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Biology

समुद्री साही युग्मनजों के उच्च throughput microinjections

Published: January 21, 2014 doi: 10.3791/50841
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Delaware

Summary

Microinjection अंडे, भ्रूण, और विभिन्न प्रजातियों की कोशिकाओं में डीएनए निर्माणों, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides या अन्य उपचार देने के लिए इस्तेमाल एक आम तकनीक है.

Abstract

कोशिकाओं और भ्रूण में microinjection जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक आम तकनीक है. इस विधि में उपचार समाधान की एक छोटी राशि शारीरिक रूप से व्यक्ति immobilized कोशिकाओं या भ्रूण इंजेक्षन करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक microinjection सुई में भरी हुई है. उच्च throughput वितरण के लिए इस प्रक्रिया का प्रदर्शन करने के लिए प्रारंभिक प्रशिक्षण के लिए आवश्यकता के बावजूद, microinjection अधिकतम क्षमता और कोशिकाओं, अंडे या भ्रूण में (नमूने के जटिल मिश्रण सहित) के इलाज के समाधान की एक विस्तृत विविधता की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वितरण प्रदान करता है. Microinjections के लिए आवेदन डीएनए निर्माणों, mRNAs, पुनः संयोजक प्रोटीन, समारोह के लाभ, और समारोह अभिकर्मकों के नुकसान का वितरण शामिल है. फ्लोरोसेंट या वर्णमिति डाई तत्काल कुशल प्रसव के दृश्य के रूप में अच्छी तरह के रूप में दिया समाधान की राशि की विश्वसनीय सामान्य बनाने के लिए एक उपकरण को सक्षम करने के लिए इंजेक्शन समाधान के लिए जोड़ा है. वर्णित विधि 100-400 समुद्री साही Z के microinjection सक्षम बनाता है10-15 मिनट के भीतर ygotes.

Introduction

कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उपचार वितरण शोधकर्ताओं के लिए मुख्य methodological चुनौतियों में से एक है. कई तरीकों क्षणिक अंडे, भ्रूण, और कोशिकाओं में उपचार के समाधान देने के लिए स्थापित किया गया है. इन तरीकों में 1,2, lipofection (झिल्ली के साथ उपचार युक्त liposomes के विलय के माध्यम से वितरण) 1, microparticle बमबारी 1 (डीएनए माइक्रोन पर उपजी है (कम बिजली दालों का उपयोग झिल्ली में एक पैदा क्षणिक pores के आधार पर) electroporation शामिल आकार के धातु तब उच्च वेग में कोशिकाओं घुसना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं कि कण), और पारगमन (वायरस transgenes की एक डिलीवरी वाहन के रूप में प्रयोग किया जाता है). फिलहाल, microinjection न्यूनतम अभिकर्मकों के साथ 100% दक्षता के साथ किसी भी समाधान पहुंचाने का लाभ रखती है कि केवल दृष्टिकोण है. इसके अलावा, एक इंजेक्शन समाधान उपचार की एक जटिल कॉकटेल से बना जा सकता है. इस तकनीक को सफल करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैly ऐसे समुद्री अर्चिन 3,4, ज़ेबरा मछली 5, माउस 6, मेंढक 7, और मवेशियों 8 के साथ ही टिशू कल्चर 9 में एकल कक्षों के रूप में कई प्रजातियों से अंडे और भ्रूण microinject. बाद में विकास के चरणों में एकल blastomeres इंजेक्शन भी 10-12 आयोजित किया गया है.

microinjections के मौजूदा तरीकों शुरू में Hiramoto 10 द्वारा बताया गया था कि दबाव इंजेक्शन पद्धति पर आधारित हैं, लेकिन, महान प्रगति इस प्रक्रिया का अनुकूलन की दिशा में किया गया है. बहुत बढ़िया microinjection तकनीक कहीं 11 में वर्णित किया गया है, और यहाँ हम वर्तमान में समुद्री साही (Strongylocentrotus purpuratus) नव निषेचित अंडे microinject के लिए प्रयोग किया जाता है कि विशिष्ट विधियों में से एक का वर्णन. एक सदी से भी अधिक के लिए, समुद्री अर्चिन एक मूल्यवान प्रयोगात्मक मॉडल 15,16 किया गया है. सागर अर्चिन evolutionarily बारीकी (हमारे सहित) Chordates और का विश्लेषण करने के लिए संबंधित हैंउनके जीनोम वे मानव के रूप में 17 के सभी प्रमुख जीन परिवारों होते हैं कि पता चला. वे synchronously आसानी से छेड़छाड़ की जा सकती है कि पारदर्शी भ्रूण के विकास की एक बड़ी संख्या का उत्पादन. एक मॉडल के रूप में जीव समुद्री साही का प्रयोग, समुद्री साही समुदाय हमारे निषेचन प्रक्रिया की समझ 18-21, सेल जैविक प्रक्रियाओं 22-24, और जीन विनियामक नेटवर्क (GRNs) 25-28 में योगदान दिया है.

