Beoordeling van Calcium Sparks in Intact Skeletal spiervezels

Summary

Hier beschreven is een methode om direct te meten calcium vonken, de elementaire eenheden van ^{Ca2 +} vrij van sarcoplasmatisch reticulum in intacte spiervezels. Deze methode maakt gebruik van osmotische stress-gemedieerde activering van Ca ^{2 +} vrijlating uit ryanodinereceptor in geïsoleerde spiervezels. De dynamiek en homeostatische aantal intracellulaire ^{Ca2 +-signalen} kunnen worden gebruikt om spierfunctie in gezondheid en ziekte te beoordelen.

Abstract

Handhaving van homeostatische Ca ^{2 +-signalen} is een fundamenteel fysiologisch proces in levende cellen. Ca ^{2 +} vonken zijn de elementaire eenheden van Ca ^{2 + signaaltransductie} in de dwarsgestreepte spiervezels die worden weergegeven als zeer plaatselijk Ca ^{2 +} gebeurtenissen release gemedieerd door ryanodinereceptor (RyR) Ca ^{2 +} los kanalen op het sarcoplasmatisch reticulum (SR) membraan. Goede beoordeling van de spieren Ca ^{2 +} vonken kunnen informatie over de intracellulaire Ca ^{2 +} handling-eigenschappen van gezonde en zieke dwarsgestreepte spieren te bieden. Hoewel ^{Ca2 +} vonken gebeurtenissen worden vaak gezien in rust cardiomyocyten, worden ze zelden waargenomen in rust spiervezels, dus is er een behoefte aan werkwijzen om vonken in spiervezels genereren en analyseren.

Hier beschreven is een experimentele protocol voor het meten van Ca ^{2 +} vonken in geïsoleerde flexor digitorm brevis (FDB) spiervezels behulp fluorescent Ca ^{2 +-indicatoren} en confocale laser scanning microscopie. In deze benadering worden geïsoleerd FDB vezels blootgesteld aan voorbijgaande hypoosmotic spanning gevolgd door een terugkeer naar isotone fysiologische oplossing. Onder deze omstandigheden, een sterke Ca ^{2 +} vonken reactie naast de sarcolemmale membraan bij jonge gezonde FDB spiervezels gedetecteerd. Gewijzigde ^{Ca2 +} vonken respons wordt gedetecteerd in dystrofische of oude spiervezels. Deze benadering heeft onlangs aangetoond dat membraan gescheiden signalering waarbij overspraak tussen inositol (1,4,5)-trifosfaat receptor _(IP3 R) en RyR draagt ​​Ca ^{2 +} vonk activatie van de spier. Samenvattend onze studies met osmotische stress geïnduceerde ^{Ca2 +} vonken gebleken dat intracellulaire respons weerspiegelt een spier signalerende mechanisme fysiologie en veroudering / ziektetoestanden, waaronder muismodellen van spierdystrofie (mdx muizen) of amyotrofe laterale sclerose (ALS model).

Introduction

Intracellulaire Ca ^{2 +} ([Ca ^{2 +]} _i) is een veelzijdige en belangrijke secundaire boodschapper die meerdere cellulaire functies in prikkelbare cellen zoals neuronen, hart-, skelet-en gladde spieren regelt (zie voor een overzicht Stutzmann en Mattson ^1). Gereglementeerde Ca ^{2 +} mobilisatie en overspraak tussen sarcoplasmatisch reticulum (SR) en T-tubulus (TT) membranen zijn fundamentele regulatoren van spierfysiologie. Bovendien waren veranderingen in ^{Ca2 +} signalering blijkt een onderliggend mechanisme contractiele dysfunctie in verschillende spierziekten zijn.

Ca ^{2 +} vonken zijn gelokaliseerd elementaire gebeurtenissen Ca ^{2 +} afgifte afkomstig van opening van de ryanodinereceptor (RyR) kanaal op het sarcoplasmatisch reticulum (SR) membraan ^2. In hartspier, vonken spontaan door de opening van het kanaal RyR2 door ^{Ca2 +} geïnduceerde ^{Ca2 +} release (CKP) mechanisme ^3-5. In de skeletspieren, wordt RYR1 strikt gecontroleerd door de spanning sensor op het TT membraan ^6,7. Zo Ca ^{2 +} vonken worden onderdrukt en zelden aangetroffen in rusttoestand in intacte skelet spiervezels. Tot voor kort, de sarcolemmale membraan moest worden verstoord door verschillende chemische of mechanische "villen" methoden om de onderdrukking van de spanning sensor op RYR1 ontkoppelen en toegestaan ​​voor Ca ^{2 +} vonk gebeurtenissen te detecteren in de skeletspieren ^8,9. Een eerder beschreven werkwijze vereist permeabilisatie van het membraan van spiervezels van saponine wasmiddel ^10.

