. Malgré la nécessité d'une formation initiale pour effectuer cette procédure pour la livraison à haut débit, la micro-injection offre un maximum d'efficacité et de livraison reproductible d'une grande variété de solutions de traitement (y compris les mélanges complexes d'échantillons) dans les cellules, les ovules ou d'embryons. Applications aux micro-injections comprennent la livraison de constructions d'ADN, ARNm, protéines recombinantes, gain de fonction, et la perte de réactifs de fonction. Colorant fluorescent ou colorimétrique est ajouté à la solution injectée pour permettre la visualisation instantanée de la livraison efficace, ainsi que d'un outil pour la normalisation fiable de la quantité de la solution fournie. La méthode décrite permet la micro-injection de 100-400 oursin zygotes dans 10-15 min.
Introduction
L'administration du traitement efficace et reproductible est l'un des principaux défis méthodologiques pour les chercheurs. Plusieurs méthodes ont été mis en place pour fournir des solutions de traitement transitoire dans les oeufs, embryons et les cellules. Ces procédés comprennent l'électroporation (basé sur une génération de pores transitoires de la membrane à l'aide de courtes impulsions électriques) 1,2, la lipofection (livraison par la fusion de liposomes contenant au traitement avec la membrane) 1, 1 bombardement de microparticules (ADN est précipité sur le micron particules de taille métalliques qui sont ensuite utilisés pour pénétrer dans les cellules à grande vitesse), et la transduction (virus est utilisé en tant que véhicule de délivrance de transgènes). Pour le moment, la micro-injection est la seule approche qui détient l'avantage de délivrer une solution avec 100% d'efficacité avec des réactifs minimes. En outre, une solution d'injection unique peut être composée d'un mélange complexe de traitements. Cette technique a été utilisée avec succès pourment micro-injection des ovules et des embryons de nombreuses espèces tels que les oursins 3,4, poisson zèbre 5, 6 souris, grenouille 7, 8 et bovins ainsi que des cellules individuelles dans la culture de tissus 9. Blastomères simples injections à des stades de développement ultérieurs ont également été menées 10-12.
Les méthodes actuelles de micro-injections sont basés sur la méthode injection sous pression qui a été initialement décrit par Hiramoto 10, mais de grands progrès ont été accomplis en vue de l'optimisation de ce processus. D'excellentes techniques de micro-injection ont été décrites ailleurs 11, et ici nous décrire l'une des méthodes spécifiques qui sont actuellement utilisés pour micro-injection oursin (Strongylocentrotus purpuratus) des oeufs fécondés récemment. Depuis plus d'un siècle, les oursins ont été un précieux modèle expérimental 15,16. Les oursins sont étroitement liées à l'évolution, les chordés (nous y compris) et l'analyse deleur génome a révélé qu'ils contiennent toutes les grandes familles de gènes que l'homme 17. Ils produisent un grand nombre de pays en synchrone embryons transparents qui peuvent être facilement manipulées. Utilisation de l'oursin comme un organisme modèle, la communauté de l'oursin a contribué à notre compréhension du processus de la fécondation 18-21, les processus biologiques cellulaires 22-24, et les réseaux de régulation génétique (GRNS) 25-28.
