Summary
Doğrudan kalsiyum kıvılcım ölçülmesi için bir yöntem aşağıda tarif edilmiştir, Ca2 + elementer birim sağlam iskelet kas lifleri Sarkoplazmik retikulumdan bırakın. Bu yöntem, izole kas lifleri riyanodin reseptörü, Ca2 + serbest ozmotik stres-kaynaklı tetikleme kullanır. Dinamikleri ve hücre içi Ca 2 + sinyalizasyon homeostatik kapasitesi sağlığı ve hastalıkları, kas fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilir.
Abstract
Homeostatik Ca2 + sinyali bakımı canlı hücreler temel bir fizyolojik süreçtir. Ca 2 + kıvılcımlar gibi son derece sarkoplazmik retikulum (SR) membran kanalları yayınlayacak + (RyR) Ca riyanodin reseptörünün aracılık Ca 2 + serbest etkinlikler 2 lokalize görünen çizgili kas liflerinde sinyal + Ca 2 temel birimleridir. Uygun değerlendirme kas Ca 2 + kıvılcım sağlıklı ve hastalıklı çizgili kas hücre içi Ca2 + taşıma özellikleri hakkında bilgi verebilir. Ca 2 + olaylar yaygın olarak dinlenme kardiyomiyositlerde görülür kıvılcım rağmen, nadiren iskelet kas lifleri dinlenme gözlenmektedir, dolayısıyla iskelet kas lifleri kıvılcım oluşturmak ve analiz etmek için yöntemler için bir ihtiyaç vardır.
Burada ayrıntılı f kullanılarak izole fleksör digitorm brevis (FDB) kas lifleri Ca 2 + kıvılcım ölçmek için deneysel bir protokoldürluorescent Ca 2 + indictors ve lazer tarama konfokal mikroskopi. Bu yaklaşımda, izole edilmiş FDB lifler izotonik fizyolojik çözelti için bir dönüş ardından geçici hypoosmotic strese maruz kalmaktadır. Bu koşullar altında, sağlam bir Ca2 + cevabı sağlıklı genç FDB kas liflerindeki sarkolemmal zara bitişik tespit edilir kıvılcım. Altered Ca 2 + yanıtı distrofik veya yaşlı iskelet kas lifleri tespit edilir kıvılcım. Bu yaklaşım, son membran ile ayrılmış sinyal inositol arasındaki çapraz-(1,4,5)-trifosfat alıcısı (IP 3 R) ile ilgili olduğunu göstermiştir ve RyR Ca iskelet kasında 2 + kıvılcım etkinleştirme katkıda bulunur. Özetle, ozmotik stres kullanarak çalışmalarımız kaynaklı Ca 2 + kıvılcımlar bu hücre içi yanıt bir kas fizyolojisi mekanizması sinyalizasyon ve fare kas distrofi modelleri (mdx fare) veya Amyotrofik lateral skleroz (ALS modeli dahil / hastalık durumlarını, yaşlanma yansıtır gösterdi.)
Introduction
Hücre içi serbest Ca 2 + ([Ca 2 +] i) (inceleme için Stutzmann ve Mattson 1 bakınız) nöronlar, kalp, iskelet ve düz kaslar gibi uyarılabilir hücrelerde birden fazla hücre fonksiyonlarını düzenler, çok yönlü ve önemli bir ikincil habercidir. Sarkoplazmik retikulum (SR) ve T-tübül arasındaki Ca 2 + seferberlik ve diyafoniyi Ayarlı (TT) membranlar kas fizyolojisinin temel düzenleyiciler vardır. Ayrıca, Ca 2 + sinyal değişimler çeşitli kas hastalıklarında kontraktil fonksiyon bozukluğunun altta yatan mekanizma olduğu ortaya çıkmıştır.
