Summary
Poly (ethyleenglycol) (PEG) brush-arm stervormige polymeren (BASPs) met nauwe massaverdeling en afstembare nanoscopische maten worden gesynthetiseerd via ringopening metathese polymerisatie (ROMP) een PEG-norborneen macromonomeer gevolgd door overdracht van gedeelten van de resulterende levende borstel initiator flesjes met verschillende hoeveelheden van een stijve, foto afsplitsbare bis-norborneen verknopingsmiddel.
Abstract
Geschikte methodes voor de snelle, parallelle synthese van divers gefunctionaliseerde nanodeeltjes ontdekking van nieuwe formuleringen voor drug delivery, biologische beeldvorming, en ondersteund katalyse mogelijk te maken. In dit rapport, tonen we aan parallelle synthese van borstel-arm ster polymeer (BASP) nanodeeltjes door de "brush-first"-methode. Bij deze werkwijze wordt een-norborneen eindigend poly (ethyleenglycol) (PEG) macromonomeer (PEG-MM) Eerst gepolymeriseerd via ringopenende metathese polymerisatie (ROMP) een levende borstel macroinitiator genereren. Porties van deze initiator voorraad oplossing worden toegevoegd aan flesjes die gevarieerde hoeveelheden van een afbreekbaar bis-norborneen crosslinker bevatten. Blootstelling aan crosslinker initieert een reeks van kinetisch-gecontroleerde borstel + kwast en ster + ster koppeling reacties die uiteindelijk oplevert BASPs met kernen bestaat uit de crosslinker en corona bestaat uit PEG. De uiteindelijke BASP hangt af van de hoeveelheid verknopingsmiddel toegevoegd. Wij voeren de synstelling van drie BASPs op de werkbank zonder speciale voorzorgsmaatregelen om lucht en vocht te verwijderen. De monsters worden gekarakteriseerd door gelpermeatiechromatografie (GPC); afgesproken resultaten samen met onze eerdere rapport dat inert (handschoenkast) omstandigheden toegepast. Belangrijkste praktische kenmerken, voordelen en mogelijke nadelen van de borstelvormige eerste methode besproken.
Introduction
Polymere nanodeeltjes zijn uitgebreid onderzocht op hun potentieel gebruik als platform voor drug delivery, ondersteund katalyse, biologische beeldvorming, en zelf-assemblage 1-3. Moderne toepassingen vereisen dat nanodeeltjes syntheses zijn facile, reproduceerbaar, compatibel met chemische functionaliteiten, en vatbaar voor diversificatie 4,5. Ringopening metathese polymerisatie (ROMP) van gespannen olefinen is een krachtige methode voor de synthese van functionele polymere nanostructuren met gecontroleerde grootte en smalle massaverdeling 1,6-8. Zo kunnen gefunctionaliseerde norborneen-poly (ethyleenglycol) (PEG) macromonomeren (MMS) doeltreffend worden gepolymeriseerd via ROMP water oplosbare fles-borstel polymeren genereren. Met deze aanpak kan nanostructuren die meerdere losmaakbare drugmolecules, fluoroforen, en rotatie-contrastmiddelen dragen snel en parallel 6, 9, 10 worden bereid.
ROMP is ook gebruikt voor de "arm-first" synthese van stervormige polymeren. In het arm-eerste methode worden lineaire polymeren verknoopt met een multifunctioneel verknopingsmiddel bolvormige nanostructuren geven met polymere armen. Schrock en medewerkers meldde de eerste arm-eerst ROMP synthese van stervormige polymeren via crosslinking van norborneen, dicarbomethoxynorbornadiene en trimethylsilyl beschermde dicarboxynorbornene lineaire polymeren met een bifunctioneel verknopingsmiddel norborneen. 11 is 12 Buchmeiser deze methodiek verlengd voor de synthese van materialen met een waaier van toepassingen die worden ondersteund katalyse, tissue-engineering, en chromatografie 13-17 omvatten. Otani en collega's hebben sterpolymeer nanodeeltjes met functionele oppervlakken via een verwante "in-uit" polymerisatie strategie 18, 19.
De meeste arm-eerst polymerisatie leiden tot een complex samenspel van monomeer, polymeer en sterkoppeling reacties. The laatstgenoemde verloopt via een stap-groeimechanisme die typisch leidt tot brede molecuulgewicht (MW) distributies. Om deze beperking op aanverwante arm-eerste atoomoverdrachtsradicaalpolymerisatie reacties te overwinnen, Matyjaszewski en collega's uitgevoerd arm-eerste verknoping van voorgevormde polymere MMS naar sterpolymeren voorzien van zeer smalle MW distributies 20. In dit geval, de sterische omvang van de MMS, en de verhoogde verhouding van de ster armen naar sites initiatie, remde slecht gecontroleerde ster + ster koppeling processen, en leidde tot een levende, keten groei mechanisme.
Als we probeerden dezelfde strategie in het kader van ROMP met een norborneen-beëindigde PEG-MM en bis-norborneen verknopingsmiddel, stervormige polymeren met een zeer brede multi-modale MW verdelingen werden verkregen. Dit resultaat suggereerde dat in dit systeem de MM alleen was niet voldoende omvangrijk om ster + ster koppeling remmen. Om de sterische omvang van de ster armen te verhogen, en mogelijk dit uncontro beperkenlled koppeling We probeerden eerst polymeriseren de MM fles-borstel polymeren in afwezigheid van verknopingsmiddel en voeg de crosslinker. We waren blij om te zien dat onder bepaalde voorwaarden, deze "borstel-first"-methode verstrekt eenvoudige toegang tot "borstel-arm sterpolymeren" (BASPs) met smalle MW uitkeringen en afstembare kern en corona functionaliteiten.