In 2003, ontdekten we dat ofwel voorbijgaande hypoosmotic stress of spanning hyperosmotische perifere Ca kon induceren ^{2 +} vonken naast de sarcolemmale membraan in intacte spiervezels ^11. Deze methode is inmiddels aangepast om het moleculaire mechanisme en modulatie van Ca ^{2 +} studie 12-16. Hier schetsen we de details van onze experimentele aanpak voor inductie, detectie en analyse van Ca ^{2 +} vonken in intacte skeletspieren. Wij onze klantspecifieke vonk analyse programma dat kan worden gebruikt om de elementaire eigenschappen van individuele ^{Ca2 +} vonken in skeletspieren, bijv. vonk frequentie en amplitude (Δ F/F0, waarin de open waarschijnlijkheid van de RyR kanalen weerspiegelt kwantificeren en presenteren Ca ^{2 +} lading in de SR), tijd tot piek (stijgtijd) en duur (FDHM volledige duur van half-maximale amplitude) van vonken, en de ruimtelijke verdeling van ^{Ca2 +} vonken. Bovendien geven we het bewijs dat de verbindingen gewijzigde ^{Ca2 +} vonken de verschillende pathofysiologische toestanden in skeletspier, zoals spierdystrofie en amyotrofe laterale sclerose.

Het voordeel van deze techniek bestaat de mogelijkheid om ^{Ca2 +} meten relatief onbeschadigdverouderde cellen, in plaats van het strippen van de spiervezels, geschikt voor opname van ^{Ca2 +} vonken dichter bij fysiologische omstandigheden. Bovendien, onze speciaal ontworpen programma biedt meer nauwkeurige berekeningen van de eigenschappen van de vonk ten opzichte spiervezels.

Protocol

1. Het opzetten Osmotische stress perfusiesysteem

Figuur 1 is een schematische protocol calcium vonken beoordeling in intacte spiervezels.

1. Het opzetten van een drie-assige (xyz) micromanipulator staat plaats van de uitmonding topje van de perfusie-systeem met minimaal twee kanalen. Dit zou kunnen worden met disposable Luer-spuit met aangehechte drieweg - Luer - Lok plugkraan aan en / of uitschakelen van de stroom van perfusie-oplossingen schakelen. Deze perfusie kanalen zouden kunnen leveren> 1 ml / min oplossing via een perfusie tip met> 0,2 mm diameter.
2. Plaats twee kanalen van de perfusie systeem, een met Isotone Tyrode oplossing en de andere met Tyrode hypotone oplossing.

2. Voorbereiden van Intact Single Flexor digitorum Brevis (FDB) spiervezels van Mouse

1. Verwijder de voet van een muis euthanized volgende NIH en IACUC richtlijnen met behulp van een paar zware ontleden schaar door snijden door de been boven het enkelgewricht.
2. Speld de voet op een dissectie kamer gevuld met Minimal Ca ^{2 +} Tyrode Solution met de voetzool naar boven.
3. Ontleden FDB door snijden van de pees en voorzichtig omhoog trekken aan de pees aan de spier scheiden van het omringende weefsel.
4. Finish dissectie door het snijden van de distale pees waar het vertakt in een cijfer in de diepe lagen van de spier.
5. Breng de FDB spieren door het oppakken met een tang via de pezen bijkomende schade aan de spiervezels te voorkomen en te plaatsen in een buis met een ontdooide monster van digereren door collagenase oplossing voorverwarmd tot 37 ° C.
6. Incubeer de buis met FDB rechtop op een orbitale schudder bij 37 ° C gedurende 60-90 min met een snelheid van 160 rpm. Deze spier bundels dissociatie protocol om experimenteel voor verschillende stammen van dieren worden onderzocht, Vooral voor die ziekte / mutant vezels kwetsbaar membraan schade.
7. Breng de verteerd FDB in buis met 700 ui Isotone Tyrode oplossing en voorzichtig vermaal de vezels vrij te maken door het tekenen van de spier meerdere malen door een reeks van 200 ml-micropipet uiteinden geleidelijk afnemende diameter via snijden met een schoon scheermesje om de tips te verwijderen 200 ml micropipet. Om schade aan de vezels in het bijzonder zwakke spieren aan de ziekte te voorkomen, zorg ervoor dat de tip is net groot genoeg om de vezel bundel te passeren zonder te blijven hangen. Laat de bundel niet dwingen door een te kleine opening.
8. Plaat uit de FDB vezels door zachtjes te tikken en resuspenderen FDB vezels in de buis en dan tekening uit 70 ml (1/10 van de totale vezels) met een cut 200 ml micropipet in het midden van een 35 mm Delta TPG schotel met 1 ml isotone Tyrode Oplossing voor diffusie te verminderen over de schotel.
9. Bepaal het aantal intacte enkele vezels in het dish met behulp van een dissectie microscoop. Voeg extra aliquots FDB vezels 3-4 intact vezels op de schotel te verkrijgen.
10. Slaan extra geïsoleerde spiervezels bij 4 ° C en binnen 6 uur.

