Summary
A ecocardiografia é comumente usada para caracterizar e quantificar alterações na estrutura e função cardíaca. Descrevemos um algoritmo de imagem baseado em ultrassom que oferece uma medida de substituto aprimorada da microestrutura do miocárdio e pode ser realizado usando software de análise de imagem de acesso aberto.
Abstract
A ecocardiografia é uma modalidade de imagem amplamente acessível que é comumente usada para caracterizar e quantificar alterações na estrutura e função cardíaca. Avaliações ultrassônicas do tecido cardíaco podem incluir análises da intensidade do sinal de backscatter dentro de uma determinada região de interesse. Técnicas previamente estabelecidas têm se apoiado predominantemente no valor integrado ou médio das intensidades de sinal de backscatter, que podem ser suscetíveis à variabilidade a partir de dados aliased de baixas taxas de quadros e atrasos de tempo para algoritmos baseados na variação cíclica. Aqui, descrevemos um algoritmo de imagem baseado em ultrassom que se estende a partir de métodos anteriores, pode ser aplicado a um único quadro de imagem e explica a distribuição completa dos valores de intensidade de sinal derivados de uma dada amostra de miocárdio. Quando aplicado a dados representativos de camundongos e imagens humanas, o algoritmo distingue entre sujeitos com e sem exposição à resistência crônica pós-carga. O algoritmo oferece uma medida de substituto aprimorada da microestrutura miocárdio e pode ser realizado usando software de análise de imagem de acesso aberto.
Introduction
A ecocardiografia é uma modalidade de imagem amplamente acessível que é comumente usada para caracterizar e quantificar alterações na estrutura e função cardíaca. Avaliações ultrassônicas do tecido cardíaco podem incluir análises da intensidade do sinal de backscatter dentro de uma determinada região de interesse em um único ponto no tempo, bem como ao longo do ciclo cardíaco. Estudos anteriores sugerem que medidas de intensidade de sinal sonográfico podem identificar a presença subjacente da desordem da fibra miocárdia, tecido miocárdio viável versus inviável e fibrose interstícia1-3. Referimo-nos à "microestrutura" do miocárdio como a arquitetura tecidual que pode ser caracterizada, utilizando análise sonográfica, além de medições lineares de tamanho bruto e morfologia. Assim, foram utilizadas análises de intensidade de sinal sonográfico para avaliar alterações microestruturais do tecido miocárdio no cenário de cardiomiopatia hipertrófica e dilatada4,5, doença arterial coronariana crônica6,7e doença cardíaca hipertensiva8,9. No entanto, técnicas previamente estabelecidas têm se apoiado predominantemente no valor integrado ou médio das intensidades de sinal de backscatter, que podem ser suscetíveis à variabilidade do ruído aleatório5, dados aliased de baixas taxas dequadros 10, e atrasos de tempo para algoritmos baseados na variação cíclica11.
Aqui, descrevemos o método de usar um algoritmo de análise de imagem baseado em ultrassom que se estende a partir de métodos anteriores; este algoritmo se concentra em um único quadro de dia diastólica final para análise de imagem e explica a distribuição completa dos valores de intensidade de sinal derivados de uma determinada amostra do miocárdio. Usando o pericárdio como referência in-frame12,13,o algoritmo quantifica a variação nas distribuições de intensidade de sinal sonográfico e oferece uma medida de substituto aprimorada da microestrutura miocárdia. Em um protocolo passo a passo, descrevemos métodos para preparar imagens para uso, amostragem de regiões de interesse e processamento de dados dentro de regiões de interesse selecionadas. Também mostramos resultados representativos da aplicação do algoritmo a imagens ecocardiográficas adquiridas de camundongos e humanos com exposição variável ao estresse pós-carga no ventrículo esquerdo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Elaboração de Imagens para Análises
- Obtenha imagens do modo B ecocardiográficos murinos ou humanos na visão de longo eixo parasténal. Ajuste as configurações de compensação de ganho de tempo e a colocação do foco de transmissão para otimizar a visualização da LV e outras estruturas cardíacas na visão parasternal, por prática usual. Certifique-se de que todas as imagens sejam salvas em formato de arquivo DICOM. As visualizações padronizadas da imagem colocam a parede ventricular esquerda inferolateral na base do quadro. Os quadros devem exibir a totalidade do miocárdio ventricular esquerdo e pericárdio. A resolução deve ser alta o suficiente para demarcar a fronteira pericárdia, a parede do miocárdio e a borda endocardial do ventrículo esquerdo. Descarte imagens com excesso de abandono ou artefatos de imagem.
