I Intakta Skeletal Muscle Fibers Bedömning av Kalcium Sparks

Summary

Beskrivs här är en metod för att direkt mäta kalcium gnistor, de elementära enheter av ^{Ca2 +} släppa från sarko retiklet i intakta skelettmuskelfibrerna. Denna metod använder osmotisk stress medierad utlösning av Ca ^{2 +} frisättning från ryanodinreceptorn i enstaka muskelfibrer. Dynamiken och homeostatiska kapacitet intracellulär ^{Ca2 +-signalering} kan användas för att bedöma muskelfunktion i hälsa och sjukdom.

Abstract

Att upprätthålla homeostatiska ^{Ca2 +-signalering} är en grundläggande fysiologisk process i levande celler. Ca ^{2 +-gnistorna} är de elementära enheter av ^{Ca2 +-signalering} i tvärstrimmiga muskelfibrer som visas som mycket lokal Ca ^{2 +} frisättning händelser medierade av ryanodinreceptorn (RyR) ^{Ca2 +} släppa kanaler på sarko retikulum (ER)-membranet. Korrekt bedömning av muskel ^{Ca2 +-gnistor} skulle kunna ge information om de intracellulära ^{Ca2 +} hanteringsegenskaper för friska och sjuka tvärstrimmiga musklerna. Trots att ^{Ca2 +} gnistor händelser är vanliga i vila cardiomyocytes, de är sällan hos vilande skelett muskelfibrer, och därför finns det ett behov av metoder för att generera och analysera gnistor i skelettmuskelfibrerna.

Detaljerad här är ett experimentellt protokoll för mätning av Ca ^{2 +-gnistor} i isolerade flexor digitorm brevis (FDB) muskelfibrer använder fluorescent ^{Ca2 +-indikatorer} och laserskanning konfokalmikroskopi. I detta synsätt, är isolerade FDB fibrer utsätts för övergående hypoosmotisk spänning följt av en återgång till isoton fysiologisk lösning. Under dessa förhållanden gnistor en robust ^{Ca2 +,} svar detekteras i anslutning till sarcolemmal membranet hos unga friska FDB muskelfibrer. Altered ^{Ca2 +} gnistor svar detekteras i dystrofiska eller åldrade skelettmuskelfibrerna. Detta tillvägagångssätt har nyligen visat att membranavgränsade signalering omfattar överhörning mellan inositol (1,4,5)-trifosfat-receptorn (IP ₃ R) och RyR bidrar till ^{Ca2 +} gnista aktivering i skelettmuskulaturen. Sammanfattningsvis våra studier med osmotisk stress Ca ^{2 +} gnistor visade att denna intracellulära svar reflekterar en muskel signaleringsmekanismen inom fysiologi och åldrande / sjukdomstillstånd, inklusive musmodeller av muskel dystrofi (mdx möss) eller amyotrofisk lateralskleros (ALS modell).

Introduction

Intracellulär fri Ca ^{2 + ([Ca2 +]} _i) är en mångsidig och viktig sekundär budbärare som reglerar flera cellulära funktioner i retbara celler såsom neuroner, hjärt-, skelett-och glatt muskulatur (för översikt se Stutzmann och Mattson ^1). Reglerad Ca ^{2 +} mobilisering och överhörning mellan sarko retiklet (SR) och T-tubuli (TT) membran är grundläggande regulatorer av muskelfysiologi. Dessutom förändringar i ^{Ca2 +-signalering} hade visat sig vara en underliggande mekanism av kontraktil dysfunktion i olika muskelsjukdomar.

^{Ca2 +-gnistor} är lokaliserade elementära Ca ^{2 +} frisättning händelser härrör från öppningen av ryanodinreceptorn (RyR) kanal på sarko retiklet (SR) membran ^2. I hjärtmuskeln, gnistor uppstår spontant genom öppnandet av RyR2 kanalen med en ^{Ca2 +-inducerad Ca2 +} release (CICR) mekanism ^3-5. I skelettmuskulatur, är RyR1 noga kontrolleras av spänningssensorn vid TT membran ^6,7. Således Ca ^{2 +-gnistor} undertrycks och sällan upptäcks i vilande förhållanden i intakta skelettmuskelfibrerna. Tills nyligen, till sarcolemmal membranet behövde störas av olika kemiska eller mekaniska "flås" metoder för att koppla loss undertryckandet av spänningssensorn på RyR1 och tillåtet för ^{Ca2 +} gnista händelser som ska detekteras i skelettmuskel ^8,9. En metod som tidigare beskrivits krävs permeabilization av membranet av muskelfibrer genom saponin tvättmedel ^10.