समुद्री साही युग्मनजों में microinjection कई चरणों की आवश्यकता है. सबसे पहले, अंडे प्रायर (नीचे वर्णित) इंजेक्शन के लिए स्थिर हो की जरूरत है. Microinjection व्यंजन जो नकारात्मक आरोप लगाया अंडे 3 पालन कर सकते हैं करने के लिए एक सकारात्मक आरोप लगाया सतह बनाता है जो protamine सल्फेट (पीएस), के साथ लेपित हैं. अंडे प्राकृतिक समुद्र के पानी या कृत्रिम समुद्र के पानी (8.0 पीएच) में दो washes के द्वारा पीछा किया, 10 मिनट के लिए अम्लीय पानी समुद्र में ऊष्मायन (पीएच 5.15) द्वारा dejellied रहे हैं. dejellied अंडे ध्यान से एक सीधी रेखा में rowed रहे हैंनिषेचन 29 का एक परिणाम के रूप में अंडे के cortical कणिकाओं से स्रावित होता है कि ovoperoxidase की गतिविधि को बाधित करने के लिए आवश्यक है जो 1 मिमी 3 aminotriazole (3) में, की उपस्थिति में पुनश्च लेपित पकवान के बीच में. यह कदम निषेचन लिफाफा का सख्त को रोकने के लिए और microinjection सुई प्रवेश की सुविधा के लिए महत्वपूर्ण है. 1 मिमी 3 में करने के लिए एक विकल्प के रूप में 10 मिमी paraminobenzoic एसिड (PABA) का उपयोग किया जा सकता है. इंजेक्शन समाधान विशेष microloading पिपेट टिप का उपयोग कर एक microinjection सुई में भरी हुई है और micromanipulator और दबाव यूनिट से जुड़े एक धारक (चित्रा 1) पर मुहिम शुरू की है. प्रत्येक सुई अलग दिनों पर कई प्रयोगों में व्यक्तिगत युग्मनजों microinject करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. युग्मनजों कठोर जब तक microinjection 10-15 मिनट के लिए किया जा सकता है. युग्मनजों फिर 15 डिग्री सेल्सियस पर समुद्र के पानी के साथ और सुसंस्कृत धो रहे हैं भ्रूण ब्लासटुला चरण सेने तक पहुँचते हैं, वे fer के घटकों हज़म कि अंडे सेने एंजाइम रिलीजtilization लिफाफा 30 और उन्हें स्वाभाविक रूप से पी एस लेपित पकवान से अलग करने के लिए अनुमति देते हैं. यदि आवश्यक हो, भ्रूण धीरे धीरे भ्रूण पर समुद्र का पानी बह द्वारा एक मुँह पिपेट या पाश्चर पिपेट का उपयोग पकवान से अलग किया जा सकता है. वर्णित विधि बहाव के विश्लेषण के लिए एक उच्च throughput विधि उपलब्ध कराने, एक ही पकवान पर 100-400 नव निषेचित अंडे के कुशल और विश्वसनीय microinjection सक्षम बनाता है.