3. Fluo-4 AM Dye laden en Ca ^{2 +} Imaging (Sparks Measurement)

1. Overdracht 500 ml isotone Tyrode Oplossing van schotel met vergulde FDB vezels in een buis met 10 ml Fluo-04:00 voorraad (1 mM), meng en voeg terug aan het gerecht om een ​​definitieve Fluo-04:00 concentratie van 10 mM. Alternatief kan pluronzuur worden gebruikt pigment laden efficiëntie.
2. Plaats gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
3. Was de vezels door het zorgvuldig tekening uit 500 ml Fluo-4-AM met Isotone Tyrode Oplossing van de schotel met een ongesneden 200 ml-plastic micropipet tip en te vervangen met een gelijk volume van verse Isotone Tyrode Solution.
4. Herhaal dit proces nog 3 keer.
5. Om de mitochondriale functie te visualiseren, overdragen 500 ml Isotonic Tyrode Oplossing van schotel met FDB vezels in een buis met 5 ml TMRE voorraad (1 mM), meng en voeg terug naar de schotel voor een uiteindelijke concentratie van 50 nM.
6. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
7. Was de vezels door het zorgvuldig tekening uit 500 ml TMRE bevattende Isotone Tyrode Oplossing van de schotel met een ongesneden 200 ml plastic micropipet tip en te vervangen met een gelijk volume van verse Isotone Tyrode Solution.
8. Herhaal dit proces nog 3 keer.
9. Breng de schotel naar de confocale microscoop en selecteer een intacte vezel met duidelijke strepen en een vlotte sarcolemmale membraan voor experimenten.
10. Plaats het topje van de perfusie-systeem 400-500 um verwijderd van de doelstelling spiervezels en uit het midden met behulp van micromanipulator controles.
11. Begin stroom van de Isotone Tyrode oplossing om ervoor te zorgen de FDB vezels zijn plaats blijft.
12. Noteer de fluorescentie-signaal van Fluo-04:00 met een 40X olie-immersie objectief en prikkelen Fluo-04:00 met eenargon laser (golflengte 488 nm) en opnemen emissie signalen (golflengte 510-580 nm). De intensiteit van het fluorescentiesignaal is evenredig met het relatieve niveau van intracellulair ^{Ca2 +} concentratie ^{([Ca2 +]} _i).
13. Laten ^{Ca2 +} transiënten door verandering van de osmotische druk van de extracellulaire oplossing om osmotische stress produceren op glasvezel. Aanvankelijk perfuseren de vezels met Isotone Tyrode-oplossing (290 mOsM) (basislijn collectie voor 60 seconden) en daarna met hypotone oplossing Tyrode (170 mOsM) voor 100 sec zwelling veroorzaken. Perfuse de FDB vezels terug met isotone Tyrode oplossing. In het algemeen wordt slechts een osmotische schok aangebracht op een intacte vezel in een delta TPG schotel en de vonk gebeurtenissen laatste 10 min voor data-acquisitie.
14. Record ruimtelijke lokalisatie van Ca ^{2 +} vonken (figuur 2) met behulp van een tijd-reeks xy-twee-dimensionale beelden met een scansnelheid van 166 LPS (lijn per seconde, en each lijn bestaat uit 512 pixels resulteert in 3,08 sec / frame) voor elke toestand van isotone (1 min), hypotoon stress (100 sec) en post-hypotone stress (5 min). WINKEL signalen voor offline analyse de distributie en frequentie van ^{Ca2 +} vonken na voltooiing van het experiment evalueren.
15. Zoek een nieuwe vezel op een nieuw gerecht en volg dezelfde osmotische shock protocol om Ca ^{2 +} transiënten veroorzaken. Gebruik een confocale lijn scan (xt) mode (512 pixels in de lengte, sample rate van 2 msec / lijn scan om Ca ^{2 +} transiënten gedurende een minuut (dwz 30.000 lijnen) met de confocale scan lijn geplaatst direct onder sarcolemmale membraan (Figuur 3 ). Verander de lijn scan om verschillende brandpunten vliegtuigen tot drie opeenvolgende reeks (1-min interval) van linescans voor de analyse van de omvang en de kinetiek van individuele Ca ^{2 +} vonken opnemen.