År 2003 upptäckte vi att antingen övergående hypoosmotisk stress eller hyperosmotisk stress kan inducera perifer ^{Ca2 +} gnistor intill sarcolemmal membranet i intakta muskelfibrer ^11. Denna metod har sedan modifierats för att studera den molekylära mekanismen, och modulering av Ca ^{2 +} 12-16. Här redogör vi detaljerna i vår experimentella metod för induktion, detektion och analys av Ca ^{2 +-gnistor} i intakt skelettmuskulatur. Vi presenterar också våra specialbyggda spark analys program som kan användas för att kvantifiera de elementära egenskaper hos enskilda ^{Ca2 +-gnistor} i skelettmuskulaturen, t ex tänd frekvens och amplitud (Δ f/f0, vilket speglar den öppna sannolikheten för Ryr-kanaler och Ca ^{2 +} belastning inne i SR), tid till maximal (stigtid) och varaktighet (FDHM, full varaktighet vid halv-maximal amplitud) av gnistor, samt den rumsliga fördelningen av Ca ^{2 +-gnistor.} Dessutom presenterar vi bevis som länkar förändrad ^{Ca2 +-gnistor} till de olika patofysiologiska tillstånd i skelettmuskulaturen, såsom muskeldystrofi och amyotrofisk lateralskleros.

Fördelen med denna teknik innefattar förmågan att mäta Ca ^{2 +} i relativt fria från skadoråldrade celler, istället för strippmuskelfibrerna, vilket gör inspelning av Ca ^{2 +} gnistor i förhållanden närmare fysiologiska. Dessutom ger vårt specialutformat program mer exakta beräkningar av egenskaperna hos den gnista i förhållande till muskelfibrerna.

Protocol

1. Ställa in Osmotisk-stress Perfusion System

Figur 1 är en schematisk protokoll av kalcium gnistor bedömning i intakta skelettmuskelfibrerna.

1. Sätt upp en tre-axeln (xyz) mikromanipulator kapabel att placera utloppsspets perfusionssystemet innehåller minst två kanaler. Detta kan göras med engångs Luer-sprutbehållare med bifogad tre - sätt Luer - Lok kranen för att slå på och / eller stänga av flödet av infusionsvätskor. Dessa infusionskanalerna bör vara kapabel att leverera> 1 ml / min av lösningen genom ett enda perfusion spets med en> 0,2 mm i diameter.
2. Fyll på två kanaler av perfusionssystemet, en med Isoton Tyrode-lösning och den andra med hypoton Tyrode-lösning.

2. Förbereda Intakt Single Flexor Digitorum Brevis (FDB) muskelfibrer från mus

1. Ta bort foten från en mus euthanized följande NIH och IACUC riktlinjer med hjälp av ett par av tunga dissekera sax genom att skära genom benet ovanför fotleden.
2. Klämma foten på en dissektion kammare fylld med Kortaste ^{Ca2 +} Tyrode-lösning med den plantara ytan vänd uppåt.
3. Dissekera FDB genom skärning senan och försiktigt dra upp på senan att separera muskler från den omgivande vävnaden.
4. Avsluta dissektion genom att skära den distala senan där den förgrenar i enskilda siffror i de djupa lagren av muskler.
5. Överför FDB muskeln genom att plocka upp med pincett via sina senor för att undvika ytterligare skador på muskelfibrerna och placera in i ett rör med en upptinad alikvot av kollagenas Digestion Solution uppvärmd till 37 ° C.
6. Inkubera röret innehållande FDB upprätt på en orbital skakanordning vid 37 ° C under 60-90 min med en hastighet av 160 varv per minut. Denna muskelbuntar dissociation protokoll behöver undersökas experimentellt för olika stammar av djur, Särskilt för de sjukdomar / muterade fibrer utsatta för membranskador.
7. Överför den digere FDB in i röret med 700 | il av Isoton Tyrode-lösning och försiktigt mal sönder för att frigöra fibrerna genom dragning muskeln flera gånger genom en serie av 200 ml-mikropipett spetsarna av gradvis minskande diameter via skärning med ett rent rakblad för att avlägsna spetsarna av 200 ml mikropipett. För att undvika skadliga fibrer i särskilt svaga muskler från sjukdom, se till att spetsen är precis så stort att fiberbunten att passera utan att fastna. Tvinga inte bunten genom för liten öppning.
8. Plate ut FDB fibrer genom att knacka försiktigt och resuspending FDB fibrer i röret och sedan dra ut 70 ml (1/10 av total fibrer) med ett snitt 200 ml mikropipett i mitten av en 35 mm Delta TPG skål innehållande 1 ml isoton Tyrode-lösning för att minska diffusion över skålen.
9. Bestäm antalet intakta enstaka fibrer i dish med användning av ett dissekeringsmikroskop. Lägg till ytterligare alikvoter av FDB fibrer för att få 3-4 intakta fibrer på skålen.
10. Förvara extra isolerade muskelfibrer vid 4 ° C och använd inom 6 timmar.

