Summary
Мы представляем протокол для расследования в пробирке эффлюкса насосов от синегнойной палочки. Этот протокол позволяет для генерации надежной, обратимой и перестраиваемой протонного градиента в пределах мембрану липосомы и, следовательно, должны быть адаптированы к любой мембранного белка под напряжением на protomotive силу.
Abstract
Существует новых научных потребность в надежных инструментов для мониторинга мембранного транспорта. Мы представляем методологию, ведущую к воссоздания эффлюкса насосов из грамотрицательных бактерий синегнойной палочки в биомиметического среды, что позволяет для точного исследования их деятельности транспорта. Три предпосылки выполнены: на отсеки в липидной среде, использования соответствующего показателя за транспорт, и генерации протонного градиента. Мембранный белок транспортер воссоздается в липосомы вместе с бактериородопсине, светло-активированной протонного насоса, который создает протонный градиент, что является надежной, а также обратимо и настраивать. Активность белка выводится из вариаций рН, происходящих в липосомы с использованием pyranin, рН-зависимого флуоресцентного зонда. Мы описываем шаг за шагом процедуры, где очистка мембранный белок, образование липосом, белок восстановление и транспорт нанализ адресованы. Хотя они были специально разработаны для транспортера RND, описанные способы потенциально могут быть адаптированы для использования с любой другой транспортер мембранных белков под напряжением с помощью протонного градиента.
Introduction
Интегральные мембранные белки составляют до 30% генов, закодированных в геномах эукариот. Они разделяют основные роли, такие как ворота учета (рецепторов), транспортировки питательных веществ, ионов или вредных соединений (перевозчиков) или поддержания проницаемости через мембраны бислоями (каналов) среди всех живых клетках 1. Efflux насосы играют центральную роль в сопротивлении против антибиотикотерапии 2. В грамотрицательных бактерий синегнойной палочки, которая защищена внешней мембраны, отток транспортеры организованы как трехсторонних системах, где MexB, истечение насос, расположенный во внутренней мембране, работает в сочетании с MEXA, периплазматического белка и OprM, наружной мембраны канала. Цитоплазматический внутренний мембранный белок действует как энергетически зависимый насос с широкой субстратной специфичности. Внешний мембранный белок действует как порина тогда как третий находится в периплазматическом пространстве и, как полагают, стабилизирует весь комплекс Структурная информация, накопленные за последние 5 лет благодаря решимости рентгеновской гомологичной белка AcrB от кишечной палочки 4-7. Хотя это явно важно пары такой информации с динамическими и кинетических данных, проектирование функциональный анализ для этого транспортера является реальной проблемой 8. Действительно, мембранные белки должны быть сохранены в мембранном среды и закрытый отсек должен быть сохранен для векторной транспортировки подложки должны быть достигнуты. Восстановление мембранных белков в протеолипосом была широко представлена и отзывы (см. Риго и Леви 9). Такие протоколы позволяют для мониторинга активности мембранных белков, например, путем следующих субстратов через мембрану липосомы. В этом случае ограничения возникают из аоступность титруемой субстратов (люминесцентные, радиоактивные, и т.д..) и из того, что очень часто эти субстраты являются гидрофобными и имеют тенденцию пересекать мембраны независимо от наличия транспортера. В качестве альтернативы, можно проследить спектроскопические изменения отчетного красителя чувствительного к химическим изменениям, которые происходят в результате транспортировки. Как указано выше, протоны энергией транспорт через MexB. Таким образом, важной опцией является мониторинг спектроскопические вариации рН-чувствительных отчетный красителя следовать вариации рН из-за протонов приводом подложки транспорта. Выбор флуоресцентным красителем позволяет избежать артефактом эффекты из-за гидрофобной природы подложки. Дополнительная трудность является генерация протонного градиента. Несколько протоколов можно найти в литературе. Среди них, использование техники валиномицина широко распространена, но мы показали, что это утомительно выполнять 10-11. Кроме того, этоне воспроизводимы и не обратимы. Мы прибегли к использованию бактериородопсине (BR), светло-активированной протонного насоса от Halobacter salinarium, галофильного морской грамотрицательной облигатной аэробной archaeon. Этот белок coreconstituted в липосомы с MexB и, при освещении, BR насосы протоны внутри липосом и, следовательно, создает ΔpH (кислый внутри) нужны белка для транспортировки подложки 12-13.