4. Data Analysis

1. Verzamel een groot aantalxt lijn scan sporen om de morfologie en de kinetiek van individuele Ca ^{2 +} vonken parameters evalueren, dwz de amplitude (F / F _0, waarbij F ₀ is de rust Ca ^{2 +} fluorescentie), stijgen, tijd tot de piek, duur (FDHM volledige duur op halve grootte), en ruimtelijke breedte (FWHM, breedte op halve grootte) van de opgenomen vonken. Deze parameters vormen de basis gating eigenschappen van RYR Ca ^{2 +} kanalen zoals de Ca ^{2 +-flux} (amplitude) en de kinetische eigenschappen van RYRs (duur).
2. Analyseer digitale beeldgegevens met een op maat ontwikkeld, semi-automatische algoritme dat is gemaakt met beeldverwerking taal IDL (Interactive Data Language), zoals eerder beschreven ^11,16. Omdat de unieke kinetiek van ^{Ca2 +} vrij bij ^{Ca2 +} vonken geïnduceerd in FDB vezels door osmotische stress, is het beter om de handmatige en automatische functies van Ca ^{2 +} combineert vonk evenementenidentificatie en de verwerking met deze aangepaste afbeelding-build analyseprogramma's ^11. Dit algoritme is erg handig wanneer het nodig is om de ROI (region of interest) in sommige spierziekte modellen handmatig te identificeren. Zodra een ROI wordt gedefinieerd, kan het algoritme automatisch afleiden bovengenoemde vonk parameters die vervolgens kunnen worden geëxporteerd naar Excel-bestand. Ook het publiek beschikbare beeldverwerking software, bijvoorbeeld SparkMaster in ImageJ kunnen worden gebruikt om de kinetische eigenschappen van ^{Ca2 +} vonken en hun ruimtelijke verdeling skeletspier ¹⁷ definiëren.

Representative Results

Eerdere studies toonden aan dat voorbijgaande hypoosmotic stress-geïnduceerde perifere ^{Ca2 +} vonken naast de sarcolemmale membraan intact spiervezels ^11. Figuur 1 toont de beelden van intacte spier vezels met glanzend sarcolemmale membraan en karakteristieke heldere strepen. Figuur 2 toont typische Ca ^{2 +} vonken (zoals xy beelden) werden veroorzaakt door voorbijgaande (100 sec) behandeling met een hypoosmotic oplossing die de FDB spiervezels van jonge, gezonde muizen zwelt. Aangezien de spiervezels krimpt terug naar het oorspronkelijke volume, een krachtig ^{Ca2 +} vonk reactie direct onder de sarcolemma van de spiervezels. Deze xy beelden worden gebruikt om de vonk frequenties berekenen en plotten het verval profiel voor deze reactie. Figuur 3 toont typische line-scans (xt) gegenereerd met deze wijze van vonk analyse. De confocale scan lijn ligt direct onder desarcolemmale membraan (Figuur 3A). De tijdreeksen van vonk gebeurtenissen worden vastgelegd en het opgegeven ROI (region of interest) kunnen worden geïdentificeerd met onze speciaal ontwikkelde, semi-automatische "Spark Fit" programma (Figuur 3B). Figuur 3C toont een typische Spark Fit analyse van de amplitude en kinetiek van gegeven Ca ^{2 +} vonk. De Ca ^{2 +} vonk intensiteit wordt berekend als de amplitude verandering van Fluo-04:00 signalen (Δ F / F _0, waarbij F de piek Fluo-4 intensiteit en F ₀ is de rust Fluo-4 intensiteit voordat vonk die voortvloeien). De duur van de vonk wordt weergegeven door FDHM (volledige duur van halve grootte) en de stijgtijd en de tijd tot piek kan ook berekend. Een typische 3D (driedimensionaal) representatie kan worden gemaakt van bepaalde ROI's te tonen Ca ^{2 +} intensiteit verandering (Figuur 3D). Figuur 4 toont beelden van Ca ^{2 +} vonklinescans van skeletspieren vezels onder verschillende fysiologische en pathofysiologische toestanden. Line scan (xt) reeks Ca ^{2 +} vonken afkomstig zijn van gezonde, jonge (3 maanden) wild type spier (figuur 4A), en oude (22 maanden) spier (Figuur 4B). Let op de verminderde signaal dat optreedt in spiervezels oud. De jonge mdx spiervezels weer robuust Ca ^{2 +} vonken (Figuur 4C). Figuur 5 toont Ca ^{2 +} vonken (xy beelden) van extensor digitorum longus (EDL) spiervezels van wild-type (figuur 5A) en amyotrofe laterale sclerose (ALS) ziekte, een ziekte van het motorneuron met karakteristieke spieratrofie en beschadigde mitochondriën (Figuur 5B). De Ca ^{2 +} intensiteiten zijn show van Fluo-4 signalen (groen, links panelen) en de mitochondriën luchtwegen toestanden worden getoond door TMRE signalen (rood, rechts panelen). Merk op dat tbeschadigde hij mitochondriën (verliezen TMRE signaal) herbergt robuuste Ca ^{2 +} vonken.