3. Fluo-4:00 Dye Lastning och Ca ^{2 +} Imaging (Sparks Mätning)

1. Överför 500 ml av Isoton Tyrodes lösning från skålen med pläterade FDB fibrer i ett rör med 10 ml Fluo-04:00 lager (1 mM), blanda och tillsätt tillbaka till skålen till en slutlig Fluo-4:00 koncentration av 10 mM. Alternativt kan pluronsyra användas för att öka färgladdningseffektivitet.
2. Belastning under 60 min vid rumstemperatur i mörker.
3. Tvätta fibrerna genom att försiktigt dra ut 500 ml Fluo-4:00-innehållande Isotonic Tyrode lösning från skålen med en oklippt 200 ml-plast mikropipett spets och ersätta med lika stor volym färskt Isotonic Tyrode lösning.
4. Upprepa denna process ytterligare 3 gånger.
5. Att visualisera mitokondriell funktion, överför 500 ml Isotonic Tyrode lösning från skålen med FDB fibrer i ett rör med 5 ml TMRE lager (1 mM), blanda och lägg tillbaka i skålen för en slutlig koncentration på 50 nM.
6. Inkubera vid rumstemperatur i 10 min.
7. Tvätta fibrerna genom att försiktigt dra ut 500 ml TMRE innehåller Isotonic Tyrode lösning från skålen med en oklippt 200 ml plast mikropipett spets och ersätta med lika stor volym färskt Isotonic Tyrode lösning.
8. Upprepa denna process ytterligare 3 gånger.
9. Överför skålen till konfokalmikroskop och välj en intakt fiber med tydliga strimmor och en jämn sarcolemmal membran för experiment.
10. Placera spetsen på perfusionssystemet 400-500 ìm bort från målet muskelfiber och excentriskt med hjälp mikromanipulator kontroller.
11. Börja flödet av Isotonic Tyrode lösning för att säkerställa FDB fibrer håller sig på plats.
12. Spela in fluorescenssignalen från Fluo-4:00 med en 40X oljeimmersionsobjektiv och väcka Fluo-4:00 med enargon laser (excitationsvåglängd 488 nm) och utsläpps rekord signaler (våglängd 510-580 nm). Intensiteten hos den fluorescerande signalen är proportionell mot den relativa nivån av intracellulär ^{Ca2 +-koncentration} ([Ca ^{2 +]} _i).
13. Inducera Ca ^{2 +-transienter} genom att ändra det osmotiska trycket i den extracellulära lösningen för att producera osmotisk påkänning på fibern. Initialt BEGJUTA fibrerna med Isoton Tyrode-lösning (290 mOsm) (baslinje samling för 60 sek) och sedan med hypoton Tyrode-lösning (170 mOsm) under 100 sek för att inducera svallning. BEGJUTA FDB fibrer tillbaka med Isotonic Tyrode lösning. Generellt är endast en osmotisk chock anbringades på en enda intakt fiber i en delta TPG skålen och tändhändelser sista 10 min för datainsamling.
14. Rekord spatial lokalisering av Ca ^{2 +} gnistor (Figur 2) med hjälp av en tidsserie av xy tvådimensionella bilder med skanningshastighet på 166 rader (linjer per sekund, och ealm linje bestående av 512 pixlar som resulterar i 3,08 sek / ram) för varje tillstånd av isotonisk (1 min), hypoton stress (100 sek) och efter hypotonisk stress (5 min). Store signaler för offline analys för att utvärdera fördelningen och frekvensen av Ca ^{2 +-gnistor} efter slutförandet av experimentet.
15. Hitta en ny fiber på en ny maträtt och följer samma osmotisk chock protokoll för att inducera Ca ^{2 +} transienter. Använd en konfokal linje scan (xt) läge (512 pixlar i längd, samplingshastighet på 2 msek / rad scan för att spela in Ca ^{2 +} transienter i en minut (dvs 30.000 rader) med den konfokala sveplinje placeras direkt under sarcolemmal membran (Figur 3 ). Ändra linjeavsökningen till olika fokalplan för att spela in tre sekventiella serier (vid 1-minuters intervall) av linescans för analys av storleken och kinetik av enskilda ^{Ca2 +-gnistor.}