Protocol
1. Белок Получение и очистка
- MEXA, MexB от синегнойной палочки
- Transform плазмиды, несущие гены MEXA и MexB в Е. палочка производство Штамм (например C43 DE3). Пластина на LB агаре среде, дополненной соответствующим антибиотиком. Выберите одну колонию для инокуляции в O / N прекультуры. На следующее утро инокуляции предварительной культуры в 1 л LB и расти при 37 ° С при перемешивании (240 оборотов в минуту).
- Как только клетки достигали экспоненциальной фазы (OD 600 = 0,6-0,8) индуцируют с помощью 1 мМ IPTG. Выполнение индукции в течение 2-3 ч при 30 ° С при перемешивании.
- Центрифуга клетки (9000 х г в течение 20 мин) и ресуспендируют в 30 мл Трис-HCl 20 мМ, рН 8, 150 мМ NaCl.
- Разрушить клетки с использованием французской прессе (10000 фунтов на квадратный дюйм, 4 чел). Откажитесь неразрушенных клеток и телец включения путем центрифугирования при 9000 мкг в течение 20 мин.
- Пелле мембраны 1 час при 100000 х г и гesuspend каждый шарик в 30 мл Bis-Tris 10 мМ, рН 7,4, глицерин 20% (вес / объем), 10 мМ имидазола, NaCl 500 мМ.
- Определить общую концентрацию мембранного белка с использованием BCA колориметрического анализа и солюбилизации мембран O / N 2% додецилмальтозид (DDM) в конечном объеме, определяемом так что моющее средство: белок 1:1,5 (вес / вес).
- Ультрацентрифуга при 100000 мкг в течение 1 часа, чтобы отбросить без солюбилизированный и агрегированный материал.
- Инкубировать супернатант в течение 2 часов при 4 ° С с никелевым смолы (очистки MEXA) или кобальта (смолы очистки MexB), уравновешенную Bis-Tris 10 мМ, рН 7,4, 5% глицерин (вес / объем), 10 мМ имидазол, NaCl 500 мМ, DDM 0,2%.
- Налейте смолы в пустой колонки. Соберите течь через.
- Промыть смолу с 50 мл Bis-Tris 10 мМ, рН 7,4, глицерин 20% (вес / объем), 10 мМ имидазола, NaCl 500 мМ, DDM 0.2%, затем 25 мл Bis-Tris 10 мМ рН 6, глицерин 5% (вес / объем), имидазол 10 мМ, NaCl 500 мМ, DDM 0,2%.
- Элюции рrotein с 20 мл Bis-Tris 10 мМ, рН 7,4, глицерин 5% (масса / объем), имидазола 300 мМ, NaCl 500 мм, DDM 0,2%.
- Концентрат белка с ультрафильтрационной устройства до 3 мл и нагрузки на обессоливающей колонке, уравновешенной имидазола свободного буфера. Непосредственно перед восстановлением (см. ниже), Ультрацентрифуга солюбилизированного белка (100000 х г в течение 20 мин), чтобы избавиться от липидов и нерастворимого белка. Тогда сосредоточиться белок снова до 0,3 мл.
- Бактериородопсин от Halobacter salinarium
- Grow Halobacter salinarium клеток при освещении при 37 ° С в течение 10 дней в жидкой среде для роста, содержащей NaCl 4 м, MgSO 4 150 мм, цитрат 10 мм, 30 мм KCl, дрожжевой экстракт 5 г / л пептона и 5 г / л
- Прерывание клетки путем диализа против деионизированной воды.
- Очищают фиолетовый мембраны на 30-40% (вес / объем) в градиенте сахарозы (100000 мкг в течение 17 ч).
- Растворения суспензии мембран с 2% octylglucoside в течение 24 ч при 37 ° С (объем для солюбилизации для того, чтобы ресуспендируют мембрану в 2:01 (вес / вес) моющего средства: соотношение белка). Оцените концентрацию растворенного БР с использованием ε (570 нм) = 54000 М -1 см -1. Незадолго до восстановления (см. ниже), Ультрацентрифуга солюбилизированный BR (100000 мкг в течение 20 мин), чтобы избавиться от липидов и нерастворимого белка.
Примечание: нативные мембраны естественно, обогащенный BR таким образом дальнейшую очистку не требуется.
2. Подготовка Протеолипосомы
- Формирование липосом: Поместите 400 мкл DOPC растворяли в хлороформе (25 мг / мл) в стекл нный стакан и добавить 1,5 мг холестерина, хранящейся в виде порошка. Сушат их непосредственно перед манипуляций при потоке азота или в вакууме в течение не менее 1 часа в стеклянном стакане. ДОФХ: молярное соотношение холестерин 3,3:1.