Microinjection dans des zygotes d'oursins nécessite plusieurs étapes. Tout d'abord, les œufs doivent être immobilisées avant les injections (décrit ci-dessous). plats de microinjection sont revêtues avec de la protamine sulfate (PS), qui crée une surface chargée positivement à laquelle les oeufs chargés négativement peuvent adhérer 3. Les oeufs sont dejellied par incubation dans l'eau de mer acide (pH 5,15) pendant 10 min, suivie par deux lavages dans l'eau de mer naturelle ou de l'eau de mer artificielle (pH 8,0). Les œufs sont soigneusement dejellied ramé en ligne droiteau milieu du plat revêtu PS en présence de 1 mM de 3-aminotriazole (3-AT), qui est nécessaire pour inhiber l'activité de ovoperoxidase qui est sécrétée à partir des granules corticaux de l'œuf à la suite de la fécondation 29. Cette étape est importante pour empêcher le durcissement de l'enveloppe de la fécondation et de faciliter la pénétration de l'aiguille de micro-injection. Comme alternative à 1 mM 3-AT, 10 mM d'acide paraminobenzoic (PABA) peut être utilisé. La solution d'injection est chargé dans une aiguille de micro-injection en utilisant spécialisé microloading pointe de pipette et monté sur un support fixé au micromanipulateur et de l'unité de pression (figure 1). Chaque aiguille peut être utilisé pour micro-injection zygotes individuels dans de multiples expériences à des jours différents. La micro-injection peut être effectuée pendant 10-15 min jusqu'à ce que les zygotes durcissent. Les zygotes sont ensuite lavées avec de l'eau de mer et on cultive à 15 ° C. Lorsque les embryons atteignent l'éclosion blastula stade, ils libèrent une enzyme qui digère l'éclosion composantes du fertilization enveloppe 30 et leur permettent de se détacher naturellement de la PS plat revêtu. Si nécessaire, les embryons peuvent être doucement détachées de la boîte à l'aide d'une pipette de bouche ou une pipette Pasteur en soufflant doucement de l'eau de mer sur les embryons. La méthode décrite permet la micro-injection efficace et fiable de 100-400 oeufs fécondés récemment sur un plat unique, fournissant une méthode à haut débit pour les analyses en aval.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Une. Préparation de Sulfate de protamine (PS) Plats couché
- Préparer une solution à 1% de sulfate de protamine (PS) en ajoutant 0,5 g de PS à 50 ml d'eau désionisée, de l'eau distillée (FD 2 O) dans un tube conique de 50 ml. Bien agiter à grande vitesse sur un agitateur de banc à la température ambiante pendant 1-2 heures pour assurer la dissolution complète de PS. Cette solution peut être conservé à 4 ° C pendant au moins 3 mois (assurez-vous de dissoudre complètement précipité de gel avant chaque utilisation) 3.
- Prenez une douille de 60 mm x 15 mm de polystyrène boîtes de Pétri et exposer les deux couvercles et les fonds sur le banc.
- Verser la solution de PS 1% dans chaque plat (deux fonds et les couvercles peuvent être utilisés) juste assez pour couvrir la surface, laisser reposer au moins 2 min. La solution de PS de restes peut être réutilisé de nombreuses fois dans les 3 mois lorsqu'elle est stockée à 4 ° C.
- Lieu plats PS-traitée dans un bécher rempli d'eau distillée (dH 2 O). Laisser le bécher sous courant dH 2 O pendant au moins10 min.
- PS-plats revêtus peuvent être utilisés immédiatement ou de l'air sec pendant le stockage. Couvrez-les pour éviter l'accumulation de poussière. Ils peuvent être stockés à température ambiante pendant 1 mois 3.
2. Obtenir oursins gamètes et immobiliser les oeufs sur un plat PS revêtu pour microinjection
- Spawn oursins en secouant ou injection intracoelomique jusqu'à 1 ml de 0,5% de KCl pour induire la contraction des muscles lisses de libérer des gamètes 3 (figure 2).
- Si l'animal est un mâle, comme indiqué par la couleur blanche des spermatozoïdes, les spermatozoïdes recueillir sec à partir de la surface d'un animal dans un tube de 1,5 ml. Spermatozoïdes à sec peut être stocké à 4 ° C pendant une semaine sans perte sensible de la fonction biologique.
- Si l'animal est une femelle, comme indiqué par la couleur jaune due à la teneur en jaune d'œuf, de recueillir ses gamètes en immergeant les gonopores dans un bol rempli d'eau de mer. Les oeufs seront libérés de gonopores et s'installent par gravité. </ Li>
- Filtrer les oeufs de débris tels que des épines des animaux à l'aide de 80 um Nylon filtre maille. Les meilleurs résultats sont obtenus si les oeufs sont utilisés dans 5-7 heures après la ponte.
- Dejelly les œufs:
- Préparer 100 ml d'eau de mer acide pendant environ 1 ml d'oeuf. Utiliser 0,5 M d'acide citrique pour ajuster le pH de l'eau de mer à partir de pH 8.0 à 5.1 à 5.2. Trop faible d'un pH diminuera la fécondation et trop élevé d'un pH ne permettra pas d'œufs pour fixer les plaques revêtues PS.
- Ajouter les œufs (pas plus de 1 ml) de l'eau de mer acide et permettre aux oeufs de s'installer sur la glace pendant 10 min. En variante, le retrait de la couche de gelée peut être facilitée par tourbillonnement doux des oeufs au cours du traitement. On peut effectivement dejelly œufs de S. purpuratus à 3-4 min de cette façon.