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Protocol

1. Protamine सल्फेट की तैयारी (पी एस) व्यंजन लेपित

  1. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में विआयनीकृत, आसुत जल (DDH 2 हे) के 50 एमएल के निजी सचिव की 0.5 ग्राम जोड़कर protamine सल्फेट (पी एस) के 1% समाधान तैयार करें. पुनश्च का पूरा विघटन सुनिश्चित करने के लिए 1-2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक बेंच प्रकार के बरतन पर उच्च गति से अच्छी तरह हिला. यह समाधान (पूरी तरह से प्रत्येक का उपयोग करने से पहले जेल की तरह वेग भंग करने के लिए सुनिश्चित करें) 3 में कम से कम 3 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
  2. 60 मिमी x 15 मिमी polystyrene पेट्री डिश के एक आस्तीन लो और बेंच पर दोनों lids और नीचे से बाहर करना.
  3. कम से कम 2 मिनट के लिए छोड़ दें, सतह को कवर करने के लिए अभी पर्याप्त हर डिश में 1% पी एस समाधान (दोनों नीचे और पलकों इस्तेमाल किया जा सकता है) डालो. 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत जब बचे हुए पुनश्च समाधान 3 महीने के भीतर कई बार reused किया जा सकता है
  4. जगह आसुत जल (DH 2 हे) के साथ भरा एक बीकर में व्यंजन पुनश्च इलाज. के लिए DH 2 हे चलाने के अंतर्गत बीकर छोड़ दो कम से कम10 मिनट.
  5. पुनश्च लेपित व्यंजन भंडारण के लिए तुरंत या शुष्क हवा में इस्तेमाल किया जा सकता है. धूल संचय को रोकने के लिए उन्हें कवर. वे 1 महीने 3 के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है.

2. समुद्री साही gametes प्राप्त करें और microinjection के लिए एक पी एस लेपित डिश पर अंडे स्थिर

  1. युग्मक 3 (चित्रा 2) जारी करने के लिए चिकनी मांसपेशियों के संकुचन को उत्पन्न करने के लिए मिलाते हुए या 0.5% KCl के ऊपर से 1 मिलीलीटर की intracoelomic इंजेक्शन द्वारा स्पोन समुद्री अर्चिन.
  2. पशु एक पुरुष है, तो सफेद रंग शुक्राणु द्वारा संकेत के रूप में, एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में एक जानवर की सतह से शुक्राणु ड्राई इकट्ठा. सूखी शुक्राणु जैविक समारोह के महत्वपूर्ण नुकसान के बिना एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
  3. पशु कारण अंडे की जर्दी सामग्री के लिए पीले रंग के संकेत के रूप में एक महिला, समुद्र के पानी से भरा बीकर में gonopores डुबो कर अपनी युग्मक इकट्ठा है. अंडे gonopores से जारी है और गंभीरता से बसने की जाएगी. </ ली>
  4. मलबे से ऐसे 80 माइक्रोन नायलॉन फिल्टर जाल का उपयोग पशु कांटा के रूप में अंडे तक. अंडे स्पॉन के बाद 5-7 घंटे के भीतर उपयोग किया जाता है, तो सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त कर रहे हैं.
  5. अंडे Dejelly:
    1. अंडे के लगभग 1 मिलीलीटर के लिए अम्लीय समुद्र के पानी की 100 मिलीलीटर की तैयारी. 5.1-5.2 पीएच 8.0 से समुद्र के पानी का पीएच को समायोजित करने के लिए 0.5 एम साइट्रिक एसिड का प्रयोग करें. एक पीएच की बहुत कम निषेचन में कमी होगी और एक पीएच की बहुत अधिक अंडे पुनश्च लेपित प्लेटों को संलग्न करने के लिए अनुमति नहीं दी जाएगी.
    2. अम्लीय समुद्र के पानी के लिए अंडे (नहीं से अधिक 1 मिलीलीटर) जोड़ें और अंडे 10 मिनट के लिए बर्फ पर बसने के लिए अनुमति देते हैं. वैकल्पिक रूप से, जेली कोट को हटाने के इलाज के दौरान अंडे की कोमल घूमता द्वारा मदद की जा सकती. एक 3-4 मिनट में प्रभावी ढंग से dejelly इस तरह से एस purpuratus अंडे कर सकते हैं.
    3. ध्यान से, अम्लीय समुद्र के पानी टपकना ताजा समुद्र के पानी को जोड़ने और अंडे फिर बर्फ पर बसने करते हैं. Dejellied अंडे निषेचन समस्याओं के बिना अप करने के लिए 6 घंटे के लिए बर्फ पर संग्रहीत किया जा सकता है