We hebben onlangs gemeld de borstelvormige eerste ROMP synthese van PEG BASPs met 3 de generatie Grubbs katalysator A (fig. 1) 21. In dit werk, blootstelling van PEG-MM B katalysator Een gegenereerde een levend penseel macroinitiator met gedefinieerde skeletlengte (B1, figuur 1). Overdracht van hoeveelheden van de B 1 tot en flacons die verschillende hoeveelheden crosslinker C bevatte geïnitieerd BASP-vorming. De MW, en dus de grootte, van de BASPs geometrisch vermeerderd met het bedrag van C toegevoegd. Wij ontvangen een mechanistische hypothese voor deze geometrische groeiproces aangetoond dat functionele nitroxide kern-en-corona gemerkte BASPs kon gemakkelijk bereid zonder de noodzaak voor post-polymerisatie modificatiestappen of sequentieel monomeertoevoegingen. Echter, in alle van de gerapporteerde voorbeelden, we waren bezorgd over katalysatordeactivering, we in een dashboardkastje uitgevoerd alle reacties onder N2-atmosfeer.
Sinds onze eerste rapport, hebben wij gevonden dat de borstelvormige eerste methode is zeer effectief voor de vorming van BASPs uit een breed scala van norborneen beëindigd MMS en crosslinkers. We hebben ook ontdekt dat de methode kan worden uitgevoerd op de werkbank zonder speciale voorzorgsmaatregelen om lucht of vocht te verwijderen.
Hierin wordt een reeks van drie BASPs van verschillende molecuulgewichten worden synthesized door de borstelvormige eerste methode onder omgevingsomstandigheden. In het kort wordt 10 equivalenten B worden blootgesteld aan 1,0 equivalenten van katalysator A (fig. 1a) gedurende 15 min een BI verkregen met een gemiddelde polymerisatiegraad (DP) van 10. Drie monsters van deze partij BI wordt overgedragen aan afzonderlijke flesjes die 10, 15 bevatten, en 20 equivalenten (N, figuur 1b) van C. Na 4 uur wordt de polymerisaties worden afgeschrikt door toevoeging van ethyl vinyl ether. De ster polymeer molecuulgewichten en MW distributies worden gekarakteriseerd met een gelpermeatiechromatografie toestel met multi-angle laser light scattering detector (GPC-MALLS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
We hebben eerst de synthese en zuivering van PEG-MM B beschrijven van 3 kDa O-(2-aminoethyl) polyethyleenglycol (PEG-NH2) en norborneen-N-hydroxysuccinimidyl (NHS) ester. De eerstgenoemde verbinding kan worden gekocht bij Sigma Aldrich Inc, of bereid via anionische polymerisatie volgens literatuurprocedures 22,23. De laatste verbinding kan worden bereid in twee stappen volgens een gepubliceerde werkwijze 21. Vervolgens beschrijven we een synthese van de katalysator A uit commercieel beschikbare Grubbs 2 e generatie katalysator. We tonen dan het gebruik van dit complex borstelvormige eerst BASP synthese. Dit experiment beschrijft de procedure voor het BASPs met N = 10, 15 en 20 van een BI met DP = 10. Alle reacties werden uitgevoerd in een zuurkast met standaard scintillatieflesjes.
LET OP: Draag altijd handschoenen, een lab-jas, en labglazen, en volg gemeenschappelijke laboratoriumveiligheid praktijken bij het werken met gevaarlijke chemische stoffen. Elk organisch oplosmiddel moet in een zuurkast worden behandeld. Vaste stoffen kunnen worden afgewogen op een balans buiten de zuurkast. Chemicaliën mogen niet in contact met de huid, ogen of mond komen. Het wordt sterk aanbevolen om de MSDS read voor elke oplosmiddel en solide gebruikte in deze procedure voor het begin.
1. Bereiding van PEG-MM B
- Add PEG-NH2 (300 mg, 0,0001 mol, 1,0 eq) in een 40 ml scintillatieflesje uitgerust met een roerstaaf.
- Los het PEG-NH2 in 3 ml watervrij N, N-dimethylformamide (DMF).
- Voeg 36 mg norborneen-NHS-ester (0,000105 mol, 1,05 eq) 21.
- Cap de flacon en het reactiemengsel 's nachts geroerd bij kamertemperatuur.
- Verwijder de roerstaaf en voeg diethylether aan de reactieoplossing precipiteert het PEG-MM B.
- Filter de witte griepffy neerslaan en was uitgebreid met diethylether. Alternatief: breng de suspensie tot 50 m centrifugebuis, centrifuge bij 4000 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en decanteer het supernatant. Voeg verse diethylether, centrifuge, en decanteren opnieuw. Wij raden deze procedure te herhalen 3x voor een totaal van 5x.
- Droog het neerslag onder vacuüm gedurende 24 uur om achtergebleven diethylether te verwijderen.