- Versez délicatement l'eau de mer acide, ajouter de l'eau de mer frais et laissez les œufs se fixent sur la glace à nouveau. Oeufs Dejellied peuvent être stockés sur de la glace jusqu'à 6 heures sans problèmes de fertilisation
3. Row the Eggs
- Préparer une solution mère de M 3-aminotriazole (3-AT, MW = 84.08) par dissolution de 0,84 g de 3-AT dans 10 ml de ddH 2 O. Cette solution peut être stockée à 4 ° C pendant jusqu'à 6 mois.
- Préparer la solution 1 mM de travail de 3-AT en ajoutant 50 pi de 1 M solution stock à 50 ml d'eau de mer préalablement refroidi. Conserver la solution sur de la glace.
- Préparer bouche pipette (figure 3) pour une manipulation en douceur des œufs:
- pointe de la pipette est tirée manuellement de micropipettes de verre (100 x OD 1.09 mm). Maintenez la micropipette avec les deux mains sur la flamme. Comme le verre commence à fondre, retirez-le délicatement les extrémités de la pipette dans des directions opposées.
- Branchez une pipette tiré à un tube en plastique (ID 1,14 mm), étanchéité avec Parafilm. La longueur du tube doit être d'environ 50 à 70 cm.
- Insérer une extrémité P20 ou P200 filtré stérile à l'extrémité du tube opposée au tube de verre deutiliser en tant que pièce d'embouchure.
- Clip de la fin de la micropipette de verre avec des ciseaux pour ajuster le diamètre de la pointe. Le diamètre optimal légèrement supérieur au diamètre de l'oeuf (80 um).
- Verser 4 ml d'mM 3-AT eau de mer 1 dans chaque boîte PS-couché (fond ou le couvercle).
- Prenez la pipette bouche, mettre la pointe de P20/P200 dans la bouche et le fixer avec les dents. Pour aspirer des oeufs, aspirer d'abord une petite quantité de l'eau de mer. En ayant une colonne de liquide avant le chargement des oeufs, on aura un contrôle maximal sur la technique de pipetage à la bouche.
- Placez la pointe de la micropipette près des œufs et aspirer doucement dans plusieurs centaines d'oeufs dans la pipette. Confiner les oeufs dans la micropipette de verre.
- Ligne dejellied oeufs dans une ligne droite sur un plat en les soufflant doucement de la bouche pipette tout en déplaçant la pointe en ligne droite. Ramer les oeufs juste avant les injections, parce que les problèmes de fertilisation peuvent se produire en raison de prolonged exposition au 3-AT eau de mer 3. En outre, les adhésifs cationiques comme PS peuvent être toxiques pour les œufs, et il n'est pas conseillé d'exposer les embryons de ces réactifs pendant de longues périodes, en particulier si les enveloppes de fertilisation ont été supprimés.
- Faire une rayure sur le plat près de la ligne d'oeufs ramé aide d'une pipette de verre. Ce zéro sera important de casser l'aiguille d'injection pour régler le débit de la solution en fonction des besoins. Alternativement, le zéro peut être faite avant de verser 3-AT eau de mer à l'assiette.
4. Microinjection des oursins zygotes
- Tournez sur la station de micro-injection. Nous décrivons ici l'utilisation d'FemtoJet système d'injection.
- Tirez capillaires d'injection à l'aide d'un extracteur d'aiguilles. Un exemple d'une bonne aiguille est représentée à la figure 4. Remarque: Pour les injections d'ARN, les capillaires d'injection doivent être pré-traitées pour éviter la contamination RNAse 31:
- Placez capillaires d'injection dans 50 ml coniquetubes et ajouter 50 ml de méthanol filtré / HCl (9:1). Secouez bien et laisser toute la nuit pour plus de 10 h.
- Verser le mélange méthanol / HCl et rincer les capillaires 2x avec du méthanol filtré dans le même tube.
- Drainer le methanol, autant que possible, et lyophiliser les capillaires pendant une nuit pour assurer une élimination complète du methanol.