    3. अंडे पंक्ति

    1. DDH 2 ओ के 10 मिलीलीटर में 3 एटी की 0.84 ग्राम भंग द्वारा 3 aminotriazole (3 एटी, मेगावाट = 84.08) के एम 1 शेयर समाधान तैयार यह समाधान अप करने के लिए 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
    2. Prechilled समुद्र के पानी की 50 मिलीलीटर के लिए 1 एम स्टॉक समाधान के 50 μl जोड़कर 3 एटी के 1 मिमी काम कर समाधान तैयार करें. बर्फ पर समाधान रखें.
    3. अंडे की कोमल से निपटने के लिए मुंह विंदुक (चित्रा 3) तैयार करें:
      1. पिपेट टिप को मैन्युअल कांच micropipettes (100 एक्स आयुध डिपो 1.09 मिमी) से खींच लिया है. खुली आग पर दोनों हाथों से micropipette पकड़ो. ग्लास पिघला करने के लिए शुरू होता है, ध्यान से विरोध दिशाओं में पिपेट की छोर खींच.
      2. एक Parafilm के साथ तंग सील, एक प्लास्टिक टयूबिंग (आईडी 1.14 मिमी) को पिपेट निकाला कनेक्ट. टयूबिंग की लंबाई लगभग 50-70 सेमी होना चाहिए.
      3. करने के लिए ग्लास टयूबिंग ट्यूब विपरीत के अंत में एक बाँझ फ़िल्टर्ड P20 या P200 नोक डालेंमुंह टुकड़े के रूप में इस्तेमाल किया जा.
      4. टिप के व्यास को समायोजित करने के लिए कैंची के साथ कांच micropipette के अंत क्लिप. इष्टतम व्यास थोड़ा अंडा (80 माइक्रोन) के व्यास से अधिक है.
    4. प्रत्येक पुनश्च लेपित पकवान (नीचे या ढक्कन) में 1 मिमी 3 पर समुद्र के पानी के 4 मिलीलीटर डालो.
    5. , मुँह पिपेट लो मुंह में P20/P200 टिप रख दिया और दांत के साथ सुरक्षित. अंडे निकालना, पहले समुद्र के पानी की एक छोटी राशि aspirate. पिछले अंडे लोड करने के लिए तरल पदार्थ की एक स्तंभ होने से, एक मुंह pipetting तकनीक पर अधिक से अधिक नियंत्रण होगा.
    6. अंडे के पास micropipette टिप स्थिति और धीरे पिपेट में अंडे के कई सैकड़ों की संख्या में aspirate. कांच micropipette के भीतर अंडे सीमित.
    7. पंक्ति एक सीधी रेखा में टिप ले जाते समय धीरे मुँह पिपेट के बाहर उन्हें उड़ाने से एक डिश पर एक सीधी रेखा में अंडे dejellied. निषेचन समस्याओं के कारण पी के लिए हो सकता है, क्योंकि सही इंजेक्शन से पहले अंडे पंक्ति3 में समुद्र का पानी 3 के लिए जोखिम rolonged. इसके अलावा, पी एस की तरह cationic चिपकने वाले अंडे को विषाक्त किया जा सकता है, और यह निषेचन लिफाफे हटा दिया गया है, खासकर अगर लंबी अवधि के लिए इन अभिकर्मकों के लिए भ्रूण को बेनकाब करने के लिए उचित नहीं है.
    8. एक गिलास पिपेट का उपयोग rowed अंडे की रेखा के निकट पकवान पर एक खरोंच बनाओ. इस खरोंच के रूप में जरूरत समाधान के प्रवाह को समायोजित करने के लिए इंजेक्शन की सुई को तोड़ने के लिए महत्वपूर्ण होगा. वैकल्पिक रूप से, खरोंच डिश के लिए 3 पर समुद्र का पानी डालने का कार्य करने से पहले किया जा सकता है.