2. Zuivering van PEG-MM
In onze eerdere rapport werd de PEG-MM B bereid uit commercieel verkrijgbaar PEG-NH2 en is gebruikt voor BASP synthese zonder verdere zuivering na drogen (dat wil zeggen na stap 1.7). In deze studie hebben we variëren de PEG-NH2 bron (commercieel versus zelfgemaakte) en we BASP vorming resultaten te vergelijken voor en na strengere preparatieve hogedrukvloeistofchromatografie (prep-HPLC) MM zuivering. In het vervolg van deze studie, de drIED MM verkregen na stap 1.7 wordt aangeduid als B1. Prep-HPLC werd gebruikt om B1 zuiveren B2 geven. Een analoge prep-HPLC gezuiverd MM gesynthetiseerd in ons laboratorium via anionische polymerisatie wordt aangeduid als B3. Prep-HPLC werd uitgevoerd met een Beckmann Coulter HPLC (127P oplosmiddel module en 166p detector module) met een 1-ml monster lus en een Agilent Zorbax 300SB-C18 PrepHT omgekeerde fase kolom bij kamertemperatuur.
- Opstelling HPLC met oplosmiddel A: gedemineraliseerd water (Millipore zuiveringssysteem, 18,2 Ω) met 1% azijnzuur Oplosmiddel B: acetonitril.
- Prime pompen en kolom evenwicht met 95% A en 5% B.
- Los PEG-MM in acetonitril of MeOH (150 mg / ml).
- Filtreer door een 13 mm 0,45 pm Nylon spuit filter.
- Stel HPLC-methode:
- Debiet: 20 ml / min
- 0-1 min: lineaire gradiënt tot 10% B en 90% A
- 1-10 min: linear helling tot 90% B en 10% A
- 10-13 min: overschakelen naar de beginwaarden (5% B en 95%) en opnieuw in evenwicht kolom
- Stel UV-detector om absorptie te detecteren bij 256 nm - Plaats 0,8 ml van het monster op het monster lus.
- Injecteren monster.
- Verzamel de grote absorptie piek (onder de gespecificeerde voorwaarden, het product elueert tussen 5-7 min).
- Herhaal indien nodig. Combineer zuivere fracties samen in een rondbodemkolf.
- Verwijder al het oplosmiddel via roterende verdamping.
- Neem het produkt in dichloormethaan en voeg natriumsulfaat. Schud of roer de kolf regelmatig voor ≅ 1 uur.
- Filtreer het mengsel met behulp van een filter van gesinterd glasfilter.
- Concentreer via roterende verdamping. Droog onder vacuüm gedurende de nacht.
- De PEG-MM kan worden gekarakteriseerd door 1H-NMR CD 2CI 2 (15-20 ml mg/0.7 CD 2 Cl 2, 500 MHz of hoger wordt aanbevolen meer dan 128 scans en relaxatiedelay, d1= 2,0 s) en MALDI-TOF met positieve ionisatie mode en 2 - (4-hydroxyphenylazo) benzoëzuur als de MALDI matrix.
- De PEG-MM worden opgeslagen maanden in een scintillatieflesje bij 4 ° C.
3. Bereiding van katalysator A
- Voeg Grubbs 2 e generatie katalysator (500 mg, 0.589 mmol) aan een 20 ml flesje uitgerust met een roerstaafje.
- Pyridine (ongeveer 0,474 ml, 5,89 mmol, 10 eq) toe te voegen aan de flacon. De kleur van de oplossing moet onmiddellijk veranderen van rood naar groen. Laat de reactie roeren totdat alle rode kleur is verdwenen en de oplossing viskeus (15-30 min).
- Vul het reactieflacon met koud pentaan complexe A precipiteren.
- Filter de schorsing aan de groene neerslag (katalysator A) te verzamelen. Wash 4x met 15 ml koud pentaan.
- Droog de groene vaste stof onder vacuüm gedurende de nacht.
- Complex A kanmaanden opgeslagen bij kamertemperatuur in een exsiccator benchtop zonder significant verlies van activiteit. Voor extra voorzorgsmaatregel, hebben we meestal slaan het complex in een -20 ° C vriezer in een dashboardkastje. Voor het gemak hebben we pre-wegen bekende hoeveelheden van A in 4 ml scintillatieflesjes onmiddellijk na drogen (stap 3.5). We bewaar deze flesjes in het dashboardkastje vriezer. Als u klaar bent om een ROMP reactie uitgevoerd, we nemen gewoon een flacon uit het dashboardkastje en gebruiken zoals hieronder beschreven (stap 4.4).
4. Voorbereiding op voorraad Solution of Living Brush Polymer (BI) met DP = 10
- In een 3 ml injectieflacon met een gasdichte schroefdop voorzien van een roerstaaf, wegen uit 65 mg (0,020 mmol, 10 eq) van MM B. Deze hoeveelheid komt overeen met 20 mg MM voor elk van de 3 verschillende maten BASPs en 5 mg overgebleven voor GPC analyse van de BI. Met een spatel de MM rechtstreeks aan de bodem van de flacon voegen. Try materiaal voorkomen hechten aan de wanden van het flesje en dit scenario zou kunnen leiden tot MM verontreiniging in het uiteindelijke product BASP.