- Monter avec précaution le capillaire de l'aiguille sur un support de chargement d'aiguille et le charger avec <0,5 pi d'une solution de l'échantillon à l'aide de conseils microloader. Exemples de solutions contiennent habituellement 20% de glycerol, en fonction de la matière injectée 3.
- Placer le plat avec des oeufs ramé sur la platine du microscope (œufs doivent être alignés verticalement, observé à travers les oculaires) et se concentrer sur les oeufs.
- Enfoncer délicatement l'aiguille chargée sur le porte aiguille de micro-injection et régler la position de l'aiguille pour avoir une pointe parfaitement ciblé dans le milieu du terrain.
- Appuyez sur le bouton pour appliquer la pression maximale for de nettoyage de l'aiguille. La solution doit venir de l'aiguille. Ajuster la pression si nécessaire: la pression d'injection doit être dans la gamme de 90 à 360 hPa, avec la pression de compensation à environ 1/3 de la pression d'injection.
- Régler le débit de la solution par injection dans l'œuf non fécondé. L'utilisation d'un micromanipulateur de joystick, diriger la pointe de l'aiguille d'injection à l'œuf non fécondé. Pour faciliter l'entrée de l'aiguille, créer un léger tremblement en tapotant doucement de la scène avec un objet dur comme un tournevis. Un bolus d'injection formant à l'intérieur de l'œuf devrait être considéré (Figure 5).
- Si le bolus d'injection n'est pas visible, relever légèrement la pointe de l'aiguille au-dessus des oeufs, de localiser le scratch sur le plat et l'ajuster à être positionné au milieu du champ. Tapoter doucement la pointe de l'aiguille de la marque de zéro pour briser la pointe de l'aiguille d'injection. Ajuster les pressions d'injection et de compensation pour faire en sorte que le bolus d'injection ne dépasse pas 1/5 de til diamètre de l'œuf (1-2 heures).
- Une fois le bolus d'injection est calibré, féconder les œufs en ajoutant le sperme dilué (1:1000) ou 1-2 pi de sperme. Bien mélanger avec soin pour éviter de déloger la rangée d'oeufs.
- Commencer immédiatement après l'injection de l'enveloppe de la fécondation devient visible (Figure 5). Avancez le long de la ligne d'oeufs ramé en utilisant le contrôleur de scène et injecter autant de zygotes que possible par les piquer avec l'aiguille commandé par joystick micromanipulateur.
- Après 10-15 minutes, les œufs fécondés nouvellement deviendront trempé et ne peuvent pas être injecté plus longtemps. Retirer le plat du stade et soigneusement aspirer à sperme en 3-AT eau de mer en utilisant une pipette Pasteur en plastique.
- Ne laissez pas les zygotes sec. Ajouter rapidement de l'eau douce de la mer préalablement refroidi pour couvrir le plat. Incuber les embryons à 15 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GFP et mCherry constructions rapporteurs ont été transcrits in vitro et micro-injecté dans les œufs nouvellement fécondés. Les embryons ont été incubées à 15 ° C pendant 24 heures (jusqu'à ce que le stade blastula) et imagées par Zeiss Observateur Z1 microscope. Injection de constructions rapporteurs n'a pas conduit à des défauts de développement (figure 6). Pour la quantification de signaux de fluorescence, l'acquisition des images a été effectuée à un faible grossissement (100X) pour capturer pixels fluorescents (Figures 6D-F) au maximum. Les signaux fluorescents ont été quantifiés à l'aide Axiovision 4.8.2.0. Les erreurs types pour l'intensité du signal fluorescent à l'intérieur de la population de 100 à 200 blastulas ne dépassent pas 1,5% (données non présentées).
Figure 1. La configuration du micro-injection. (A) de A di PS revêtuessh avec des oeufs immobilisées est située sur la phase de (B) d'un microscope inversé. La micro-injection de l'aiguille est fixé à (C) un porte-aiguille qui est reliée à un (D) unité de pression. Mouvement dans les directions x, y, et z est dirigé dimensions avec l'utilisation de (E) ou le micromanipulateur (F) du manipulateur grossier. (G) Un tournevis enveloppé avec du papier absorbant est utilisé pour taper doucement la platine du microscope pour induire léger tremblement de faciliter l'entrée de l'aiguille dans l'œuf nouvellement fécondé.