    4. समुद्री साही युग्मनजों के microinjection

    1. Microinjection स्टेशन पर मुड़ें. यहाँ हम FemtoJet इंजेक्शन प्रणाली के उपयोग का वर्णन.
    2. एक सुई खींचने का उपयोग इंजेक्शन केशिकाओं खींचो. एक अच्छा सुई का एक उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया गया है. नोट: शाही सेना इंजेक्शन के लिए, इंजेक्शन केशिकाओं RNAase संदूषण 31 से बचने के लिए pretreated किया जाना चाहिए:
      1. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार में इंजेक्शन केशिकाओं रखेंट्यूब और फ़िल्टर मेथनॉल / एचसीएल (9:1) के 50 एमएल जोड़ें. अच्छी तरह हिला और 10 घंटे से अधिक समय नहीं के लिए रात भर छोड़ दें.
      2. मेथनॉल / एचसीएल डालो और केशिकाओं ही ट्यूब में फ़िल्टर्ड मेथनॉल के साथ 2x कुल्ला.
      3. जितना संभव मेथनॉल नाली और मेथनॉल का पूरी तरह हटाने सुनिश्चित करने के लिए रात भर केशिकाओं lyophilize.
    3. ध्यान से एक सुई लोड हो रहा धारक पर सुई केशिका माउंट और microloader सुझावों का उपयोग कर एक नमूना समाधान की <0.5 μl के साथ लोड. नमूना समाधान आमतौर पर इंजेक्शन सामग्री 3 के आधार पर, 20% ग्लिसरॉल होते हैं.
    4. खुर्दबीन मंच (eyepieces के माध्यम से देखा है जब अंडे खड़ी गठबंधन किया जाना चाहिए) पर rowed अंडे के साथ पकवान प्लेस और अंडे पर ध्यान केंद्रित.
    5. ध्यान से सुई microinjecting धारक पर लोड सुई माउंट और मैदान के बीच में एक पूरी तरह से ध्यान केंद्रित टिप करने के लिए सुई की स्थिति को समायोजित.
    6. अधिकतम दबाव के लिए लागू करने के लिए बटन दबानाआर सुई सफाई. समाधान सुई से बाहर आना चाहिए. यदि आवश्यक हो तो दबाव को समायोजित: इंजेक्शन दबाव में लगभग 1/3 इंजेक्शन के दबाव के मुआवजे के दबाव के साथ, 90-360 एचपीए की श्रेणी में होना चाहिए.
    7. Unfertilized अंडे में इंजेक्शन लगाने के द्वारा समाधान के प्रवाह को समायोजित करें. जॉयस्टिक micromanipulator का उपयोग, unfertilized अंडे को इंजेक्शन सुई की नोक प्रत्यक्ष. , सुई प्रवेश की सुविधा ऐसी एक स्क्रू ड्राइवर के रूप में एक कठिन वस्तु के साथ मंच की कोमल दोहन द्वारा एक मामूली कांप बनाने के लिए. अंडे के अंदर गठन एक इंजेक्शन सांस में (चित्रा 5) में देखा जाना चाहिए.
    8. इंजेक्शन सांस में दिखाई नहीं देता है, तो थोड़ा, अंडे ऊपर सुई की नोक बढ़ा पकवान पर खरोंच लगाने और मैदान के बीच में तैनात करने के लिए इसे समायोजित. धीरे इंजेक्शन सुई की नोक तोड़ने के लिए खरोंच के निशान के लिए सुई टिप नल. इंजेक्शन सांस में टी के 1/5 से अधिक नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए इंजेक्शन और मुआवजे के दबाव को समायोजित करेंअंडा (1-2 बजे) की वह व्यास.
    9. इंजेक्शन सांस में calibrated है एक बार, पतला शुक्राणु (1:1,000) या शुक्राणु की 1-2 μl जोड़कर अंडे की खाद डालना. अंडे की पंक्ति dislodging को रोकने के लिए सावधानी से अच्छी तरह से मिलाएं.
    10. निषेचन लिफाफा (चित्रा 5) दृश्य बन जाता है तुरंत बाद इंजेक्शन प्रारंभ करें. चरण नियंत्रक का उपयोग rowed अंडे की रेखा के साथ ले जाएँ और जॉयस्टिक micromanipulator द्वारा नियंत्रित सुई के साथ उन्हें poking द्वारा संभव के रूप में कई युग्मनजों इंजेक्षन.
    11. 10-15 मिनट के बाद नव निषेचित अंडे कठोर हो जाते हैं और अब किसी भी इंजेक्शन नहीं किया जा सकता. मंच से पकवान निकालें और ध्यान से एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग 3 पर समुद्र के पानी में शुक्राणु बाहर निकालना.
    12. युग्मनजों सूखी मत देना. जल्दी से पकवान कवर करने के लिए ताजा prechilled समुद्र के पानी में जोड़ें. 15 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण सेते