- После того как они высохли, гидрат липиды с 1 мл 25 мМ HEPES рН 7,K 2 SO 4 100 мМ, MgCl 2 2 мМ, pyranine 2 мм. Подвеска должна появиться мутная на данном этапе.
- Раствор нагревают в течение 10 мин при 37 ° С Разрушать ультразвуком в течение 10 мин при 40 Вт с 30 сек импульса, 30 сек циклов пауза при комнатной температуре. Подвеска должна появиться ясно на данном этапе.
- Для получения монодисперсное население липосом, выполните два цикла экструзии и для каждого цикла, пройти суспензию липосом через фильтр, по крайней мере 11x. Для первого цикла, использовать мембраны размером пор 200 нм, а для второго цикла, использовать мембраны размером пор 100 нм. Измерения динамического рассеяния света может быть выполнена на этом этапе, чтобы проверить однородность суспензии.
- Белок включение
Принцип: мембранные белки могут быть восстановлены в липосомы, благодаря солюбилизирующего эффект моющих средств. Моющее средство солюбилизированную липосомы инкубируют с детергентом солюбилизированного белка мембраны и формирование рroteoliposomes инициируется быстрой ликвидации моющего средства с полистирольных шариков 9.- Добавить 28 мг Triton X-100 (0,56% конечная) и инкубировать O / N при 4 ° С (температура солюбилизации могут быть адаптированы к белок изучается).
- Добавьте моющее средство-солюбилизированного белка (BR, MexB и MEXA) в солюбилизированных липосом и инкубировать 15 мин при 4 ° С. Добавить белки в солюбилизированного суспензии липосом в следующих соотношениях (W / W): липиды / MexB = 20, MexB / MEXA = 2,5 и липидов / BR = 30.
- Добавить полистирольные шарики на 30:1 бисера: соотношение моющего средства (W / W, учитывая общий вес моющего средства, в том числе моющего средства с добавлением очищенных белков) и инкубировать 5 ч, в темноте (из-за БР) при комнатной температуре в нежный помешивая. До этой процедуры активации biobeads метанолом и этанолом инкубации и широко промывают водой.
- Очищают белок Протеолипосомы и бесплатные подложек с использованием PD-10колонка обессоливания уравновешенную HEPES 25 мМ рН 7, K 2 SO 4 100 мм и MgCl 2 2 мм.
- Храните Протеолипосомы при 18 ° С в темноте в течение до 2-3 недель.
- Оценка эффективности восстанавливающей на градиенте сахарозы.
Чтобы проверить, что и MexB и БР были воссоздана в липосомы, очистить proteoliposome подвеску на разрывной градиент сахарозы.- Осторожно урегулировать Протеолипосомы на пять слоя градиента сахарозы (60%, 20%, 10%, 5% и 2,5%, вес / объем).
- Ультрацентрифуга течение 17 ч при 100 000 мкг (с минимальным ускорением и скорости замедления).
- Осторожно собрать различные градиентные фракции (особенно интерфейсы между каждым слоем сахарозы) и анализировать их на SDS-PAGE (10%), использу Кумасси окрашивания или Вестерн-блоттинга. Агрегированные белки находятся в нижней части трубки, в то время как nonincorporated, моющие-солюбилизированного белка находятся в верхней частитрубка. Протеолипосомы и липосомы находятся на сахарозы интерфейсов, которые соответствуют их внутренней плотности. Пустые липосомы восстанавливаются дальше вверх по градиенту, чем протеолипосом.
3. Флуоресценции Измерение
- Провести измерения флуоресценции при 25,0 ° С с использованием спектрофлуориметре, позволяющий для измерения двойного длина волны (Xe лампы, 150 Вт). Альтернативные периоды освещения (для активации BR с длинами волн возбуждения / эмиссии 550 нм / 550 нм) и измерения флуоресценции с длиной волны возбуждения / эмиссии 455 нм / 509 нм в течение 2 сек для измерения флуоресценции pyranine. Установите возбуждения и эмиссии полосы пропускания до 5 нм. Выполните измерения в присутствии 50 нМ валиномицина чтобы предотвратить образование обратного мембранного потенциала ΔΨ.
Примечание: В самом деле, потому что BR насосы протоны, есть более положительные заряды внутри липосомы, чем снаружи. Этот зарядградиент может быть отброшен с помощью валиномицин, который представляет собой K + селективный ионофор. После добавления к липосомы подвески валиномицина, как гидрофобной молекулой, будет вставить в липосомной мембране, пассивно транспортировки K + и, следовательно, рассеивать мембранного потенциала ΔΨ.