- Importe um arquivo de imagem para análise na plataforma de software ImageJ v1.46 como um arquivo DICOM. Converta o arquivo em um arquivo de imagem de 8 bits.
- Role por quadros consecutivos do ciclo cardíaco até atingir um quadro de qualidade adequada. Alternativamente, selecione o quadro de dia diastólica final em um programa de visualização ecocardiográfica e, em seguida, exporte para um formato de arquivo .jpg de alta resolução para uso no ImageJ. Identifique os quadros mais próximos da estatóstola final usando a onda R do rastreamento ECG e, em seguida, identifique o único melhor quadro que captura o LV com dimensão interna máxima. Considere este quadro único o quadro de dia diastólica final.
- Sugere-se que os usuários fiquem cegos à identidade do sujeito ao selecionar regiões de interesse.
2. Amostragem de ROI
- Seleção de referência pericárdio. Ao selecionar a região pericárvia de interesse (ROI), procure capturar a heterogeneidade do tecido pericárdico. Observe que o brilho e o contraste da imagem podem ser ajustados para a seleção do ROI, conforme necessário, sem qualquer efeito sobre os resultados da análise.
- Usando a ferramenta de desenho retângulo do ImageJ, selecione um retângulo com comprimento aproximando o terço médio da parede pericárdia inferolateral basal.
- Redimensione o ROI retangular para estender a largura do pericárdio usando a ferramenta de dimensionamento do ROI.
- Gire o ROI para ficar dentro da região pericárvia usando a ferramenta rotativa do ImageJ.
- Faça os ajustes necessários nos cantos do ROI pericárdica. Capture uma região pericárdia final de interesse que fica dentro do terço médio da parede pericárdia, e inclui a largura da parede pericárdia sem estender-se para as regiões miocáridas ou extra-cardíacas. Objetivo de capturar a mesma localização relativa e percentual da área pericárvia total para todas as medidas feitas em um determinado estudo.
- Aplique o algoritmo à seleção através de ferramentas de análise ImageJ (ver seção 3).
- Seleção do miocárdio. Mais uma vez, procure capturar a heterogeneidade do tecido miocárdio dentro do terço médio da parede do miocárdio basal inferolateral. Observe que o brilho e o contraste da imagem podem ser ajustados para a seleção do ROI, conforme necessário, sem qualquer efeito sobre os resultados da análise.
- Selecione um retângulo que abrange a largura da parede do miocárdio, excluindo o endoárdio e o epicárdio. Certifique-se de que a seleção do miocárdio está adjacente à seleção pericárvia e no mesmo ângulo. Não inclua áreas de músculo papilar dentro da área de seleção.
- Gire o ROI miocárdico de tal forma que ele esteja paralelo à seleção pericárvia.
- Faça os ajustes necessários nos cantos do ROI miocárdio. Isole uma região final do miocárdio de interesse que fica dentro do terço médio da parede do miocárdio, e captura a largura da parede sem se estender para as regiões pericáridas ou intraluminais.
- Aplique o algoritmo à seleção através de uma macro ImageJ.
3. Análise e Processamento de Dados
- Instale a macro ImageJ chamada "getHistogramValues.txt".
- Use a ferramenta de análise histograma ImageJ para visualizar a distribuição dos valores de intensidade do sinal dentro do ROI (realize esta etapa para a seleção pericárvia e para a seleção do miocárdio).