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Representative Results

GFP और mCherry संवाददाता निर्माणों लिखित और नव निषेचित अंडे में microinjected विट्रो में थे. भ्रूण (ब्लासटुला चरण तक) 24 घंटे के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर incubated और जीस प्रेक्षक Z1 माइक्रोस्कोप का उपयोग imaged थे. संवाददाता constructs के इंजेक्शन किसी भी विकास दोष (चित्रा 6) नहीं हो पाई. फ्लोरोसेंट संकेतों की मात्रा का ठहराव के लिए, छवि अधिग्रहण ज़्यादा से ज़्यादा फ्लोरोसेंट पिक्सल (आंकड़े 6D एफ) पर कब्जा करने के लिए कम बढ़ाई (100x) पर प्रदर्शन किया गया था. फ्लोरोसेंट संकेतों AxioVision 4.8.2.0 का उपयोग मात्रा गया. 100-200 blastulae की आबादी के भीतर फ्लोरोसेंट संकेतों की तीव्रता के लिए मानक त्रुटियों (नहीं दिखाया डेटा) 1.5% से अधिक नहीं था.

चित्रा 1
चित्रा 1. microinjection सेटअप. (ए) एक पुनश्च लिपटे diimmobilized अंडे के साथ श (बी) के एक औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर स्थित है. Microinjection सुई (सी) ए (D) दबाव इकाई से जुड़ा है जो एक सुई धारक से जुड़ा हुआ है. एक्स, वाई, जेड और आयामों में आंदोलन (ई) micromanipulator या (एफ) मोटे जोड़तोड़ उपयोग करने के साथ निर्देश दिया है. (जी) कागज तौलिये के साथ लिपटे एक स्क्रू ड्राइवर नव निषेचित अंडे में सुई प्रविष्टि की सुविधा के लिए मामूली कांप प्रेरित करने के लिए धीरे खुर्दबीन मंच का दोहन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. समुद्री अर्चिन के spawning. (एक) समुद्र साही 0.5% KCl की intracoelomic इंजेक्शन से बहाने के लिए प्रेरित किया जाता है. सुई पशु, पशु की ही नरम भाग के मुंह आसपास peristomial झिल्ली को इंगित करता है.(बी) महिला समुद्री साही पीले अंडे एकत्रित करने के लिए एक प्लास्टिक बीकर में समुद्र के पानी में डूबे अपने gonapores के साथ रखा गया है. (सी) सफेद शुक्राणु पुरुष समुद्री साही की gonapores से जारी है.

चित्रा 3
चित्रा 3. . (ए) गिलास micropipette सुई, (ख) प्लास्टिक टयूबिंग, और (सी) एक बाँझ फ़िल्टर्ड P20 या P200 टिप: मुँह पिपेट एक मुँह पिपेट तीन हिस्से होते हैं. कांच micropipette P20 या P200 टुकड़ा मुंह से जुड़ा है जो प्लास्टिक टयूबिंग में डाला जाता है.

चित्रा 4
चित्रा 4. Microinjection सुई. (ए) microinjection सुई पुल हैएक विशिष्ट स्थापना के साथ एक सुई खींचने का उपयोग का नेतृत्व किया. सुई खींचने की सेटिंग अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए. एक Narishege पीसी -10 सुई खींचने का उपयोग, हम गर्मी 2 स्थापित करने के लिए 1 स्थापित करने के लिए गर्मी के लिए 72.8 डिग्री सेल्सियस का उपयोग और 83.7 डिग्री सेल्सियस. थाली पर खरोंच का प्रयोग हम समाधान के प्रवाह की सुविधा के लिए सुई की नोक टूट गया. (बी) अच्छा सुई नोक पर 5 माइक्रोन को कंधे पर 50 माइक्रोन की चौड़ाई से 500-600 मीटर की लंबाई होना चाहिए.