- Los het MM B in 158 pl THF. Onmiddellijk de dop op de flacon na het toevoegen van THF oplosmiddel verdamping te voorkomen. Opmerking: De eindconcentratie van MM tijdens de polymerisatie moet 0,05 M. Indien 158 gl hier THF wordt toegevoegd, vervolgens 243 gl katalysatoroplossing, stap 4.4, zal worden toegevoegd aan 401 ul van THF totaal, dat [MM geven ] = 0,05 M. De hoeveelheid oplosmiddel tijdens deze stap kan worden gevarieerd, zolang de hoeveelheid oplosmiddel tijdens stap 4.4 wordt ook gevarieerd om [MM] 0,05 geven. Wij hebben gevonden dat polymerisaties uitgevoerd met [MM] <0,05 soms niet over tot omzetting te voltooien.
- Laat de oplossing roeren totdat alle MM opgelost. Verwarm lichtjes indien nodig. Vermijd spatten de viskeuze oplossing op de zijkanten of de dop van de flacon.
- Voeg vervolgens een bekende hoeveelheid (2.8mg voor dit voorbeeld) katalysator A een 3 ml flesje (of aanschaffen injectieflacon met vooraf gewogen katalysator A). Voeg watervrij THF (466 pl in dit voorbeeld) een 6 mg / ml katalysatoroplossing geven. De dop op de flacon onmiddellijk. Laat de katalysator om volledig op te lossen;. Schud de flacon indien nodig moet Deze katalysator oplossing onmiddellijk worden gebruikt voor ravotten. Opmerking 1: De katalysator oplossing moet een bos groene kleur. Als het zwart of groen-bruine, dan is waarschijnlijk ontbonden, en het zal waarschijnlijk niet ROMP bevredigende resultaten op. Als ontleding optreedt, raden wij het voorbereiden verse katalysator (volgens punt 3 hierboven), of met behulp van vers gedestilleerd THF. Noot 2: De hoeveelheid THF A wordt gekozen dat de uiteindelijke [MM] is ~ 0,05. Dit bedrag kan worden aangepast, mits compenserende aanpassingen worden gemaakt aan de MM oplossing in stap 4.2.
- Voeg 243 ul (1,46 mg, 1 eq naar B BI onzuiverheid in de finale BASP.
- Cap de flacon onmiddellijk en laat het reactiemengsel roer gedurende 15 minuten om de borstel macroinitiator (BI) te vormen.
5. Vorming van BASPs
- Voeg 3,6 ± 0,1 mg (6,18 umol, 10 eq om de hoeveelheid BI in stap 5.2 worden overgedragen), 5,5 ± 0,1 mg (9.28μmol, 15 eq om de hoeveelheid BI in stap 5.2 worden overgedragen) en 7,3 ± 0.1 mg (12.4μmol, 20 eq om de hoeveelheid BI in stap 5.2 worden overgedragen) verknopingsmiddel C drie afzonderlijke 3 ml flesjes met roerstaafjes. Probeer de crosslinker rechtstreeks wegen op de bodem van de flacon om materiaal te verhinderen zich te houden aan de zijkanten van de flacon. Opmerking: Crosslinker C niet zeer oplosbaar in THF. Daarom wordt de vaste stof direct in deze stap. Wanneer de crosslinker oplosbaar dan een geconcentreerde voorraadoplossing van crosslinker kan worden gemaakt en verschillende hoeveelheden van deze oplossing kan worden overgebracht naar flesjes. Nogmaals, de concentratie van de uiteindelijke polymerisaties worden> 0,05 M, als oplosmiddel wordt toegevoegd aan de crosslinker vervolgens een compenserende verlaging oplosmiddel moet elders worden.
- Voeg 123 pl (0,618 umol) van de BI-oplossing in elk van de drie flesjes die C. Probeer de naald houden net boven de vaste verharder bij toevoegen aan de flacon. Voeg de BI-oplossing in een keer in plaats van druppelsgewijs.
- Cap de flesjes en roer de reacties bij KT totvoltooiing. Met deze specifieke MM en crosslinker combinatie, de reactie voltooid in ongeveer 4 uur; roeren werd gecontinueerd gedurende maximaal 24 uur heeft geen merkbaar effect op BASP groei. Monitor door GPC volledige omzetting van BI waarborgen.
- Blus de reactie door toevoeging van een druppel ethylvinylether de resterende BI oplossing en elk van de N = 10, 15 en 20 BASP reactiemengsels. Roer gedurende 10 minuten om volledige uitdoving waarborgen.
6. GPC Monstervoorbereiding
De GPC-MALLS resultaten werden verkregen op een Agilent 1260 LC systeem uitgerust met een Shodex GPC KD-806M kolom een Wyatt Dawn Heleos-II MALLS-detector en een Wyatt Optilab t-rex brekingsindex detector bij kamertemperatuur. DMF met 0.025 M LiBr met een stroomsnelheid van 1,0 ml / min werd gebruikt als elutiemiddel. Resultaten werden geanalyseerd met Astra 6 software die door Wyatt.
- Met behulp van een nieuwe glazen pipet voor elke reactie flacon, Dompel de pipet tip in de reactie-oplossing voor het opstellen van een kleine steekproef van de reactie. Was de binnenkant van de pipet met 250 gl 0,025 M LiBr in DMF tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer 3 mg / ml.