4. Dataanalys

1. Samla ett stort antalxt line scan spår att utvärdera morfologi och kinetik av enskilda Ca ^{2 +-gnistor} parametrar, dvs amplituden (F / F _0, där F ₀ är den vilande ^{Ca2 +} fluorescens), stigtid, tid till toppen, varaktighet (FDHM , full längd vid halv storlek), och rumsbredd (FWHM, full bredd vid halv storlek) av de inspelade gnistor. Dessa parametrar representerar de grundläggande grind egenskaper Ryr Ca ^{2 +-kanaler} som ^{Ca2 +} flöde (amplitud), och grind kinetik RYRs (varaktighet).
2. Analysera digitala bilddata med en egen-utvecklad, halvautomatisk algoritm som skapades med bildbearbetnings språket IDL (Interactive Data Language), som beskrivits tidigare ^11,16. Eftersom de unika kinetik ^{Ca2 +} släppa i fallet med Ca ^{2 +-gnistor} inducerade i FDB fibrer genom osmotisk stress, är det bättre att kombinera manuella och automatiserade funktioner i ^{Ca2 +} gnista händelseridentifiering och behandling med dessa beställnings-build bildanalysprogram ^11. Denna algoritm är mycket användbart när det är nödvändigt att manuellt identifiera ROI (regionen av intresse) i vissa muskelsjukdomsmodeller. När en ROI är definierad, kan algoritmen automatiskt härleda ovannämnda gnista parametrar som sedan kan exporteras till Excel-fil. Alternativt allmänheten tillgängliga bildbehandlingsprogram, t.ex. SparkMaster i ImageJ, kan användas för att definiera de kinetiska egenskaperna för ^{Ca2 +} gnistor och deras rumsliga fördelning i skelettmuskeln ^17.