चित्रा 5
चित्रा 5. नव निषेचित समुद्री साही अंडे का इंजेक्शन. Dejellied अंडे एक पुनश्च लेपित पकवान और निषेचित पर rowed गया. (ऊपर से नीचे तक) युग्मनजों की रेखा के साथ खुर्दबीन मंच चलती है जबकि हाल में निषेचित अंडे एक के बाद एक इंजेक्शन थे. (ए) इंजेक्शन सांस में स्पष्ट रूप से नव निषेचित अंदर गठन देखा जा रहा हैसुई की नोक पर अंडे. (बी) पारदर्शी निषेचन लिफाफा निषेचन पर बनाई है. (सी) शुक्राणु पृष्ठभूमि में के रूप में छोटे काले डॉट्स दिखाई देते हैं. स्केल बार 50 माइक्रोन है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
चित्रा 6. विकास या रूपात्मक दोष के बिना blastulae में विकसित microinjected युग्मनजों. नव निषेचित अंडे उन्हें स्पष्ट रूप से (तीर द्वारा दिखाया गया है) uninjected भ्रूण से प्रतिष्ठित किया जा करने की अनुमति जो फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ इंजेक्शन थे. (एसी) भ्रूण 400X बढ़ाई imaged. (डीएफ) भ्रूण विश्वसनीय मात्रा का ठहराव के लिए उत्सर्जित प्रतिदीप्ति संकेतों के सबसे कब्जा करने के लिए 100X बढ़ाई imaged हैं. बाद 24 घंटा पीost निषेचन, blastulae एकत्र और 1x समुद्र के पानी से धोने के द्वारा पीछा तैराकी भ्रूण 3, स्थिर करने के लिए 2 मिनट के लिए 2x समुद्र के पानी के साथ इलाज किया गया. छवियाँ जीस प्रेक्षक Z1 माइक्रोस्कोप और AxioCam monochromic कैमरे के साथ हासिल किया गया. (ए, डी) blastulae की डीआईसी छवियों. (बी, ई) में इन विट्रो साथ इंजेक्शन भ्रूण की ओवरले छवियों प्रतिदीप्ति और डीआईसी चैनलों में mCherry लिखित. (सी, एफ) में इन विट्रो साथ इंजेक्शन भ्रूण की ओवरले छवियों प्रतिदीप्ति और डीआईसी चैनलों में GFP लिखित. स्केल बार 50 माइक्रोन है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

Microinjection डीएनए, mRNA, पुनः संयोजक प्रोटीन, समारोह के नुकसान और अंडे, भ्रूण, और विभिन्न जीवों 1-7 की कोशिकाओं में समारोह अभिकर्मकों, रंग और उनके संयोजन के लाभ के रूप में विभिन्न उपचार देने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है. एक microinjection प्रयोग डिजाइन हालांकि, जब कई कारणों को ध्यान में रखा जाना चाहिए.

यह दिया उपचार और इंजेक्शन की मात्रा की घुलनशीलता पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है. Microinjected समाधान भी एक मामूली वेग प्रपत्र जाता है, तो microinjecting सुई भरा किया जाएगा. आम तौर पर यह किसी भी वेग समाधान 3 से निकाल दिया जाता है सुनिश्चित करने के लिए सुई में लोड करने से पहले अधिक से अधिक 15 मिनट के लिए समाधान अपकेंद्रित्र की सिफारिश की है. अन्य दृष्टिकोण Millipore स्पिन कॉलम के माध्यम से समाधान पारित करने के लिए है. यह clogging से बचने के लिए संभव नहीं है, तो इसे फिर से टिप तोड़ने सज्जन द्वारा सुई unclog करने के लिए संभव हो सकता हैलेकिन यह टिप बहुत व्यापक है, तो समाधान के प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए कठिन हो जाता है. इंजेक्शन समाधान की बड़ी राशि भ्रूण को विषाक्त किया जा सकता है, इसके अलावा, व्यापक टिप व्यक्तिगत भ्रूण में इंजेक्ट समाधान के संस्करणों के बीच अधिक से अधिक विविधताओं का परिचय. यह नव निषेचित अंडे में इंजेक्शन मात्रा की राशि समायोजित की जाती है कि यह भी महत्वपूर्ण है. इंजेक्शन मात्रा तेल में समाधान इंजेक्शन द्वारा पीछा विभिन्न सेटिंग्स में सुई खींच कर calibrated किया जा सकता है. इस छोटी बूंद 32 के व्यास (और इस प्रकार मात्रा) को मापने के लिए अनुमति देता है. हम चित्रा 5 में दिखाया गया है नव निषेचित अंडे में इंजेक्शन समाधान के लिए एक स्वीकार्य राशि युग्मनज का 1/5 व्यास अधिक नहीं होनी चाहिए कि लगता है.

मुख्य सलाह तेजी से काम करने, सही इंजेक्शन से पहले सुई लोड करने के लिए, और अक्सर में दुकान को अधिकतम उपलब्ध दबाव के आवेदन चलाता है जो सुई लगानेवाला की सफाई बटन समारोह का उपयोग करने के लिए हैअवरुद्ध इंजेक्शन की सुई को बाहर निकलवाने के लिए आदेश.