- Filter de verdunde monster door een 0,45 urn polytetrafluorethyleen filter voordat het afzetten van het monster in een GPC flacon.
- Set-up GPC-MALLS runs en analyseren van de resultaten zodra de runs zijn voltooid.
Lijst van afkortingen:
A: Grubbs 3e generatie bis-pyridine katalysator
B: poly (ethyleenglycol) (PEG) macromonomeer (MM)
B1: PEG MM bereid met behulp van commercieel verkrijgbaar (Aldrich) PEG-NH2 en zonder HPLC zuivering.
B2: PEG MM bereid met behulp van commercieel verkrijgbaar (Aldrich) PEG-NH B3: PEG MM bereid met nieuw gesynthetiseerde PEG-NH2 en gebruikt na HPLC zuivering. BASP: borstel-arm sterpolymeer BI: levende borstel initiatiefnemer C: afbreekbaar verharder Ð: molmassa dispersiteit index DMF: N, N-dimethylformamide DP: aantal-gemiddelde polymerisatie GPC: gelpermeatiechromatografie Prep-HPLC: preparatieve hogedrukvloeistofchromatografie MALLS: multi-angle laserlichtverstrooiing MM: macromonomeer MW: moleculair gewicht Mw: gewicht gemiddeld molar massa N: aantal crosslinker equivalenten (verhouding van C naar A) NHS: N-hydroxysuccinimidyl PEG: polyethyleenglycol PEG-MM: norborneen-PEG macromonomeer (ook aangeduid als verbinding B) ROMP: ring-opening metathese polymerisatie THF: tetrahydrofuraan
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 toont GPC sporen voor verschillende BASPs bereid van B1, B2 en B3. In alle gevallen, de gegevens tonen dat het verhogen van de equivalenten van crosslinker (N) leidt tot een toename van de omvang van de BASP. Zoals waargenomen in onze vorige verslag 10 equivalenten verknopingsmiddel niet voldoende uniforme BASPs bereiken, de N = 10 voorbeeld toont duidelijk multimodaal GPC spoor met een grote hoeveelheid resterend borstel polymeer vooral bij ongezuiverd MM B1 ( Figuur 2a). Grotere hoeveelheden crosslinker resulteren in uniform MW distributies met zeer weinig resterende borstel en MM. De gewichtsgemiddelde molaire massa (Mw) verdubbelt om zich van N = 15 - 20. Bij B3, geen overblijvende mm en kleiner dan 1% blijft residueel BI voor N = 15 en N = 20 gevallen.
Figuur 1. Schema voor borstel-arm ster polymeer (BASP) Synthesis. Paneel (a) illustreert de synthese van Grubbs '3e generatie bispyridine katalysator (A) uit commercieel verkrijgbare Grubbs "2e generatie katalysator. Ook getoond zijn de structuren van de PEG-MM (B) en crosslinker (C) gebruikt in dit werk. Panel (b) toont een schema van de borstelvormige eerste proces. Polymerisatie van PEG-MM (B) met katalysator (A) genereert een 10-eenheid levende borstel initiator (BI), die vervolgens wordt toegevoegd aan verknopingsmiddel (C) leidt tot de vorming van een BASP. ig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Representatieve GPC resultaten van de N = 10, 15 en 20 BASPs bereid uit diverse PEG MMS. Panels (a), (b) en (c) tonen gegevens voor MMS B1, B2 en B3, respectievelijk. Onzuiverheden van commerciële PEG-NH2, ongereageerd MM en residuele BI gelabeld met asterisken. Mw en dispersiteit index (D) waarden worden in de inzet tabellen. Merk op dat d-waarden verkregen door GPC van sterk vertakte nanostructuren 24,25 zorgvuldig worden overwogen. De waarneming van monomodaal, uniforme pieken suggereert een nauwe verdeling van de stralen van de deeltjes.tp_upload/50874/50874fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het belangrijkste voordeel van borstelvormige eerste BASP synthese is het unieke vermogen om snel synthetiseren nanostructuren van verschillende omvang en samenstelling parallel zonder behoefte aan speciale apparatuur. In deze studie demonstreren we de borstelvormige eerste synthetische werkwijze met een norborneen gefunctionaliseerde PEG macromonomeer (B, figuur 1) en een bis-norborneen nitrobenzylester verknopingsmiddel (C, figuur 1). De PEG-ketens van B geven oplosbaarheid in water aan de uiteindelijke BASP structuur. De-nitrobenzyl gebaseerde crosslinker afbreekbaar.
Deze algemene procedure kan worden aangepast voor andere exo-norborneen gebaseerde MMS en verknopingsmiddelen. We hebben BASPs bereid uit verschillende combinaties van beide. Zo hebben we norborneen-PEG-gebaseerde MMS die verschillende anti-kanker geneesmiddelen, nitroxiden, en MRI contrastmiddelen 27 dragen gebruikt. We hebben ook MMS omvat dan PEG polymeren. In onze ervaring, kan de borstel-eerste methode worden toegepast op vrijwel elke functionele exo-norborneen imide beëindigd MM. Wanneer hoge conversies MM BI (> 95%) niet bereikt, een MM onzuiverheid is het waarschijnlijk aan een (in tegenstelling tot katalytische activiteit). Strenger zuivering zoals beschreven in dit rapport (prep-HPLC) leidt meestal tot succesvolle ravotten. Merk op dat we niet hebben geprobeerd ROMP polymerisaties met MMs dat onbeschermde functionele groepen waarvan bekend is dat interfereren met katalysator A (bv. gratis amines, alkenen, aziden, etc.) dragen. Deze groepen kunnen worden ingevoerd na de borstel-eerste synthese via post-polymerisatie modificatie 27. Zo hebben we azide-BASPs bereid uit alkylhalogenide MMS die omgezet om aziden na BASP formatie. Deze azides werden gebruikt voor Cu-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie "click &# 34; reacties.