Representative Results
Анализ состоит из мониторинга флуоресценции pyranine как функции времени в то время как протонный градиент генерируется. Для этой цели, образцы подвергаются альтернативы освещения (отсюда протон накачка БР срабатывает), а затем флуоресценции измерение с помощью возбуждения и эмиссии длин волн pyranine (λ экс = 455 нм и λ ет = 509 нм).
На рисунке 1 показан репрезентативный контроль полученного теста, при отсутствии MEXA / MexB, проверки того, что протонный градиент, порожденный BR является обратимым. После одного цикла подкисления, протеолипосомы хранятся в темноте в течение 45 мин для того, чтобы БР остановить насосные протонов (протоны диффундируют медленно и пассивно через липидного бислоя после их градиента концентрации). По истечении этого времени восстановления, активация BR можно, просто снова освещая же суспензии.
Рисунок 2соответствует фактическим измерением переноса. Отрицательный контроль с белковыми свободных липосом показывает, что, как и ожидалось, рН является постоянной при освещении (фиг.2А и 2В, оранжевый кружки). Тем не менее, протеолипосомы БК, содержащем в их мембран у насоса протон, при этом рН внутри липосом уменьшается и стабильный градиент построен (фиг.2А и 2В, фиолетовые квадраты). Серые треугольники и красные бриллианты (рис. 2а) представляют рН внутри протеолипосом содержащих BR и MexB, в присутствии или в отсутствие Hoechst 33342, соответственно. Мы наблюдаем субстрата независимый деятельности, где протонного градиента лишь частично рассеиваемой MexB встречного транспорта. Мы связываем это наблюдение к базальной активности MexB.
Для того чтобы проверить эффект MEXA о деятельности MexB, MEXA был добавлен в восстановлении, сначала в отсутствие какого-либо субстрата (
. Рисунок 1 Обратимость протонного градиента, построенной BR освещения: Pyranine этuorescence БР протеолипосом измеренных в зависимости от времени. С 0-15 мин, BR насосы протонов в результате световой активации. С 15-60 мин, протеолипосомы инкубируют в темноте, в течение этого времени, протоны пассивно выйти из липосом, пока внутрипузырное рН и extravesicular рН не равны. С 60-75 мин, комн по-прежнему функционирует и насосы протоны при освещении.
. Рисунок 2 Транспорт анализ: pyranine флуоресценции, превращены в соответствующие вариации рН, как функцию времени) рН внутри контрольных липосом (оранжевый кружки), рН внутри протеолипосом БК, содержащем в мембране (фиолетовый квадраты), рН внутри. из протеолипосом содержащих BR, и MexB в мембране без Hoechst 33342 (красный гiamonds), рН внутри протеолипосом содержащих BR и MexB в мембране с Hoechst 33342 (серые треугольники) B) рН внутри контрольных липосом (оранжевые кружки);. рН внутри протеолипосом содержащих BR в мембране (фиолетовые квадраты), рН внутри из протеолипосом содержащих BR, MexB и MEXA в мембране без Hoechst 33342 (голубые бриллианты), рН внутри протеолипосом содержащих BR, MexB и MEXA в мембране с Hoechst 33342 (зеленые треугольники).
Discussion
Мы описываем процедуру реконституции предназначенный для опробования мембранного транспорта. После того, как установлено, процедура восстановление белка приводит к измерениям, которые очень воспроизводимым. Однако точные условия для воссоздания белок будет варьироваться от одного белка к другому. Большая забота должна быть взята в оптимизации следующих параметров: я) качество очистки (чистота и отсутствие агрегированный материал); II) эффективность шагом моющее средство солюбилизирующим (когда это возможно, низкий CMC моющих средств следует отдавать предпочтение, потому что они легче получить избавиться от); III) десорбция моющего средства (это например можно сочетать использование гранул полистирола с шагом диализа, но это может влиять на скорость десорбции, является критическим параметром для последующего активности белка, см. [ 9]); IV) восстановление липидного (химическая природа липида, липида в соотношении белка, наличием дополнительного amphiphИль являются критическими параметрами, которые должны быть изменены и оптимизированы). В дополнение температуры и времени инкубации влияет на все эти вопросы.