Ca 2 + kıvılcımlar sarkoplazmik retikulum (SR) membran 2 riyanodin reseptörü (RyR) kanal açılması kaynaklanan ilköğretim Ca 2 + release olaylarını yerelleştirilmiş. Kalp kaslarında, kıvılcım bir Ca2 +-kaynaklı Ca 2 + rele ile RyR2 kanalın açıklığı içinden kendiliğinden oluşabilirase (CICR) mekanizması 3-5. Iskelet kasında, RyR1 kesinlikle TT zar, 6,7 gerilim sensörü ile kontrol edilir. Bozulmamış iskelet kas lifleri istirahat koşullarında Böylece Ca 2 + kıvılcımlar bastırılır ve nadiren tespit. + Iskelet kası 8,9 saptanabilir olayları kıvılcım Yakın zamana kadar, gerekli sarkolemmal zar RyR1 üzerindeki gerilim sensörünün bastırılması çözmek için çeşitli kimyasal veya mekanik "arayüz" yöntemlerle bozulduğu ve Ca 2 dir. Bir yöntem, daha önce saponin deterjan 10 ile kas liflerinin, zarın geçirgenliği gerekli tarif.
2003 yılında, biz geçici hypoosmotic stres veya hiperosmotik stres ya 2 + sağlam kas lifleri 11 sarkolemmal zara bitişik kıvılcım periferik Ca neden olabileceğini keşfetti. Bu yöntem beri Ca 2 + moleküler mekanizması ve modülasyon incelemek için modifiye edilmiş 12-16. Burada sağlam iskelet kasında Ca 2 + kıvılcım indüksiyon, algılama ve analiz için deneysel yaklaşımın ayrıntılarını açıklayacağım. Ayrıca, iskelet kası, örneğin kıvılcım frekans ve genliği RyR kanalların açık olasılığını ifade etmektedir (Δ F/F0, tek tek Ca 2 + kıvılcım temel özelliklerini ölçmek için kullanılabilen göre özel olarak yapılmış kıvılcım analiz programını ve SR içindeki Ca 2 + yük), pike geliş zamanı (yükselme zamanı) ve süresi (FDHM, kıvılcımlar yarı maksimal genliğinde tam süresi), hem de Ca 2 + kıvılcım uzamsal dağılımı. Buna ek olarak, bu tür kas distrofisi ve amiyotrofik lateral skleroz gibi iskelet kaslarında çeşitli patofizyolojik durumlarda, Ca 2 + kıvılcım değiştirilmiş bağlantılar kanıt sunar.
Bu tekniğin avantajı, nispeten elle çekilse içinde Ca 2 + ölçmek için yetenek gerektirirbunun yerine, kas lifleri sıyırma için fizyolojik koşullarda kayıt Ca 2 + kıvılcım yakın izin yaşlı hücreleri. Buna ek olarak, özel olarak tasarımlanmış bir program kas lifleri ile ilgili olarak kıvılcım özelliklerinin daha doğru hesaplamalar sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Ozmotik stres Perfüzyon Sistemi Kurulumu
Şekil 1 kalsiyum şematik bir protokol bozulmamış iskelet kas lifleri değerlendirmesini kıvılcım olduğunu.
- Iki kanal ihtiva eden en az bir perfüzyon sistemine çıkış ucu yerleştirme yeteneğine sahip bir üç eksenli (xyz) mikromanipülatör ayarlayın. Yol Luer - - ve / veya perfüzyon çözeltilerin akışının kapatmak için musluk Lok Eklenen bu üç ile tek luer şırınga ile yapılabilir. Bu perfüzyon kanalları,> 0.2 mm çapa sahip olan tek bir perfüzyon ucu boyunca çözelti> 1 ml / dak sunma yeteneğine sahip olmalıdır.
- Perfüzyon sisteminde, Hipotonik Tyrode çözeltisi ile izotonik Tyrode çözeltisi ile bir ve diğer iki kanal yerleştirin.
2. Fare hazırlarken Bozulmamış Tek Flexor Digitorum Brevis (FDB) kas lifleri
- Bir fare ab gelen ayak çıkarınayak bileği eklemi üzerinde bacak keserek ağır diseksiyon bir makas kullanarak NIH ve IACUC kurallarına takip thanized.
- Plantar yüzeyi yukarı bakacak Minimal Ca 2 + Tirod Çözüm ile dolu bir diseksiyon odasının üzerine ayak pin.
- Tendon kesme ve yavaşça çevreleyen dokudan kas ayırmak için tendonun yukarı çekerek FDB teşrih.