Wij hebben geprobeerd om de impact van MM zuiverheid meer in detail bestuderen. Kleine hoeveelheden residueel MM en BI werden altijd waargenomen GPC sporen wanneer borstelvormige eerste reacties werden uitgevoerd met MM bereid uit commercieel verkrijgbaar PEG-NH2 (B1, figuur 2a). We hadden geleerd uit ervaring dat volledig zuiver MMs algemeen geven kwantitatieve MM conversie. Verder hadden we gemerkt dat de hoeveelheid resterend MM gevarieerd afhankelijk van het batchnummer van het commerciële PEG-NH 2. We vermoeden dat een niet-functionele PEG-NH2 onzuiverheid, misschien alleen PEG-diol, was verantwoordelijk voor de schijnbare resterende MM onzuiverheid. Daarom hebben we gebruik gemaakt prep-HPLC om B1 te zuiveren tot puur MM B2 geven Figuur 2b laat zien dat dit zuiveringsproces inderdaad de hoeveelheid resterend MM (oranje ster) ongeveer twee keer wist te verlagen;. Het niet remove het volledig. Interessant, B2 gaf hogere conversie van BI te BASPs ook, misschien een onzuiverheid die leidde tot katalysatordeactivering werd via prep-HPLC verwijderd. Nog steeds ontevreden over de hoeveelheid resterend MM, volgden we de literatuur methoden voor de synthese van PEG-NH 2 via anionische polymerisatie van ethyleenoxide uit ethanolamine (LET OP: ethyleenoxide moet worden behandeld door getrainde, ervaren chemici, het is een zeer licht ontvlambare, explosieve en giftig gas!). 22,23 MM bereid uit deze zelfgemaakte PEG-NH 2 (B3) leverde betere resultaten in vergelijking met de commerciële MMS. GPC analyse van de overeenkomstige BASPs toonde geen detecteerbare residu MM en zeer weinig (<1%) overblijvende BI (figuur 2c). Dus als hoge zuiverheid BASPs nodig adviseren wij het gebruik van de zuiverste MM. Merk op dat de overblijvende MM en BI gemakkelijk vanaf kan worden verwijderdde grotere BASPs door dialyse na borstel-eerste synthese.
We hebben ook andere dan de C crosslinkers. Zo hebben wij bereid BASPs van bisnorbornene metaalcomplexen, polymerisatie-initiatoren, met zuur afsplitsbare linkers en supramoleculaire systemen. We vinden dat crosslinkers met vaste afstandhouders tussen de norbornenen vaak zo uniform BASPs verschaffen; dergelijke verknopingsmiddelen zijn minder waarschijnlijk intramoleculaire cyclisatie reacties die norbornenen consumeren ondergaan, maar dragen niet bij aan BASP groei.
Ongeacht de MM en crosslinker combinatie, vinden we de volgende algemene praktijken zal leiden tot de hoogste kans van borstel-eerste succes. Eerst, voordat borstel-eerste synthese met nieuw gesynthetiseerde monomeren, raden wij u aan de DP = 10 borstel polymeer alleen en mogelijk langer borstel polymeren met DP = 25 en 50. Als deze tests succesvol zijn, is er een uitstekende kans dat de borstel-eerstewerkwijze ook succesvol zijn. Ten tweede, het ideale concentratie voor de borstelvormige eerste polymerisatie is afhankelijk monomeer chemische samenstelling en structuur van de componenten. Wij raden het testen van een paar concentraties op kleine schaal alvorens een grote partij BASP. Derde polymerisaties in dichloormethaan of tetrahydrofuran blijken de beste resultaten, monomeren die oplosbaar in deze oplosmiddelen zijn ideaal. Zoals hierboven besproken, indien de crosslinker is slecht oplosbaar in deze oplosmiddelen raadzaam voegen als een vaste stof in plaats van het toevoegen van extra oplosmiddel. Zolang de MM oplosbaar, vinden we dat de verknoping geeft de crosslinker volledig in oplossing binnen minuten. Ten vierde, hoewel de polymerisatie niet inerte omstandigheden vereisen, raden wij de opslag van de katalysator onder een inerte atmosfeer om de levensduur ervan te verhogen. Belangrijk is dat de katalysator ontleden tijd in oplossing, de katalysatoroplossing moet vers uit de derde generatie Grubbs ca voorbereidtalyst telkens een reeks ROMP reacties uitgevoerd. Ten slotte zal de hoeveelheid verharder eventueel voor de uniforme BASPs sterk variëren met verharder en MM structuur. Zoals getoond in fig. 2, 10 equiv crosslinker C niet voldoende om volledige BI conversies verschaffen. In andere gevallen vinden wij dat toevoeging van 1 equivalent verknopingsmiddel, en zelfs tot 40 equivalent, goede resultaten. Wanneer een nieuwe crosslinker wordt gebruikt, raden wij er een serie kleinschalige reacties met verschillende N waarden optimale crosslinker bedragen identificeren.