Figure 2. La ponte des oursins. (A) oursin est amené à verser par injection intracoelomique de 0,5% de KCl. Les points d'aiguille à la membrane peristomial entourant la bouche de l'animal, seulement la partie molle de l'animal.(B) Femme oursin est placé avec ses gonapores immergés dans l'eau de mer dans un bécher en plastique pour ramasser les œufs jaunes. (C) le sperme blanc est libéré de gonapores de l'oursin mâle.
Figure 3. . Pipette bouche Une bouche pipette se compose de trois parties: (A) en verre aiguille de micropipette, (B) des tubes en plastique, et (C) un P20 filtré stérile ou pointe de P200. La micropipette en verre est insérée dans le tube en matière plastique qui est reliée à la P20 ou P200 embout buccal.
Figure 4. aiguille de microinjection. (A) L'aiguille de microinjection est pulconduit à l'aide d'un extracteur d'aiguilles avec un réglage spécifique. Le réglage de l'extracteur de l'aiguille doit être déterminée de manière empirique. L'utilisation d'un Narishege PC-10 aiguille extracteur, nous utilisons 72,8 ° C pour le séchage thermique, 1 et 83,7 ° C pour fixer la chaleur 2. Utilisation de la rayure sur la plaque nous rompons la pointe de l'aiguille pour faciliter l'écoulement de la solution. (B) La bonne aiguille doit avoir une longueur de 500-600 um à partir d'une largeur de 50 um à l'épaule à 5 pm à la pointe.
Figure 5. Injection des œufs d'oursin nouvellement fécondés. Oeufs Dejellied ont ramé sur un plat de PS-enduit et fécondé. Œufs nouvellement fécondés ont été injectés, un par un tout en déplaçant la platine de microscope le long de la ligne de zygotes (de haut en bas). (A) bolus d'injection est clairement visible à former à l'intérieur de la nouvellement fécondéoeuf à la pointe de l'aiguille. (B) l'enveloppe de fertilisation transparent est formé sur la fécondation. (C) des spermatozoïdes apparaissent comme de petits points noirs dans le fond. La barre d'échelle est de 50 um. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 6. Zygotes microinjectés développés dans blastulas sans anomalies du développement ou morphologiques. Œufs nouvellement fécondés ont été injectés avec des marqueurs fluorescents qui leur permettent d'être clairement distingués des embryons non-injecté (indiqués par des flèches). (AC) Les embryons imagée à un grossissement de 400X. (DF) Les embryons sont mis en image à un grossissement de 100X pour capturer la plupart des signaux de fluorescence émis pour une quantification fiable. Après 24 heures post fécondation, blastulas ont été recueillies et traitées avec de l'eau de mer pour 2x 2 min pour immobiliser les embryons de natation 3, suivie par 1x mer lavage à l'eau. Les images ont été acquises avec Zeiss Observateur Z1 microscope et AxioCam caméra monochrome. (A, D) images DIC du blastulas. (B, E) des images de superposition des embryons injectés avec transcrit in vitro mCherry en fluorescence et DIC canaux. (C, F) images de superposition des embryons injectés avec transcrit in vitro GFP en fluorescence et DIC canaux. La barre d'échelle est de 50 um. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La micro-injection est une technique puissante pour délivrer divers traitements tels que l'ADN, l'ARNm, des protéines recombinantes, une perte de fonction et de gain de fonction de réactifs, les colorants et leurs combinaisons dans des œufs, des embryons et des cellules de divers organismes 7.1. Toutefois, plusieurs considérations doivent être gardées à l'esprit lors de la conception d'une expérience de micro-injection.
Il est extrêmement important de prendre en considération la solubilité du traitement délivré et le volume d'injection. Si la solution microinjecté tend à former même un léger précipité, l'aiguille de micro-injection serait bouché. En règle générale, il est recommandé de centrifuger la solution pendant plus de 15 min avant le chargement dans l'aiguille pour s'assurer que tout précipité est retiré de la solution 3. L'autre approche consiste à faire passer la solution à travers les colonnes de centrifugation Millipore. Si il n'est pas possible d'éviter le colmatage, il peut être possible de débloquer l'aiguille en douceur briser à nouveau la pointe,mais il devient difficile de contrôler le débit de la solution si la pointe est trop large. La grande quantité de la solution injectée peut être toxique pour l'embryon, d'ailleurs, la grande pointe introduit de plus grandes variations entre les volumes de solution injectées dans des embryons individuels. Il est également important que la quantité de volume injecté dans les œufs nouvellement fécondés est ajustée. Le volume injecté peut être étalonné en tirant sur les aiguilles à différents paramètres, suivie par l'injection de la solution dans l'huile. Cela permet de mesurer le diamètre (et donc le volume) de la goutte 32. Nous constatons que une quantité acceptable d'une solution d'injection dans l'œuf nouvellement fécondé ne doit pas dépasser 1/5 de diamètre du zygote comme représenté sur la figure 5.