- Kas derin katmanlarında bireysel rakamların içine o dalları distal tendon keserek diseksiyon bitirin.
- Kas liflerine ek hasar önlemek ve Kolajenaz Sindirim Çözümü çözülmüş bölümüyle bir tüp içine yerleştirmek için onun tendonlar aracılığıyla forseps ile toplayıp FDB kas aktarın 37 ° C'ye önceden ısıtılmış
- 160 rpm'lik bir hız ile 60-90 dakika boyunca 37 ° C'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde dik FDB içeren tüp inkübe edin. Bu kas demetleri ayrışma protokol deneysel hayvanların farklı suşları için incelenmesi gerekir, Özellikle membran hasarına hassas olan hastalık / mutant lifler için.
- İzotonik Tyrode çözeltisi bir 700 ul bir tüp içine sindirilmiş FDB transferi ve yavaşça ipuçları kaldırmak için yavaş yavaş temiz bir jilet ile kesilmesi ile çapı azalan 200 ml-mikropipet uçları bir dizi kas birkaç kez çizerek lifleri serbest bırakmak için çiğnemek 200 ml mikropipet. Hastalığı özellikle zayıf kaslar zarar lifleri önlemek için, ucu elyaf demeti yapışmadan geçmesine izin vermek için yeterince büyük olduğundan emin olun. Çok küçük bir açıklıktan paket zorlamayın.
- Yavaşça, izotonik, 1 ml ihtiva eden bir 35 mm Delta TPG çanağın merkezine bir kesik 200 mi mikropipet ile çekme ve yeniden süspanse FDB liflerin tüp içinde ve daha sonra 70 ml (toplam liflerin 1/10) dışarı çekilmesi ile FDB zerrelerini Plate Tyrode çözeltisi çanağı boyunca difüzyon azaltmak için.
- D bozulmamış tek liflerin sayısını belirlemekBir diseksiyon mikroskop kullanılarak ish. Yemeğin 3-4 sağlam lifler elde etmek için FDB liflerin ilave alikotları ekleyin.
- 4 ° C 'de ilave izole kas lifleri saklama ve 6 saat içinde kullanın.
3. Flu-04:00 Boya Yükleme ve Ca 2 + Görüntüleme (Sparks Ölçümü)
- Bir boru 10 ml Fluo-4:00 stok (1 mM) ile içine aktarın kaplama FDB elyaflar ile çanak izotonik Tyrode çözeltisi 500 ml, karıştırmak ve 10 mM'lik bir son Fluo-4:00 konsantrasyon için çanak geri ekleyin. Seçenek olarak ise, pluronik asit boya yükleme etkinliğini artırmak için kullanılabilir.
- Karanlıkta, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca yük.
- Dikkatli bir şekilde kesilmemiş 200 ml plastik mikro pipet ile çanak Fluo-04:00-ihtiva eden izotonik Tyrode çözeltisi, 500 ml çizerek lifleri yıkayın ve taze izotonik Tyrode çözeltisinin eşit hacmi ile değiştirin.
- Bu işlemi 3 kez daha tekrarlayın.
- Mitokondriyal fonksiyonu görselleştirmek için, Isoto 500 ml transferibir boru 5 ml TMRE stoğu (1 mM) ile, karıştırın ve 50 nM bir nihai konsantrasyon için geri çanak içine eklemek FDB elyaflar ile çanak nic Tyrode çözeltisi.
- 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- Dikkatli bir şekilde 500 ml çizerek liflerin yıkayın TMRE-ihtiva eden bir kesilmemiş 200 mi, plastik mikro pipet ile çanak izotonik Tyrode çözeltisi ve izotonik Tyrode çözeltisi taze eşit hacimde ile değiştirin.
- Bu işlemi 3 kez daha tekrarlayın.
- Konfokal mikroskop çanak aktarın ve net izlerse ve deney için pürüzsüz sarkolemmal zarı ile bozulmamış bir lif seçin.
- Mikromanipülatördür kontrollerini kullanarak uzak hedef kas lifi gelen ve merkezden perfüzyon sistemi 400-500 mikron ucu yerleştirin.