Ten slotte is het belangrijk te erkennen dat veel alternatieve methoden bestaan voor het maken van stervormige polymeren (kern-eerste arm eerst enz.) 25, 26. Elke methode heeft nadelen en voordelen, zoals limieten afmetingen, zuivering vereisten en functionele groep compatibiliteit. We stellen dat de brede functionele groep tolerantie van ravotten,het gemak van synthese van op norborneen gebaseerde functionele monomeren, en het vermogen om snel ROMP reacties uitgevoerd op de benchtop, parallel en bij kamertemperatuur, maken de borstelvormige eerste ROMP benadering overwegen waard voor verschillende toepassingen. In de toekomst zullen we doorgaan met deze methode te ontwikkelen en BASP nanoarchitectures voor diverse toepassingen, zoals drugs-en gen delivery, cellulaire beeldvorming, en zelf-assemblage. Het volledige potentieel van deze nieuwe deeltjes, en hun capaciteit voor combinatorische synthese, moet nog worden onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de MIT afdeling Scheikunde en het MIT Lincoln Labs Advanced Concepts Comite voor de ondersteuning van dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grubbs Second Generation Catalyst | Materia (or Sigma Aldrich) | C848 (Sigma Aldrich: 569747) | Used as purchased from manufacturer. *Provided as a generous gift. |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 270970 | Used as purchased from manufacturer |
| O-(2-aminoethyl)polyethylene glycol 3000 | Sigma Aldrich | 07969 | Used as purchased from manufacturer |
| PEG-MM | N/A | N/A | Synthesized following reported procedures (Ref. 21, protocol 1) |
| norbornene-N-hydroxysuccinimidyl (NHS) ester | N/A | N/A | Synthesized following reported procedures (Ref. 21) |
| Bis-norb-NBOC Crosslinker | N/A | N/A | Synthesized following reported procedures (Ref. 21) |
| Pentane | Sigma Aldrich | 158941 | Used as purchased from manufacturer |
| Tetrahydrofuran (HPLC grade) | Sigma Aldrich | 34865 | Dried and purified over a solvent purification columns |
| Dichloromethane | VWR | BDH1113-4LG | Used as purchased from manufacturer |
| Acetonitrile (HPLC grade) | Sigma Aldrich | 34998 | Used as purchased from manufacturer |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | A6283 | Used as purchased from manufacturer |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 239313 | Used as purchased from manufacturer |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 673811 | Used as purchased from manufacturer |
| Dimethylformamide (HPLC grade) | Sigma Aldrich | 270547 | Used as purchased from manufacturer |
| Lithium Bromide | Sigma Aldrich | 213225 | Used as purchased from manufacturer |
| MillQ Biocel A10 | Millipore | ||
| Beckmann Coulter HPLC (127p solvent module, 166p detector) | Beckmann Coulter | ||
| Zorbax 300SB-C18 PrepHT reverse phase column | Agilent | ||
| 1260 Infinity Liquid Chromatography | Agilent | ||
| GPC KD-806M column | Shodex | ||
| Dawn Heleos II Light Scatterer | Wyatt | ||
| Optilab T-rEX Refractive Index Detector | Wyatt | ||
| Glass Scintillation Vials - 40 ml | Chemglass | CG-4909-05 | |
| Glass Scintillation Vials - 4 ml | Chemglass | CG-4904-06 | |
| Glass Scintillation Vials (PTFE-lined cap) - 2 ml | Agilent | 5183-4518 | |
| Stir-bars | VWR | 5894x | various sizes |
| 13 mm 0.45 µm Nylon Syringe filter | PerkinElmer | 02542903 | |
| 13 mm 0.45 µm polytetrafluoroethylene syringe filter | PerkinElmer | 02542909 | |
| 1 ml disposable syringes | VWR | 53548-001 | |
| Swing bucket centrifuge or similar | Should be able to reach approximately 4,000 rpm | ||
| Round bottom flask | |||
| Fritted glass filter assembly | |||
| Rotary Evaporator | |||
| Balance |
References
- Bielawski, C. W., Grubbs, R. H.
- Hawker, C. J. The Convergence of Synthetic Organic and Polymer Chemistries. Science. 309, 1200-1205 (2005).
- Peer, D., Karp, J. M., Hong, S., Farokhzad, O. C., Margalit, R., Langer, R. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nat. Nano. 2, 751-760 (2007).
- Whitesides, G. M.
- Leitgeb, A., Wappel, J., Slugovc, C.
- Johnson, J. A., Lu, Y. Y., Burts, A. O., Lim, Y. -H., Finn, M. G., Koberstein, J. T., Turro, N. J., Tirrell, D. A., Grubbs, R. H. Core-Clickable PEG-Branch-Azide Bivalent-Bottle-Brush Polymers by ROMP: Grafting-Through and Clicking-To. J. Am. Chem. Soc. 133, 559-566 (2010).
- Bielawski, C. W., Grubbs, R. H. Highly Efficient Ring-Opening Metathesis Polymerization (ROMP) Using New Ruthenium Catalysts Containing N-Heterocyclic Carbene Ligands. Angew. Chem. Int. Ed. 39, 2903-2906 (2000).