- Use a macro ImageJ para registrar esses valores de densidade de sinal para o ROI (realize esta etapa para a seleção pericárcial e para a seleção do miocárdio).
- Atribua um valor de intensidade de 0 (mais escuro) a 255 (mais brilhantes) unidades a cada pixel dentro da seleção.
- Organizar os valores de intensidade hierarquicamente, em ordem de aumento de intensidade, para produzir uma distribuição da intensidade do sinal.
- Selecione e reporte os seguintes valores percentil para a distribuição: percentil 20, percentil de 50º (mediano) e 80percentil.
- Normalize as intensidades do miocárdio usando a referência pericárvia.
- Normalizar dividindo os valores percentil de intensidade do miocárdio pelos valores percentil pericárdico correspondentes de intensidade12, ou subtraindo o valor percentil do miocárdio de intensidade do valor percentil pericárdico da intensidade13.
- Valores do relatório para os quatro métodos analíticos: valores normalizados do miocárdio para pericárdio para os valores de 20percentil, percentil de 50º percentil (mediano) e 80º percentil.
4. Quantificando a Variabilidade Cíclica
- Aplique algoritmo às seleções do miocárdio através de quadros consecutivos do arquivo DICOM, movendo-se através do ciclo cardíaco. Compare diferenças nas distribuições de intensidade entre os quadros, com atenção aos quadros sistólicos e terminais.
Todas as análises de imagem descritas acima são realizadas offline em imagens ecocardiográficas não invasivas previamente adquiridas e armazenadas digitalmente em formato DICOM. Todos os protocolos de estudo foram aprovados pelo conselho de revisão institucional da Brigham and Women's e pelo Comitê de Cuidados e Uso Institucional da Área Médica de Harvard.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A análise da intensidade do sinal é realizada em 4 etapas principais(Figura 1), incluindo: 1) seleção e formatação de imagens, 2) roi amostral e áreas de referência, aplicação de algoritmos 3 e 4) processamento de valores finais para produzir relações de intensidade miocárdio-pericárcial. A seleção e o tamanho do ROI são padronizados para limitar o interusário, bem como a variabilidade intrausuária(Figura 2). O posicionamento de cada ROI também é padronizado em relação às estruturas anatômicas de cada sujeito para limitar a variabilidade intersubjeto, bem como a variabilidade intrasubjeto.
Como medida da densidade do miocárdio, espera-se que o algoritmo revele alterações na intensidade do sinal ao longo do ciclo cardíaco, correspondendo ao aumento previsto na densidade do miocárdio em sístole em comparação com a diastole. Como mostrado na Figura 3, valores percentil mais elevados de intensidade de sinal acentuam a variabilidade cíclica em camundongos com e sem 7 semanas de exposição à resistência pós-carga (ou seja, um rato que sofreu constrição aórtica ascendente em comparação com um rato de controle de veículo que foi submetido a uma cirurgia falsa).
A partir da análise de um único quadro diastólico final(Figura 4),diferenças significativas também são notadas tanto para os sujeitos camundongos quanto humanos expostos ao estresse crônico de pós-carga (casos) em comparação com suas contrapartes representativas (controles). Tanto o alcance quanto a magnitude da intensidade do sinal diferem entre os casos e os controles. Como visto nas análises da variabilidade cíclica, 80em comparação com 50 valores percentil dentro de cada distribuição de intensidade de sinal sugerem uma maior diferença relativa na intensidade do sinal entre os casos e os controles.
O algoritmo aqui apresentado fornece saída na forma de relações miocárdio-pericárdico de intensidade de sinal, onde os valores pericárdicos servem como referência no quadro(Figura 5). A razão de intensidade do sinal miocárdio-pericárdico foi determinada com base na análise de quadro único de imagens adquiridas a partir de controles representativos e casos de estresse pós-carga. Concordando com os resultados acima, a relação miocárdio-pericárdico de 80valores de intensidade de sinal percentil oferece a maior capacidade de diferenciar entre controles e casos. As diferenças esperadas na microestrutura miocárdia, com base em nossos resultados de análise de imagem, foram consistentes com os achados da histologia do tecido miocárdio no controle e dos camundongos em 7 semanas após a cirurgia de sham ou aórtica, respectivamente(Figura 6).