Le principal conseil est de charger l'aiguille juste avant l'injection, de travailler vite, et à utiliser fréquemment la fonction du bouton de nettoyage de l'injecteur qui déclenche l'application de la pression maximale disponible à la sortie deAfin de débusquer l'aiguille d'injection bloqué.
Parfois, l'aiguille risque de se boucher par l'extérieur, quand le sperme et les débris des oeufs préalablement injectées adhèrent à la pointe de l'aiguille. Dans ce cas, il est utile de relever l'aiguille sur toute la hauteur de l'eau 3-AT dans le plat injection. Habituellement, la tension provoquée par l'interface liquide-air est suffisant pour éliminer les débris. Alternativement, le brossage en douceur l'aiguille d'injection contre le scratch sur la plaque d'injection peut aider aussi. Dans le cas extrême, il est possible d'effacer la pointe de l'aiguille avec le Kimwipe humide gouttes. Cependant, une telle essuyage exige une extrême prudence et la pratique.
Colorants fluorescents tels que 10 000 MW Texas Red lysine facturés dextran (2 mg / ml) produisent un signal fort qui peut être détecté et utilisé pour la normalisation fiable de la solution injectée. Lorsque l'ARNm doit être injecté, il est recommandé de coinject avec mCherry ARNm GFP ou avec l'ARNm dans desintérêt à veiller à ce qu'aucune dégradation de l'ARNm a eu lieu. Dans ce cas, la visualisation du signal de fluorescence est fonction de la définition de mCherry ou GFP. Si l'utilisation de colorants fluorescents ou des constructions n'est pas possible, il est recommandé de ramer une petite quantité d'oeufs sur chaque plat individuel pour s'assurer que tous les œufs fécondés récemment sur ce plat sont injectés.
En conclusion, la micro-injection est un outil précieux pour la recherche en génétique, en biologie moléculaire, cellulaire et développementale. Grâce à cette technique, la communauté de l'oursin a apporté une contribution significative à notre compréhension de la biologie cellulaire et de développement tels que la spécification du destin cellulaire, la fonction des gènes, la régulation des gènes et des voies biochimiques développement embryonnaire sous-jacente 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents ou d'autres conflits d'intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions Santiago Suarez pour la lecture critique du manuscrit et Betty Cowgill à l'aide de la photographie. Nous remercions également les relecteurs anonymes pour leurs commentaires critiques. Ce travail est soutenu par l'Université du Delaware Fonds de recherche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-043 | |
| Inverted microscope Axiovert 40 °C | Zeiss | 4109431007990000 | Injection microscope |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | Load injection solution |
| Nylon filter mesh 80 μm | Amazon.com | 03-80-37 | Filter eggs to get rid of debris |
| P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips | Fisher Scientific | 02707432 or 02707430 | Part of a mouth pipette |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13 374 12 | Part of a mouth pipette |
| Polyethylene tubing | Intramedic | PE-160 | Part of a mouth pipette |
| Protamine sulfate | MP Biomedicals, LLC | 194729 | Attach dejellied eggs to injection dishes |
| Sea urchins S. purpuratus | Pt. Loma Marine Invertebrate Lab | N/A | |
| Sea water | any pet store | Instant Ocean | |
| Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | Injection dishes |
| Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 | Narishige | 9124 | Manipulate injection needle |
| Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND | Narishige | 9212 | Manipulate injection needle |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Vertical needle puller | Narishige | PC-10 | Pull injection needles |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y. Efficient Delivery of DNA and Morpholinos into Mouse Preimplantation Embryos by Electroporation. Plos One. 7, 13 (2012).
- Ettensohn, C. A., Wray, G. A., Wessel, G. M. eds. Development of sea urchins, ascidians, and other invertebrate deuterostomes: experimental approaches. 74, Elsevier Academic Press. (2004).