- FDB lif yerde kalmasını sağlamak için izotonik Tirod Çözüm akışını başlayın.
- 40X immersiyon yağı hedefi ile Flu-04:00 dan floresan sinyalini kaydetmek ve bir ile Flu-04:00 heyecanlandırmakargon lazer (dalgaboyu 488 nm) ve kayıt emisyon sinyalleri (dalga boyu 510-580 nm). Floresan sinyalin yoğunluğu, hücre içi Ca2 + konsantrasyonu ([Ca2 +] i) göreli seviyesi ile orantılıdır.
- Elyaf üzerinde ozmotik stres üretmek için hücre dışı çözeltinin ozmotik basıncının değiştirilmesi ile Ca 2 + transientler neden. Başlangıçta şişmesini sağlamak için 100 saniye boyunca Hipotonik Tyrode çözeltisi (170 mOsM'den) daha sonra da izotonik Tyrode çözeltisi (290 mOsm) (60 saniye için, ana toplama) olan lifleri serpmek ve. İzotonik Tirod çözümü ile FDB lifleri geri serpmek. Genel olarak, tek bir ozmotik şok, bir delta TPG tabak içinde tek sağlam lif ve kıvılcım olaylar veri toplama için son 10 dakika uygulanır.
- 166 LPS (saniyede hat ve adet tarama hızına sahip xy iki boyutlu görüntülerin bir zaman serileri kullanılarak Ca 2 + Kıvılcım (Şekil 2) Tutanak mekansal lokalizasyonuizotonik (1 dakika, her durum için 3.08 saniye / çerçeve ile sonuçlanan 512 piksel) oluşan ch hattı), hipotonik stres (100 saniye) ve post-hipotonik stres (5 dakika). Çevrimdışı analiz için mağazası sinyalleri Deneyin tamamlanmasından sonra Ca 2 + kıvılcım dağılımını ve frekansını değerlendirmek.
- Yeni bir yemeğin üzerine yeni fiber bulun ve Ca 2 + transientleri ikna etmek için aynı ozmotik şok protokolünü uygulayın. Doğrudan sarkolemmal zarın altında yerleştirilen konfokal tarama hattı ile bir dakika (yani 30.000 hat) için Ca 2 + transientleri kaydetmek için bir konfokal çizgi tarama (xt) modu (uzunluğu 512 piksel, 2 milisaniye / satır tarama örnekleme oranı kullanın (Şekil 3 .) tek Ca 2 + kıvılcım büyüklük ve kinetik analizi için linescans arasında 1 dakikalık aralıklarla üç sıralı dizi () kaydetmek için farklı odak düzlemlerine çizgi tarama değiştirin.
4. Veri Analizi
- Çok sayıda toplayın, tepe, süresi (FDHM için zaman, zaman yükselir; xt çizgi tarama, bireysel Ca 2 + kıvılcım parametrelerinin morfolojisi ve kinetik değerlendirmek genliği yani (F 0 istirahat Ca 2 + floresan olan F / F 0) izleri , yarı büyüklükte tam süresi) ve kaydedilen kıvılcım mekansal genişliği (FWHM, yarı büyüklükte tam genişlik). Bu parametreler, örneğin Ca2 + akışı (genlik) olarak RYR Ca2 + kanallarının temel yolluk özelliklerini temsil eder ve RYRs (süre) yolluk kinetiği.