Figura 1. Processo de fluxo de trabalho para uma imagem individual. O processo inclui quatro etapas principais que podem ser repetidas ao comparar sujeitos ou ao quantificar a variabilidade cíclica.
Clique aqui para ver imagem maior.
Figura 2. Técnica de amostragem da Região de Interesse (ROI). O algoritmo de análise de imagem é padronizado para aplicação em camundongos (A) e em humanos(B). Seleções miocárdia e pericárdia para imagens representativas de ratos e humanos, respectivamente, são mostradas.
Clique aqui para ver imagem maior.
Figura 3. Variação da intensidade do sinal sonográfico ao longo do ciclo cardíaco. O algoritmo foi aplicado a uma região miocárdio de interesse sobre quadros consecutivos de imagens DICOM adquiridas de um mouse de controle representativo (A) e um mouse de banda aórtica(B). A taxa de quadros foi de 212 para ambas as imagens. Para essas imagens, a variabilidade cíclica foi avaliada utilizando-se 3 pontos de corte: percentil 20 (diamante), percentil 50 (quadrado) e 80percentil (triângulo). A variabilidade cíclica relativa é maior para os valores percentil 80do que para os valores de corte mais baixos. Clique aqui para ver imagem maior.
Figura 4. As distribuições de intensidade de sinal são mostradas a partir da análise de um único quadro de imagens representativas do mouse e humanos. Os histogramas exibem distribuições de intensidade de sinal derivadas do miocárdio de um rato de controle às 7 semanas após a cirurgia falsa(A),um rato de banda aórtica às 7 semanas após a cirurgia(B),um humano normotensivo(C)e um humano hipertenso(D). Linhas verticais azuis denotam 20percentil, 50percentil e 80valores percentil. As distribuições de intensidade de sinal são deslocadas à direita, e são maiores em alcance, para os sujeitos com estresse crônico pós-carga (ou seja, banda aórtica em comparação com o rato de controle, e hipertenso em comparação com o humano normotenso).
Clique aqui para ver imagem maior.
Figura 5. Dados representativos produzidos pelo algoritmo de análise de imagens. (A) mostra dados de um mouse operado por sham (controle) em comparação com o mouse (caso) aórtico em 7 semanas. (B) mostra dados de um humano com pressão arterial normal (controle) em comparação com um humano com hipertensão crônica (caso). A razão de intensidade do sinal miocárdio-pericárdico foi determinada utilizando-se 3 métodos analíticos dentro do algoritmo: razão de valores percentil de 20º; razão de 50valores percentil; e razão de 80valores percentil. A maior diferença entre controles e casos é demonstrada pelo uso de proporções dos valores percentil de 80º percentil de intensidade do sinal.
Clique aqui para ver imagem maior.
Figura 6. Diferenças na histologia do tecido miocárdio entre camundongos com e sem exposição ao estresse pós-carga. As seções colorídas tricromáticas do ventrículo esquerdo do representante Masson são mostradas para um rato submetido a uma cirurgia falsa(A: controle) e um rato que foi submetido a bandagem aórtica(B: case) às 7 semanas após a cirurgia. As seções mostram presença de deposição substancial de colágeno e fibrose intersticiais no caso em comparação com o controle. As barras de escala representam 50 μm.
Clique aqui para ver imagem maior.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Descrevemos o protocolo para um algoritmo de análise de imagem que quantifica a distribuição da intensidade do sinal sonográfico e, por sua vez, oferece uma medida substituta da microestrutura miocárdia. As características padronizadas do protocolo, incluindo seleção, dimensionamento e posicionamento do ROI e região de referência, servem para minimizar a variabilidade do usuário e do assunto. Demonstramos que quando aplicado a imagens ecocardiográficas de um quadro único de fim, o algoritmo pode distinguir adequadamente entre miocárdio normal versus miocárdio exposto ao estresse pós-carga.