Figuur 1. Schematisch protocol van calcium vonken evaluatie in intacte skelet spiervezels. Schematisch protocol van calcium vonken evaluatie in intacte skelet spiervezels. Deze stapsgewijze procedure toont aan intact FDB spiervezels voor analyse en de set-up van de perfusie-systeem op osmotische stress veroorzaken op de vezels te verkrijgen. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 2. Vertegenwoordiger Ca ^{2 +} vonken (XY ​​beelden) episodes van skeletachtige FDB spiervezels. De middelste spoor toont de tijdlijn en de bijbehorende xy beelden (boven panelen) om de sequentiële osmotische druk verandering in de protocollen. Top linkerpaneel - vezel behandeld met isotone Tyrode oplossing; top middelste paneel - vezel behandeld met Hypotone Tyrode oplossing, en rechtsboven paneel - vezel terug naar behandeling met isotone Tyrode oplossing. Een vertegenwoordiger histogram van de vonk afleveringen waargenomen met xy beeldvorming wordt weergegeven op de bodem. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 3. Vertegenwoordiger Ca ^{2 +} spa rks (lijn scant xt beelden) en Spark Fit analyse (A) confocale lijn scan (rode stippellijn) ligt pal onder de sarcolemmale membraan van spiervezels;. (B) Osmotische stress opgewekt discrete Ca ^{2 +} vonken worden gepresenteerd als lijn-scan (xt) modus. (C) Spark analyse Spark Fit algoritme om de ^{Ca2 +-intensiteit} (Δ V / V ₀₎ die evenredig is met de SR Ca ^{2 +} vrij flux tonen en kinetiek (duur, weergegeven als FDHM). (D) Drie-dimensionale plot beeld Fluo-4 lijn scan die de osmotische stress opgewekte vonken in ruimte-tijd-modus en hun intensiteit van. Klik hier voor grotere afbeelding .

/ Ftp_upload/50898/50898fig4.jpg "width =" 600px "/>
Figuur 4. Vertegenwoordiger Ca ^{2 +} vonken in de spieren fysiologische en pathofysiologische staten in respons op osmotische stress (A) Lijn scans (xt beelden) van Ca ^{2 +} vonken afkomstig van jonge (3 maanden) gezonde FDB spiervezels;. (B) vonken van de leeftijd ( 22 maanden) FDB spiervezels en (C) vonken van jong (3 maanden) dystrophic mdx muis FDB spier. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 5. Vertegenwoordiger Ca ^{2 +} vonken (XY ​​beelden) van FDB spieren in respons op osmotische stress. (A 2 + vonken (XY ​​beelden) van wild-type FDB spieren en (B) Ca ^{2 +} vonken van ALS spieren. FDB spiervezels gelijktijdig gelabeld met Fluo-04:00 (Ca ^{2 +,} groene signalen, links panelen) en TMRE (mitochondriale, rode signalen op de juiste panelen). Beelden tonen transiënten voor en na de osmotische druk veranderingen. Klik hier voor grotere afbeelding .