- Daha önce 11,16 açıklandığı gibi, görüntü-işleme dil IDL (Interactive Data Language) ile oluşturulan özel geliştirilmiş, yarı-otomatik bir algoritma ile dijital görüntü verileri analiz. Ca 2 + eşsiz kinetiği ozmotik stres FDB liflerde neden Ca 2 + kıvılcım durumunda serbest bırakmak için, 2 + etkinlik kıvılcım Ca manuel ve otomatik özelliklerini birleştirmek için daha iyidirBu özel-build görüntü analiz programları 11 ile tanımlama ve işleme. Elle bazı kas hastalığı modellerinde ROI (region of interest) belirlemek için gerekli olduğunda bu algoritma çok yararlıdır. Bir ROI tanımlandıktan sonra, algoritma sonra otomatik Excel dosyası ihraç edilebilir yukarıda belirtilen kıvılcım parametrelerini elde edebilir. Seçenek olarak ise, halka açık mevcut görüntü işleme yazılımı, ImageJ SparkMaster örneğin, Ca 2 + kıvılcım kinetik özelliklerini ve iskelet kası 17 kendi uzamsal dağılımını tanımlamak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Daha önceki çalışmalar geçici hypoosmotic stres + çevresel Ca 11. Şekil 1. pürüzsüz sarkolemmal zarı ve karakteristik açık desenli bir bozulmamış tek kas liflerinin görüntüleri gösterir sağlam kas lifleri sarkolemmal zara bitişik 2 kıvılcım kaynaklı olduğunu gösterdi. Şekil 2 tipik Ca 2 + gösterir (xy görüntüler) kıvılcım, genç ve sağlıklı farelerden FDB kas lifleri şişen bir hypoosmotic çözeltisi ile geçici (100 saniye) tedavisi ile indüklenmiştir. Kas lifi özgün hacmi küçülür olarak, sağlam bir Ca 2 + kıvılcım yanıt doğrudan kas lifi sarcolemma altında olacaktır. Bu xy görüntüler kıvılcım frekanslarını hesaplamak ve bu yanıt için çürüme profilini çizmek için kullanılır. 3. kıvılcım analizi bu modda oluşturulan tipik bir çizgi taramalar (xt) göstermektedir. Konfokal tarama hattı doğrudan bir altında yer almaktadırsarkolemmal membran (Şekil 3A). Kıvılcım olayların zaman serisi yakalanır ve belirtilen ROI (region of interest) bizim özel geliştirilmiş, yarı-otomatik "Spark Fit" programı (Şekil 3B) ile tespit edilebilir. Şekil 3C genlik tipik Spark Fit analizini gösterir ve Verilen Ca 2 + kıvılcım kinetiği. Ca 2 + kıvılcım yoğunluğu Fluo-04:00 sinyallerinin amplitüd değişim (F pik Fluo-4 şiddetidir ve F kıvılcım 0 ortaya önce, dinlenme Fluo-4 yoğunluğudur Δ F / F 0) olarak hesaplanır. Kıvılcım FDHM süresi (yarı büyüklükte tam süre) ve yükselme süresi olarak da hesaplanabilir zirve zaman ile temsil edilir. Tipik bir 3D (üç boyutlu) gösterimi Ca 2 + yoğunluğu değişimi (Şekil 3D) göstermek için belirtilen ROI'ler yapılabilir. Şekil 4 Ca 2 + kıvılcım görüntüleri gösteriyorfarklı fizyolojik ve patofizyolojik devletlerin altında iskelet kas lifleri linescans. Sağlıklı, genç (3 ay) türetilen vahşi tip kas (Şekil 4A) ve yaşlı (22 ay) kas (Şekil 4B) Ca 2 + kıvılcımlar çizgi tarama (xt) serisi. Yaşlı kas lifleri meydana indirgenmiş sinyali edin. Genç mdx kas lifleri sağlam Ca 2 + kıvılcım (Şekil 4C) gösterilecek. 5 Şekil gösterir ekstansör digitorum longus (EDL) kas yabani tip lifler (Şekil 5A) ve Amyotrofik lateral skleroz (ALS) Ca 2 + kıvılcımlar (xy görüntüleri) hastalığı, karakteristik kas atrofisi ve zarar görmüş mitokondri (Şekil 5B) sahip bir motor nöron hastalığıdır. Ca 2 + şiddetleri Flu-4 sinyalleri (yeşil, sol paneller) ve solunum devletler TMRE sinyalleri (kırmızı, sağ paneller) tarafından gösterilmiştir mitokondri tarafından gösteri vardır. Bu t Noto sağlam Ca 2 + kıvılcım barındırır (TMRE sinyal kaybetme) mitokondri hasarlı.