Representative Results

Tidigare studier har visat att övergående hypoosmotisk stressen inducerad perifer ^{Ca2 +} sparks intill sarcolemmal membranet i intakta muskelfibrer ^11. Figur 1 visar bilder av intakta enstaka muskelfibrer med blank sarcolemmal membranet och karakteristiska tydliga strimmor. Figur 2 visar typiska Ca ^{2 +} gnistor (som xy-bilder) inducerades av övergående (100 sek) behandling med en hypoosmotisk lösning som sväller de FDB muskelfibrer från unga, friska möss. Eftersom muskelfiber krymper tillbaka till den ursprungliga volymen, kommer ett robust ^{Ca2 +} gnista svaret vara direkt under sarcolemma av muskelfibrer. Dessa xy bilder används för att beräkna tänd frekvenser och plotta sönderfallsprofilen för denna respons. Figur 3 visar typiska linjeavsökningar (xt) som genererats med denna typ av tänd analys. Den konfokala avsökningslinje är belägen direkt under densarcolemmal membran (figur 3A). Tidsserierna för gnista händelser tas upp och den specificerade ROI (regionen av intresse) kunde identifieras med vår egen utvecklade, halvautomatisk "Spark Fit"-programmet (Figur 3B). Figur 3C visar en typisk Spark Fit analys av amplitud och Kinetiken för givet Ca ^{2 +} gnista. Ca ^{2 +} gnista Nivån beräknas som amplituden förändring av Fluo-4:00 signaler (Δ F / F _0, där F är toppen Fluo-4 intensitet och F ₀ är den vilande Fluo-4 intensitet innan gnista uppstår). Varaktigheten av den gnista representeras av FDHM (full varaktighet halv storleksordning) och stigtiden samt tiden till maximal kan också beräknas. En typisk 3D (tredimensionell) representation kan göras från specificerade ROI för att visa ^{Ca2 +} intensitet förändring (Figur 3D) Figur. 4 visar bilder av Ca ^{2 +} gnistalinescans från skelettmuskelfibrerna under olika fysiologiska och patofysiologiska tillstånd. Linje scan (xt) serie av ^{Ca2 +} gnistor från friska, unga (3 månader) vildtyp muskel (Figur 4A), och åldern (22 månader) muskel (Figur 4B). Observera den minskade signalen som uppträder hos åldrade muskelfibrer. De unga mdx muskelfibrer visa robusta Ca ^{2 +} gnistor (figur 4c). Figur 5 visar Ca ^{2 +} gnistor (xy bilder) från extensor digitorum longus (EDL) muskelfibrer från vildtyp (figur 5A) och amyotrofisk lateralskleros (ALS) sjukdom, en motorneuronsjukdom med karakteristisk muskelatrofi och skadade mitokondrier (Figur 5B). ^{Ca2 +-intensiteter} är show med Fluo-4 signaler (grön, vänster paneler) och mitokondrierna andningstillstånd visas efter TMRE signaler (röd, höger sida). Notera att tHan skadade mitokondrier (förlora TMRE signal) hamnar robusta ^{Ca2 +-gnistor.}

Figur 1. Schematisk protokoll av kalcium gnistor bedömning i intakta skelettmuskelfibrerna. Schematisk protokoll av kalcium gnistor bedömning i intakta skelettmuskelfibrerna. Detta visar stegvis förfarande för att erhålla intakta FDB muskelfibrer för analys och upplägget av perfusion system för att framkalla osmotisk stress på fibrer. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Representant Ca ^{2 +} gnistor (XY bilder) episoder av skelett FDB muskelfibrer. Mitten spår visar tidslinjen och motsvarande xy bilder (överst paneler) till den sekventiella osmotiska tryckändring i protokollen. Överst till vänster panel - fiber behandlad med isoton Tyrode lösning, övre mittpanel - fiber behandlad med Hypoton Tyrode-lösning, och den övre högra panelen - fiber återvände till behandling med Isotonic Tyrode lösning. Ett representativt histogram av tänd episoder som observerats med xy avbildning visas på botten. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3. Representativa ^{Ca2 +} spa RKS (linje skannar xt bilder) och Spark Fit analys (A) Confocal linjeavsökningen (röd streckad linje) är placerad precis under sarcolemmal membranet av muskelfibrer,. (B) Osmotisk stressen kallat diskret ^{Ca2 +-gnistor} presenteras som linjeavsökningen (xt) läget. (C) Spark analys med Spark Fit algoritm för att visa att Ca ^{2 +} intensitet (Δ F / _F-0), som är proportionell mot den SR ^{Ca2 +} släppa flux, och kinetik (varaktighet, representerad som FDHM). (D) Tredimensionell handlingen i en Fluo-4 line scan bild som visar de osmotiska stressframkallat gnistor i tid och rum läge och deras intensitet. Klicka här för att visa en större bild .

/ Ftp_upload/50898/50898fig4.jpg "width =" 600px "/>
Figur 4. Representativa Ca ^{2 +-gnistor} i muskel fysiologiska och patofysiologiska tillstånd som svar på osmotiska stressen (A) linjeavsökningar (xt bilder) av Ca ^{2 +-gnistor} som härrör från unga (3 månader) friska FDB muskelfibrer,. (B) gnistor från åldern ( 22 månader) FDB muskelfibrer och (C) gnistor från unga (3 månader) dystrofisk mdxmus FDB muskler. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 5. Representativa Ca ^{2 +} gnistor (XY bilder) från FDB muskler som svar på osmotisk stress. (A 2 + gnistor (XY bilder) från vildtyps FDB muskler och (B) ca ^{2 +} gnistor från ALS-muskler. FDB muskelfibrer samtidigt märkta med Fluo-4:00 (Ca ^{2 +,} gröna signaler, vänster paneler) och TMRE (mitokondriell, röda signaler på höger sida). Bilder visar transienter före och efter osmotiska tryckförändringar. Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