Контроль качества, таким образом, изначальная на каждом этапе процедуры восстановления. С этой точки зрения, рассеяние света является очень удобным способом, потому что это быстрый, неразрушающий, и она требует только 20 мкл образца с концентрацией в диапазоне микромолярном. После того, протеолипосомы образуются, сахароза градиент также весьма полезным, поскольку он открывает путь к систематической проверки восстановления: качественные (в белок действительно встроен в липосомной мембране), а также количественное (сколько белка в одной липосомы). Последний будет касаться точного измерения белка и концентрации липидов.
Наш анализ не зависит от титрования самой подложки и это позволяет избежать непростые соображения о возможном артефактом пассивной диффузии молекула из-за гидрофобного разделения в мембранах. Анализ использует свойства pyranine как надежного и количественного зонда для мониторинга изменений рН. Наши результаты согласуются с результатами, полученными с другой процедурой, где возможно образование протонного градиента была выполнена с использованием валиномицин 10, но он позволяет более надежные и воспроизводимые градиент 11. Кроме того, протонный градиент может быть точно настроен, просто путем изменения концентрации буфера (подробнее см. Verchere соавт. 12).
В процедуре измерения управления первой выполненной в отсутствии субстрата (это дает доступ к пассивной активности белка). Фактическое мембранный белок транспортер активность затем измеряется после того, как подложка была добавлена в той же кювете. Это действительно актив, потому что эксперимент можно считать подлинной, не двусмысленным, субстрат-индуцированного исходом.
ЛОР "> Протокол может быть адаптирована к высокой средней пропускной способности (например 96-колодцы измерений) автоматизации, потому что освещения образца вызывает реакцию. Автоматизация и распараллеливание будет состоять в подготовке большую партию proteoliposome, и в распределении аликвоты в 96 Затем можно добавить колодцы пластины. Субстраты (а также возможные ингибиторы) будет и после инкубации в темноте в течение 45 мин пластинка будет подвергнут циклов измерения флуоресценции освещение / pyranine на микропланшетного.Для получения дополнительной информации о протоколе, читателям предлагается читать Verchere соавт. 12,13
Disclosures
Там нет ничего, чтобы раскрыть.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Национальным агентством де-ла-Recherche (проект ANR-2010-BLAN-1535) и за счет гранта от региона Иль-де-Франс (DIM-Malinf 110058).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C8667 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93427 | |
| Valinomycin | Invitrogen | V-1644 | |
| Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid) | Invitrogen | H-348 | |
| DDM (n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside) | Affymetrix | D310LA | |
| Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes) | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Biobeads SM-2 Adsorbents | Bio-Rad | 152-3920 | |
| Econo-Pac Chromatography empty column | Biorad | 732-1010 | |
| Desalting columns | Bio-Rad | 54805 | |
| Dynamic light scattering instrument | Wyatt Technology | DynaPro NanoStar | |
| Fluorometer JASCO FP-6200 | JASCO | 6816-J002A |
References
- Granseth, E., et al. Membrane protein structural biology - How far can the bugs take us? (Review). Molecular Membrane Biology. 24 (5-6), 329 (2007).
- Nikaido, H.
- Pos, K. M. Drug transport mechanism of the AcrB efflux pump. Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 782 (2009).
- Murakami, S., et al. Crystal structures of a multidrug transporter reveal a functionally rotating mechanism. Nature. 443 (7108), 173 (2006).
- Seeger, M. A. Structural Asymmetry of AcrB Trimer Suggests a Peristaltic Pump Mechanism. Science. 313 (5791), 1295 (2006).
- Sennhauser, G., Bukowska, M. A., Briand, C., Grutter, M. G. Crystal structure of the multidrug exporter MexB from Pseudomonas aeruginosa. J Mol Biol. 389 (1), 134 (2009).
- Su, C. C., et al. Crystal structure of the CusBA heavy-metal efflux complex of Escherichia coli. Nature. 470 (7335), (2011).
- Nikaido, H., Takatsuka, Y. Mechanisms of RND multidrug efflux pumps. Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 769 (2009).
- Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods in enzymology. 372, 65 (2003).
- Aires, J. R., Nikaido, H. Aminoglycosides are captured from both periplasm and cytoplasm by the AcrD multidrug efflux transporter of Escherichia coli. J Bacteriol. 187 (6), 1923 (2005).
- Picard, M., Verchere, A., Broutin, I. Monitoring the active transport of efflux pumps after their reconstitution into proteoliposomes: caveats and keys. Anal Biochem. 420 (2), 194 (2012).
- Verchere, A., Dezi, M., Broutin, I., Picard, M. Basic Methods in Protein Purification and Analysis, edited by iConcept Press. , (2012).
- Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps. Sci Rep. 2, 306 (2012).