Şekil 1. Kalsiyum şematik protokol bozulmamış iskelet kas lifleri değerlendirmesini kıvılcım. Kalsiyum şematik protokol bozulmamış iskelet kas lifleri değerlendirmesini kıvılcım. Bu analiz ve lifler üzerinde ozmotik strese neden perfüzyon sisteminin set-up için sağlam FDB kas lifleri elde etmek için adım adım prosedürü göstermektedir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Temsilci Ca 2 + kıvılcımlar (XY images) iskelet FDB kas liflerinin bölüm. Orta iz protokollerde sıralı ozmotik basınç değişimi için zaman çizelgesi ve ilgili xy görüntüleri (üst paneller) gösterir. Üst sol panel - fiber izotonik Tyrode çözeltisi ile muamele edilmiş, üst orta paneli - Hipotonik Tyrode çözeltisi ile muamele edilmiş fiber ve sağ üst panel - fiber izotonik Tyrode çözeltisi ile muamele döndü. Xy görüntüleme ile gözlenen kıvılcım bölüm temsilcisi histogram altında gösterilir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. Temsilci Ca 2 + spa rks (line xt görüntüleri tarar) ve Fit analizi Spark (A) Eşodaklı çizgi tarama (kırmızı kesikli çizgi) sağ kas lifi sarkolemmal zarı altına yerleştirilir;. (B) Ozmotik stres 2 + kıvılcımlar satır tarama olarak sunulmaktadır ayrık Ca uyarılmış (xt) modu. Kıvılcım Fit SR Ca2 + akışı serbest bırakmak için orantılı olan Ca 2 + yoğunluğunu (Δ F / F 0) göstermek için algoritma ve kinetik (FDHM olarak temsil süresi) ile (C) Spark analizi. (D) uzay-zamansal modu ve onların şiddetleri de ozmotik stres uyarılmış kıvılcımlar gösteren bir Flu-4 hat tarama görüntüsünün üç boyutlu arsa. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
/ Ftp_upload/50898/50898fig4.jpg "width =" 600px "/>
Şekil 4. Ozmotik strese yanıt olarak kas Temsilcisi Ca 2 + kıvılcımlar fizyolojik ve patofizyolojik devletler genç türetilmiş Ca 2 + kıvılcım (A) Hat taramaları (xt görüntüleri) (3 ay) sağlıklı FDB kas lifleri;. (B) (yaşlı oluşan kıvılcımlar 22 ay) FDB kas lifleri ve (C) genç (3 ay) distrofık mdx fare FDB kas kıvılcım. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 5,. Temsili Ca ozmotik strese yanıt olarak FDB kasların 2 + kıvılcımların (XY görüntüler). (A 2 + kıvılcımlar vahşi tip FDB kasların (XY görüntüler) ve ALS kaslardan (B) Ca 2 + kıvılcım. Aynı anda Fluo-04:00 ile etiketlenmiş FDB kas lifleri (Ca 2 +, yeşil sinyalleri sol panel) ve TMRE (mitokondriyal, sağ panel kırmızı sinyaller). Görüntüler osmotik basınç değişiklikleri öncesi ve sonrası transientleri göstermektedir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sağlam iskelet kasında Ca 2 + kıvılcım değerlendirilmesi yöntemi kas fizyolojisi ve hastalık araştırma için yararlı bir araçtır. Biz, Ca 2 + kıvılcım yanıt 18, 19, hem de amyotrofik lateral skleroz 20 yaşlanma, kas distrofisi 11 de dahil olmak üzere, farklı koşullar içinde değiştirilmiş olduğunu gösterdi. Bizim son çalışmada da Ca iskelet kas lifleri 21 2 + kıvılcım aktivasyon katkıda kritik bir bileşeni temsil IP 3 reseptörü ve RyR arasında fonksiyonel bir eşleşme göstermiştir. Birkaç diğer araştırma grupları da fonksiyonel faaliyetleri ve distrofik kasların 12 gen kurtarma stratejilerinin etkinliğini araştırmak ve bazı hastalık durumlarında 13,22 değişmiş redoks strese sinyalizasyon kıvılcım + Ca 2 bağlamak için bu tekniği uyarlanmıştır. Ozmotik stres membran deformasyon RYR ilgili SIM üzerindeki DHPR bastırılmasını rahatlatmak için gerçeğilates güzel iskelet kası 23 ayrımında Ca 2 + kıvılcım modüle DHPR-RyR fiziksel etkileşimi (kavrama) temel rolü ile ve bu nedenle bu bulguların daha fazla Ca 2 + kıvılcım gibi önemli fizyolojik olaylar töhmet. Ca 2 + kıvılcım modüle bazı fizyolojik maddeler veya inhibitörlerinin uygulamak için bu tekniğin daha da genişlemesi hücrelerde 24 sinyalizasyon + Ca 2 anlayışlı bilgi verecektir.