पहले इंजेक्शन अंडे से शुक्राणु और मलबे सुई की नोक से चिपके रहते हैं कभी कभी जब सुई, बाहर से रोकना हो सकता है. उस मामले में, यह सुई इंजेक्शन लगाने के पकवान में 3 पर पानी से सभी तरह से बढ़ाने के लिए उपयोगी है. आमतौर पर तरल एयर इंटरफेस की वजह से तनाव मलबे को हटाने के लिए पर्याप्त है. वैकल्पिक रूप से, धीरे इंजेक्शन थाली पर खरोंच के खिलाफ इंजेक्शन सुई सँवार भी मदद मिल सकती है. चरम मामले में, यह टपकता गीला Kimwipe के साथ सुई की नोक साफ करने के लिए संभव है. हालांकि, इस तरह पोंछते अत्यधिक सावधानी और अभ्यास की आवश्यकता है.

ऐसे में 10,000 मेगावाट टेक्सास लाल लाइसिन रूप फ्लोरोसेंट रंजक (2 मिलीग्राम / एमएल) dextran का आरोप लगाया और पता लगाया इंजेक्शन समाधान के विश्वसनीय सामान्य बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक मजबूत संकेत का उत्पादन. MRNA इंजेक्शन जा रहा है, यह में की mRNA के साथ mCherry या GFP mRNAs साथ coinject की सिफारिश की हैकोई mRNA गिरावट हुई सुनिश्चित करने के लिए ब्याज. उस मामले में फ्लोरोसेंट संकेत के दृश्य mCherry या GFP के अनुवाद पर निर्भर है. रंगों या फ्लोरोसेंट निर्माणों का उपयोग संभव नहीं है, तो यह है कि डिश पर सभी नव निषेचित अंडे इंजेक्ट कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए हर व्यक्ति के पकवान पर अंडे की एक छोटी राशि पंक्ति की सिफारिश की है.

अंत में, microinjection आनुवंशिकी, आणविक, सेलुलर, और विकासात्मक जीव विज्ञान में अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है. इस तकनीक का उपयोग, समुद्री साही समुदाय इस तरह के सेल भाग्य विनिर्देश, जीन समारोह, जीन विनियमन और जैव रासायनिक रास्ते अंतर्निहित भ्रूण के विकास के रूप में 16 सेल और विकासात्मक जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ के लिए महत्वपूर्ण योगदान दिया है.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों या हित के अन्य संघर्ष की घोषणा.

Acknowledgments

हम फोटोग्राफी में सहायता के लिए पांडुलिपि और बेटी Cowgill के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए सैंटियागो सुआरेज़ धन्यवाद. हम भी उनके महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया के लिए अनाम समीक्षक धन्यवाद. इस काम के विश्वविद्यालय डेलावेयर रिसर्च फंड द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass Pasteur pipettes VWR 14673-043  
Inverted microscope  Axiovert 40 °C Zeiss 4109431007990000 Injection microscope
Microloader tips Eppendorf 5242 956.003 Load injection solution
Nylon filter mesh 80 μm Amazon.com 03-80-37 Filter eggs to get rid of debris
P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips Fisher Scientific 02707432 or 02707430 Part of a mouth pipette
Parafilm Fisher Scientific 13 374 12 Part of a mouth pipette
Polyethylene tubing Intramedic PE-160 Part of a mouth pipette
Protamine sulfate MP Biomedicals, LLC 194729 Attach dejellied eggs to injection dishes
Sea urchins S. purpuratus Pt. Loma Marine Invertebrate Lab N/A  
Sea water any pet store Instant Ocean  
Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish Fisher Scientific 0875713A Injection dishes
Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 Narishige 9124 Manipulate injection needle
Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND Narishige 9212 Manipulate injection needle
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM  
Vertical  needle puller  Narishige PC-10 Pull injection needles

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 83 समुद्री अर्चिन microinjection समुद्री साही भ्रूण इलाज के वितरण उच्च throughput मुँह पिपेट डीएनए निर्माणों mRNAs morpholino antisense oligonucleotides
समुद्री साही युग्मनजों के उच्च throughput microinjections
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Stepicheva, N. A., Song, J. L. High… More

Stepicheva, N. A., Song, J. L. High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes. J. Vis. Exp. (83), e50841, doi:10.3791/50841 (2014).

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