O protocolo detalha como o algoritmo pode ser empregado usando o pacote de software ImageJ de código aberto. Dentro deste ambiente de análise de imagem, o algoritmo pode ser usado para produzir dados sobre a distribuição de valores de intensidade de sinal a partir de uma dada amostra de tecido miocárdio. As distribuições resultantes de intensidade de sinal podem ser exibidas na forma de histogramas. Histogramas de valores de intensidade dentro das seleções do miocárdio mostram que tecidos miocárdios doentes demonstram uma mudança correta na distribuição, e uma maior gama de valores, quando comparados ao miocárdio não oralácido. Este padrão é visto quando o algoritmo é aplicado a imagens ecocardiográficas humanas e murinas.
A variabilidade na intensidade do sinal durante o ciclo cardíaco é observada para corresponder com alterações fisiológicas na densidade do miocárdio. Acredita-se que um método analítico que distingue consistentemente as alterações de densidade ao longo do ciclo cardíaco seja sensível às diferenças na densidade do miocárdio que ocorrem em resposta aos processos patológicos1,6. De fato, a variabilidade cíclica é observada após a aplicação do algoritmo em quadros consecutivos dentro de ecocardiogramas murinos. Uma maior variação de intensidade ao longo do ciclo cardíaco é observada para valores de intensidade de imagem em maior comparação com percentis mais baixos dentro da distribuição total da intensidade do sinal.
Quando o algoritmo é aplicado a amostras representativas de imagens ecocardiográficas adquiridas de indivíduos com e sem exposição à resistência pós-carga, observa-se que a densidade da razão miocárdio-pericárial a valores percentil selecionados é particularmente eficaz na distinção de indivíduos em comparação com sem exposição à resistência crônica de pós-carga. Esse achado é observado em análises de dados representativos de ratos e humanos. Espera-se que as densidades elevadas do miocárdio sejam observadas no tecido miocárdio de indivíduos expostos ao estresse crônico pós-carga, uma vez que tal estresse é conhecido por promover a deposição intersticiais do colágeno e o desenvolvimento da fibrose miocárdia14. A medição das alterações do tecido miocárdio ao longo do tempo poderia ser usada para proporcionar uma melhor compreensão da resposta tecidual ao estresse prolongado e à progressão da doença. Outros estudos são necessários para avaliar se as variações na intensidade do sinal se correlacionam com as mudanças histológicas ao longo do tempo, bem como com a gravidade crescente de um determinado fenótipo da doença.
O algoritmo de análise de imagens tem aplicabilidade limitada a imagens com artefatos que interfeririam com o ROI e/ou seleção de referência, visualização incompleta das bordas do endocárdia ou má qualidade geral. O algoritmo pode não ser capaz de comparar com precisão regiões de interesse do miocárdio e pericárdico quando os valores percentil demonstram um padrão não linear no mapeamento em escala de cinza, ou quando o alcance dinâmico insuficiente é empregado. Embora tais instâncias sejam raras entre os valores percentil de 10 a 90anos de intensidade de sinal na maioria dos fenótipos, a avaliação preliminar da linearidade do backscatter e do alcance dinâmico pode ser justificada para estudar novos fenótipos de interesse e/ou analisar imagens adquiridas usando técnicas de ultrassom não convencionais. O algoritmo também é limitado pela falta de automação do PROCESSO DE SELEÇÃO DE AMOSTRAS DE REFERÊNCIA e ROI. Além disso, o algoritmo tem capacidade limitada de uso em comparações cruzadas de imagens capturadas usando parâmetros de aquisição ecocardiográficas marcadamente diferentes. No relatório atual, as imagens em camundongos foram adquiridas utilizando um transdutor de 18-38 MHz a taxas de quadros que variam de 225-247 fps; imagens em humanos foram adquiridas usando um transdutor de 1-5 MHz a taxas de quadros que variavam de 34-54 fps. Outros estudos são necessários para determinar possíveis revisões de protocolo que possam ser necessárias para imagens adquiridas utilizando diferentes equipamentos e a taxas de quadros em excesso das faixas acima relatadas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