Bizim deneyinde en kritik adım Ca 2 + boya yüklemeden önce bir mikroskop altında sağlam kas lifleri izole etmek ve tanımlamaktır. Bu protokolde bir çok önemli bir adım, bu koşullar, potansiyel olarak elyaf izolasyon sırasında hücre membranı zarar verebilir hale değiştirme gibi kolajenaz sindirim süresi ve sıcaklıktır. Bir elyaf sıkıca _ delta TPG kaplarının dibine eklenmiş ve karakteristik düz, çubuk-benzeri görünüş, 70-100 arasında boyutu olan bozulmamış morfolojiye sahiptir olmalıdır6, m (uzunluk) ve 8-18 um (cross çapı), düzgün çizgi çizgi deseni ve Ca 2 + kıvılcım ölçümü için yararlı olması için, pürüzsüz sarkolemmal zar. Veri toplama önceki sınırlamalar üzerinde bir gelişme Ca 2 + muhtemel kıvılcım en doğru okumaları yakalamak için her bir fiber içinde çeşitli odak düzlemleri ölçümler alıyor. Biz kıvılcım frekansı, dinamiklerini ve özelliklerini analiz etmek için özel bir türevi "Spark Fit" algoritması kullanıyor olsa da, benzer programlar gibi ImageJ 17 "SparkMaster" olarak kıvılcım parametreler özelliklerini analiz için kamu malı mevcuttur. Bu yöntemin hafif değişiklikler ozmotik strese yanıt, diğer doku tiplerinde 2 + kıvılcım riyanodin reseptörü çıkartmak + Ca 2 tetikleme aracılı Ca daha iyi görselleştirme izin verebilir.
Yetişkin iskelet kas lifleri yerel ve küresel Ca 2 + sinyalleri görselleştirme fo çok yararlı bir araçtırr kas fizyolojisi ve kardiyovasküler araştırma. Birlikte insan hastalık araştırma ve güçlü moleküler biyoloji yaklaşımları (örn. gen aşırı veya gen susturma) uygulanması farklı hayvan modelleri ile iskelet kasında Ca 2 + kıvılcım tespiti için bu yöntemin genişleme Ca 2 + yönetmelik hakkında geniş bilgi üretmek gerekir insan sağlığı ve hastalıkları sinyalizasyon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma JM, RO1-AR063084to NLW ve JZ için RO1-AR057404 için RO1-AG028614 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | Dissect out fibers and check muscle integrity | ||
| Dissection tools -scissors and fine tip forceps | Fine Science Tools | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | DOW CORNING | 184 SIL ELAST KIT | Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60 mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become a clear, colorless solid substrate. |
| 60 mm glass Petri dish | Pyrex | 3160 | Fiber dissection |
| Isotonic Tyrode Solution | Sigma-Aldrich | ||
| Minimal Ca2+ Tyrode Solution | Sigma-Aldrich | ||
| Hypotonic Tyrode Solution | Sigma-Aldrich | ||
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | C-5138 | Fiber digestion |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Fluorescent Ca2+ imaging dyes |
| TMRE | Invitrogen | T669 | mitochondrial membrane potential fluorescent dyes |
| Delta TPG dishes | Bioptechs | 0420041500C | 35 mm glass bottom dish for imaging |
| Spark Fit software | data analysis software | ||
| Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | Bio-Rad | ||
| 3 Axis Micromanipulator | Narishige International | MHW-3 | |
| Temperature controllable orbital shaker | New Brunswick scientific | Fiber dissociation |
References
- Stutzmann, G. E., Mattson, M. P. Endoplasmic reticulum Ca2+ handling in excitable cells in health and disease. Pharmacol. Rev. 63 (3), 700-727 (2011).