Denna metod för att bedöma Ca ^{2 +-gnistor} i intakt skelettmuskel är ett användbart verktyg för muskelfysiologi och forsknings sjukdom. Vi visade att Ca ^{2 +} gnista responsen ändras under olika förhållanden, inklusive muskeldystrofi ^11, åldrande ^{18, _19,} såväl som i ALS ^20. Vår senaste undersökning visade också funktionell koppling mellan IP _3-receptorn och RyR representerar en kritisk komponent som bidrar till Ca ^{2 +-gnistor} aktivering i skelettmuskelfibrerna ^21. Flera andra forskargrupper anpassas också denna teknik för att undersöka de funktionella aktiviteter och effekten av genen räddningsstrategier dystrofa muskler ^12, och länka ^{Ca2 +} gnista signalering till förändrad redox stress i vissa sjukdomstillstånd ^13,22. Det faktum att membranet deformeras genom osmotisk stress lindra undertryckandet av DHPR på Ryr motsvaftalater fint med den viktiga roll som fysisk interaktion (koppling) i DHPR-Ryr i moduler Ca ^{2 +-gnistor} som skiljer skelettmuskeln ^23, och därmed dessa resultat ytterligare blandar Ca ^{2 +-gnistor} som viktiga fysiologiska händelser. Ytterligare utbyggnad av denna teknik för att tillämpa vissa fysiologiska medel eller inhibitorer att modulera Ca ^{2 +-gnistor} kommer att ge insiktsfulla information om ^{Ca2 +} signalering i cellerna ^24.

Det mest kritiska steget i vår analys är att isolera och identifiera intakta muskelfibrer under mikroskop innan ^{Ca2 +} färgämne lastning. Ett viktigt steg i detta protokoll är kollagenasdigestion tid och temperatur som att ändra dessa villkor skulle kunna göra cellmembranet skador under fiberisolering. En fiber skall vara stadigt fastsatt på botten av delta TPG rätter och visa intakt morfologi med karakteristiska raka, stav-liknande utseende, storlek 70-100 _6, m (längd) och 8 till 18 | im (tvär diameter), uniform ränder mönster och en slät sarcolemmal membran för att vara användbara för Ca ^{2 +-gnistor} mätning. En förbättring på tidigare begränsningar för datainsamling tar mätningar vid flera fokalplan inom varje fiber för att fånga de mest noggranna mätningar möjligt av ^{Ca2 +-gnistor.} Även om vi använder en anpassad-derived "Spark Fit" algoritm för att analysera gnista frekvens, dynamik och egenskaper, liknande program är tillgängliga för offentliga området för analys av gnista parametrar egenskaper såsom "SparkMaster" i ImageJ ^17. Smärre modifieringar av denna metod möjliggör bättre visualisering av ^{Ca2 +-gnistor} i andra vävnadstyper som svarar på osmotisk stress medierad utlösning av ^{Ca2 +} släppa från ryanodinreceptorn.

Visualisering av lokala och globala Ca ^{2 +-signaler} i vuxen skelettmuskelfibrerna är ett mycket användbart verktyg for muskelfysiologi och kardiovaskulär forskning. Utbyggnad av denna metod för detektion av ^{Ca2 +-gnistor} i skelettmuskulaturen tillsammans med olika djurmodeller för forskning och tillämpning av de kraftfulla molekylärbiologiska metoder (t.ex. gen överuttryck eller utsläckning av geners uttryck) mänskliga sjukdomar bör ta fram omfattande information om reglering av ^{Ca2 +} signalering på människors hälsa och sjukdomar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope			Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors and fine tip forceps	Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	DOW CORNING	184 SIL ELAST KIT	Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60 mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become a clear, colorless solid substrate.
60 mm glass Petri dish	Pyrex	3160	Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C-5138	Fiber digestion
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluorescent Ca2+ imaging dyes
TMRE	Invitrogen	T669	mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes	Bioptechs	0420041500C	35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software			data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	Bio-Rad
3 Axis Micromanipulator	Narishige International	MHW-3
Temperature controllable orbital shaker	New Brunswick scientific		Fiber dissociation