Acknowledgments
Somos gratos pelos recursos fornecidos pela Harvard Medical School/Brigham e pelo Women's Hospital Cardiovascular Physiology Core Laboratory Laboratory. Este trabalho foi apoiado em parte por financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde HL088533, HL071775, HL093148 e HL099073 (RL). MB recebeu um prêmio de pós-doutorado da American Heart Association. Ku é um beneficiário de um prêmio de bolsa de pós-doutorado da American Heart Association. SC foi apoiado por um prêmio da Fundação Ellison.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageJ v 1.46 | NIH (Bethesda, MD) | open access software | |
| Power ShowCase | Trillium Technology (Ann Arbor, MI) | commercial software |
References
- Yamada, S., Komuro, K. Integrated backscatter for the assessment of myocardial viability. Curr. Opin. Cardiol. 21, 433-437 (2006).
- Mimbs, J. W., O'Donnell, M., Bauwens, D., Miller, J. W., Sobel, B. E. The dependence of ultrasonic attenuation and backscatter on collagen content in dog and rabbit hearts. Circ. Res. 47, 49-58 (1980).
- Picano, E., et al. In vivo quantitative ultrasonic evaluation of myocardial fibrosis in humans. Circulation. 81, 58-64 (1990).
- Mizuno, R., et al. Myocardial ultrasonic tissue characterization for estimating histological abnormalities in hypertrophic cardiomyopathy: comparison with endomyocardial biopsy findings. Cardiology. 96, 16-23 (2001).
- Mizuno, R., Fujimoto, S., Saito, Y., Nakamura, S. Non-invasive quantitation of myocardial fibrosis using combined tissue harmonic imaging and integrated backscatter analysis in dilated cardiomyopathy. Cardiology. 108, 11-17 (2007).
- Marini, C., et al. Cyclic variation in myocardial gray level as a marker of viability in man. A videodensitometric study. Eur. Heart. J. 17, 472-479 (1996).
- Komuro, K., et al. Sensitive detection of myocardial viability in chronic coronary artery disease by ultrasonic integrated backscatter analysis. J. Am. Soc. Echocardiogr. 18, 26-31 (2005).
- Ciulla, M., et al. Echocardiographic patterns of myocardial fibrosis in hypertensive patients: endomyocardial biopsy versus ultrasonic tissue characterization. J. Am. Soc. Echocardiogr. 10, 657-664 (1997).
- Maceira, A. M., Barba, J., Varo, N., Beloqui, O., Diez, J. Ultrasonic backscatter and serum marker of cardiac fibrosis in hypertensives. Hypertension. 39, 923-928 (2002).
- D'Hooge, J., et al. High frame rate myocardial integrated backscatter. Does this change our understanding of this acoustic parameter. Eur. J. Echocardiogr. 1, 32-41 (2000).
- Finch-Johnston, A. E., et al. Cyclic variation of integrated backscatter: dependence of time delay on the echocardiographic view used and the myocardial segment analyzed. J. Am. Soc. Echocardiogr. 13, 9-17 (2000).
- Di Bello, V., et al. Increased echodensity of myocardial wall in the diabetic heart: an ultrasound tissue characterization study. J. Am. Coll. Cardiol. 25, 1408-1415 (1995).
- Takiuchi, S., et al. Quantitative ultrasonic tissue characterization can identify high-risk atherosclerotic alteration in human carotid arteries. Circulation. 102, 766-770 (2000).
- Querejeta, R., et al. Serum carboxy-terminal propeptide of procollagen type I is a marker of myocardial fibrosis in hypertensive heart disease. Circulation. 101, 1729-1735 (2000).