Discussion

Deze methode van beoordeling van Ca ^{2 +} vonken in intacte skeletspier is een handig hulpmiddel voor spier fysiologie en onderzoek naar ziekten. We zien dat de ^{Ca2 +} vonk reactie werd veranderd in verschillende omstandigheden, waaronder spierdystrofie ^11, verouderen ^{18, _19,} evenals in amyotrofische laterale sclerose ^20. Onze recente studie bleek ook functionele koppeling tussen _IP-3 receptor en RyR die een kritische component die bijdraagt ​​aan Ca ^{2 +} vonken activering in de skeletspier vezels ^21. Verscheidene andere onderzoeksgroepen aangepast ook deze techniek te verkennen de functionele activiteiten en de effectiviteit van gen redding strategieën van dystrofe spieren ¹² en koppel Ca ^{2 +} vonk signalering naar veranderde redox stress in sommige ziektebeelden ^13,22. Het feit dat membraan vervorming door osmotische stress de onderdrukking van DHPR op RYR overeen te verlichtenlate mooi met de essentiële rol van de fysieke interactie (koppeling) van DHPR-RYR bij het ​​moduleren van Ca ^{2 +} vonken in het onderscheiden van skeletspieren ^23, en dus deze bevindingen verder te impliceren Ca ^{2 +} vonken als belangrijke fysiologische gebeurtenissen. Verdere uitbreiding van deze techniek om een aantal fysiologische of remmers van toepassing op Ca ^{2 +} vonken moduleren zal duidelijke informatie over Ca ^{2 +-signalen} in de cellen ²⁴ te verstrekken.

De meest kritische fase van onze test is om intact spiervezels onder de microscoop te isoleren en te identificeren voordat Ca ^{2 +} kleurstof laden. Een cruciale stap in dit protocol is het collagenase spijsvertering tijd en temperatuur als het wijzigen van deze voorwaarden kan mogelijk celmembraan schade maken tijdens vezel isolatie. Een vezel wordt vast bevestigd aan de bodem van de delta TPG gerechten en weer intacte morfologie met karakteristieke rechte, staafvormig uiterlijk, grootte van 70-100 _6; m (lengte) en 8-18 micrometer (kruis diameter), uniform strepen patroon en een vlotte sarcolemmale membraan bruikbaar te zijn voor Ca ^{2 +} vonken meting. Een verbetering van eerdere beperkingen van het verzamelen van gegevens is het nemen van metingen bij verschillende focale vliegtuigen binnen elke vezel om de meest nauwkeurige metingen mogelijk van de Ca ^{2 +} vonken vangen. Hoewel we gebruik maken van een custom-afgeleide "Spark Fit" algoritme om vonk frequentie, dynamiek en kenmerken te analyseren, soortgelijke programma's zijn beschikbaar voor het publieke domein voor het analyseren vonk parameters kenmerken zoals "SparkMaster" in ImageJ ^17. Lichte wijzigingen van deze methode kan een betere visualisatie van Ca ^{2 +} laten vonken in andere soorten weefsel die reageren op osmotische stress bemiddelde triggering van Ca ^{2 +} los te maken van de ryanodinereceptor.

Visualisatie van lokale en globale Ca ^{2 +} signalen in volwassen skelet spiervezels is een zeer nuttig instrument for spierfysiologie en cardiovasculair onderzoek. Uitbreiding van deze methode voor de detectie van Ca ^{2 +} vonken in de skeletspieren samen met verschillende diermodellen van menselijke ziekte onderzoek en implementatie van de krachtige moleculaire biologie benaderingen (bv. gen overexpressie of gene silencing) moeten uitgebreide informatie over de regulering van Ca ^{2 +} produceren signalering in de menselijke gezondheid en ziekten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope			Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors and fine tip forceps	Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	DOW CORNING	184 SIL ELAST KIT	Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60 mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become a clear, colorless solid substrate.
60 mm glass Petri dish	Pyrex	3160	Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C-5138	Fiber digestion
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluorescent Ca2+ imaging dyes
TMRE	Invitrogen	T669	mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes	Bioptechs	0420041500C	35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software			data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	Bio-Rad
3 Axis Micromanipulator	Narishige International	MHW-3
Temperature controllable orbital shaker	New Brunswick scientific		Fiber dissociation