- Love, J. A., Morgan, J. P., Trnka, T. M., Grubbs, R. H. A Practical and Highly Active Ruthenium-Based Catalyst that Effects the Cross Metathesis of Acrylonitrile. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 4035-4037 (2002).
- Lu, J. A., Johnson, Y. Y., Burts, A. O., Xia, Y., Durrell, A. C., Tirrell, D. A., Grubbs, R. H. Drug-Loaded, Bivalent-Bottle-Brush Polymers by Graft-through ROMP. Macromolecules. 43, 10326-10335 (2010).
- Burts, A. O., Li, Y. J., Zhukhovitskiy, A. V., Patel, P. R., Grubbs, R. H., Ottaviani, M. F., Turro, N. J., Johnson, J. A. Using EPR To Compare PEG-branch-nitroxide "Bivalent-Brush Polymers" and Traditional PEG Bottle-Brush Polymers: Branching Makes a Difference. Macromolecules. 45, 8310-8318 (2012).
- Bazan, G. C., Schrock, R. R. Synthesis of star block copolymers by controlled ring-opening metathesis polymerization. Macromolecules. 24, 817-823 (1991).
- Saunders, R. S., Cohen, R. E., Wong, S. J., Schrock, R. R. Synthesis of amphiphilic star block copolymers using ring-opening metathesis polymerization. Macromolecules. 25, 2055-2057 (1992).
- Buchmeiser, M. R., Wurst, K. Access to Well-Defined Heterogeneous Catalytic Systems via Ring-Opening Metathesis Polymerization (ROMP): Applications in Palladium(II)-Mediated Coupling Reactions. J. Am. Chem. Soc. 121, 11101-11107 (1999).
- Weichelt, F., Frerich, B., Lenz, S., Tiede, S., Buchmeiser, M. R. Ring-Opening Metathesis Polymerization-Based Synthesis of CaCO3 Nanoparticle-Reinforced Polymeric Monoliths for Tissue Engineering. Macromol. Rapid Comm. 31, 1540-1545 (2010).
- Weichelt, F., Lenz, S., Tiede, S., Reinhardt, I., Frerich, B., Buchmeiser, M. R. ROMP-Derived cyclooctene-based monolithic polymeric materials reinforced with inorganic nanoparticles for applications in tissue engineering. Beilstein J. Org. Chem. 6, 1199-1205 (2010).
- Mayr, M., Mayr, B., Buchmeiser, M. R. Monolithic Materials: New High-Performance Supports for Permanently Immobilized Metathesis Catalysts. Angew. Chem. Int. Ed. 40, 3839-3842 (2001).
- Mayr, B. H., ölzl, G., Eder, K., Buchmeiser, M. R., Huber, C. G. Hydrophobic, Pellicular, Monolithic Capillary Columns Based on Cross-Linked Polynorbornene for Biopolymer Separations. Anal. Chem. 74, 6080-6087 (2002).
- Otani, H., Fujita, S., Watanabe, Y., Fujiki, M., Nomura, K. A Facile, Controlled Synthesis of Soluble Star Polymers Containing a Sugar Residue by Ring-Opening Metathesis Polymerization (ROMP). Macromol. Symp. 293, 53-57 (2010).
- Nomura, K., Watanabe, Y., Fujita, S., Fujiki, M., Otani, H. Facile Controlled Synthesis of Soluble Star Shape Polymers by Ring-Opening Metathesis Polymerization (ROMP). Macromolecules. 42, 899-901 (2009).
- Gao, H., Ohno, S., Matyjaszewski, K. Low Polydispersity Star Polymers via Cross-Linking Macromonomers by ATRP. J. Am. Chem. Soc. 128, 15111-15113 (2006).
- Liu, J., Burts, A. O., Li, Y., Zhukhovitskiy, A. V., Ottaviani, M. F., Turro, N. J., Johnson, J. A. "Brush-First" Method for the Parallel Synthesis of Photocleavable, Nitroxide-Labeled Poly(ethylene glycol) Star Polymers. J. Am. Chem. Soc. 134, 16337-16344 (2012).
- Studer, P., Larras, V., Riess, G. Amino end-functionalized poly(ethylene oxide)-block-poly(methylidene malonate 2.1.2) block copolymers: synthesis, characterization, and chemical modification for targeting purposes. Eur. Polym. J. 44, 1714-1721 (2008).
- Mosquet, M., Chevalier, Y., Le Perchec, P., Guicquero, J. P. Synthesis of poly (ethylene oxide) with a terminal amino group by anionic polymerization of ethylene oxide initiated by aminoalcoholates. Macromol. Chem. Phys. 198, 2457-2474 (1997).
- Burchard, W.
- Gao, H. F. Development of Star Polymers as Unimolecular Containers for Nanomaterials. Macromol. Rapid Comm. , 722-734 (2012).
- Blencowe, A., Tan, J. F., Goh, T. K., Qiao, G. G. Core cross-linked star polymers via controlled radical polymerisation. Polymer. 50, 5-32 (2009).
- Burts, A. O., Liao, L., Lu, Y. Y., Tirrell, D. A., Johnson, J. A. Brush-first and Click: Efficient Synthesis of Nanoparticles that Degrade and Release Doxorubicin in Response to Light. Photochem. Photobiol. , (2013).