- Franks, R. R., Houghevans, B. R., Britten, R. J., Davidson, E. H. Direct introduction of cloned DNA into the sea urchin zygote nucleus, and fate of injected DNA. Development. 102, 287-299 (1988).
- Kinsey, W. H. Analysis of signaling pathways in zebrafish development by microinjection. Methods Mol. Biol. 518, 67-76 (2009).
- Kola, I., Sumarsono, S. H. Microinjection of in vitro transcribed RNA and antisense oligonucleotides in mouse oocytes and early embryos to study the gain- and loss-of-function of genes. Mol. Biotechnol. 6, 191-199 (1996).
- Mishina, T., Fuchimukai, K., Igarashi, K., Tashiro, K., Shiokawa, K. Modification of secondary head-forming activity of microinjected a dagger beta-catenin mRNA by co-injected spermine and spermidine in Xenopus early embryos. Amino Acids. 42, 791-801 (2012).
- O'Meara, C. M., et al. Gene silencing in bovine zygotes: siRNA transfection versus microinjection. Reprod. Fertil. Dev. 23, 534-543 (2011).
- Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z.
- Hiramoto, Y. Cell division without mitotic apparatus in sea urchin eggs. Exp. Cell Res. 11, 630-636 (1956).
- Wilson, L. Methods in Cell Biology. 25, Elsevier. (1982).
- Gross, J. M., McClay, D. R. The role of Brachyury (T) during gastrulation movements in the sea urchin Lytechinus variegatus. Dev. Biol. 239, 132-147 (2001).
- Yajima M, W. G. Autonomy in specification of primordial germ cells and their passive translocation in the sea urchin. Development. 139, 3786-3794 (2012).
- Duboc, V., et al. Nodal and BMP2/4 pattern the mesoderm and endoderm during development of the sea urchin embryo. Development. 137, 223-235 (2010).
- Ernst, S. G.
- McClay, D. R. Evolutionary crossroads in developmental biology: sea urchins. Development. 138, 2639-2648 (2011).
- Sodergren, E., et al. Research article - The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
- Roux, M. M., et al. A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation. Dev. Biol. 300, 416-433 (2006).
- Turner, P. R., Sheetz, M. P., Jaffe, L. A. Fertilization increases the polyphosphoinositide content of sea urchin eggs. Nature. 310, 414-415 (1984).
- Voronina, E., Marzluff, W. F., Wessel, G. M. Cyclin B synthesis is required for sea urchin oocyte maturation. Dev. Biol. 256, 258-275 (2003).
- Wong, J. L., Wessel, G. M. Extracellular matrix modifications at fertilization: regulation of dityrosine crosslinking by transamidation. Development. 136, 1835-1847 (2009).
- Shuster, C. B., Burgess, D. R. Transitions regulating the timing of cytokinesis in embryonic cells. Curr. Biol. 12, 854-858 (2002).
- Morris, R. L., et al. Analysis of cytoskeletal and motility proteins in the sea urchin genome assembly. Dev. Biol. 300, 219-237 (2006).
- Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of Cell Geometry on Division-Plane Positioning. Cell. 144, 414-426 (2011).
- Davidson, E. H., et al. A genomic regulatory network for development. Science. 295, 1669-1678 (2002).
- Oliveri, P., Tu, Q., Davidson, E. H. Global regulatory logic for specification of an embryonic cell lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5955-5962 (2008).
- Peter, I. S., Davidson, E. H. A gene regulatory network controlling the embryonic specification of endoderm. Nature. 474, (2011).
- Nam, J. M., Dong, P., Tarpine, R., Istrail, S., Davidson, E. H. Functional cis-regulatory genomics for systems biology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3930-3935 (2010).
- Showman, R. M., Foerder, C. A. Removal of the fertilization membrane of sea-urchin embryos employing aminotriazole. Exp. Cell Res. 120, 253-255 (1979).
- Lepage, T., Sardet, C., Gache, C. Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea-urchin embryo. Dev. Biol. 150, 23-32 (1992).
- Jaffe, L. A., Terasaki, M. Quantitative microinjection of oocytes, eggs, and embryos. Development of Sea Urchins, Ascidians, and Other Invertebrate Deuterostomes: Experimental Approaches. 74, 219-242 (2004).