- Cheng, H., Lederer, W. J.
- Brochet, D. X., et al. Elementary calcium release events from the sarcoplasmic reticulum in the heart. Adv. Exp. Med. Biol. 740, 499-509 (2012).
- Brochet, D. X., et al.
- Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. S. Imaging calcium sparks in cardiac myocytes. Methods Mol. Biol. 689, 205-214 (2011).
- Dulhunty, A. F. Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33 (9), 763-772 (2006).
- Dulhunty, A. F., Casarotto, M. G., Beard, N. A. The ryanodine receptor: a pivotal Ca2+ regulatory protein and potential therapeutic drug target. Curr. Drug Targets. 12 (5), 709-723 (2011).
- Kirsch, W. G., Uttenweiler, D., Fink, R. H. Spark- and ember-like elementary Ca2+ release events in skinned fibres of adult mammalian skeletal muscle. J. Physiol. 537, 379-389 (2001).
- Zhou, J., et al. A probable role of dihydropyridine receptors in repression of Ca2+ sparks demonstrated in cultured mammalian muscle. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 290 (2), 539-553 (2006).
- Zhou, J., et al. Ca2+ sparks and embers of mammalian muscle. Properties of the sources. J. Gen. Physiol. 122 (1), 95-114 (2003).
- Wang, X., et al. Uncontrolled calcium sparks act as a dystrophic signal for mammalian skeletal muscle. Nat. Cell. Biol. 7 (5), 525-530 (2005).
- Teichmann, M. D., et al. Inhibitory control over Ca2+ sparks via mechanosensitive channels is disrupted in dystrophin deficient muscle but restored by mini-dystrophin expression. PLoS One. 3 (11), e3644 (2008).
- Shkryl, V. M., et al. Reciprocal amplification of ROS and Ca2+ signals in stressed mdx dystrophic skeletal muscle fibers. Pflugers. Arch. 458 (5), 915-928 (2009).
- Lovering, R. M., Michaelson, L., Ward, C. W., et al. Malformed mdx myofibers have normal cytoskeletal architecture yet altered EC coupling and stress-induced Ca2+ signaling. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 297 (3), 571-580 (2009).
- Weisleder, N., Ma, J. J. Ca2+ sparks as a plastic signal for skeletal muscle health, aging, and dystrophy. Acta. 27 (7), 791-798 (2006).
- Weisleder, N., Zhou, J., Ma, J. Detection of calcium sparks in intact and permeabilized skeletal muscle fibers. Methods Mol. Biol. 798, 395-410 (2012).
- Picht, E., et al. SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 293 (3), 1073-1081 (2007).
- Weisleder, N., et al. Muscle aging is associated with compromised Ca2+ spark signaling and segregated intracellular Ca2+ release. J. Cell. Biol. 174 (5), 639-645 (2006).
- Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Res. Rev. 7 (3), 177-188 (2008).
- Yi, J., et al. Mitochondrial calcium uptake regulates rapid calcium transients in skeletal muscle during excitation-contraction (E-C) coupling. J. Biol. Chem. 286 (37), 32436-32443 (2011).
- Tjondrokoesoemo, A., et al. Type 1 inositol (1,4,5)-trisphosphate receptor activates ryanodine receptor 1 to mediate calcium spark signaling in adult Mammalian skeletal muscle. J. Biol. Chem. 288, 2103-2109 (2013).
- Martins, A. S., et al. Reactive oxygen species contribute to Ca2+ signals produced by osmotic stress in mouse skeletal muscle fibres. J. Physiol. 586 (1), 197-210 (2008).
- Apostol, S., et al. Local calcium signals induced by hyper-osmotic stress in mammalian skeletal muscle cells. J. Muscle Res. Cell Motil. 30 (3-4), 97-109 (2009).
- Jiang, Y. L., et al. Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP) Activates Global and Heterogeneous Local Ca2+ Signals from NAADP- and Ryanodine Receptor-gated Ca2+ Stores in Pulmonary Arterial myocytes. J. Biol. Chem. 288 (15), 10381-10394 (2013).
