原位 液相中生物组装体的透射电子显微镜观察

摘要

本文介绍了一种利用透射电子显微镜在液体环境中以纳米级分辨率对病毒复合物进行成像的方法。

摘要

研究人员经常使用透射电子显微镜（TEM）来观察生物实体并评估新材料。本文介绍这些仪器的另一项应用——在液体环境中观察病毒组装体。这种令人振奋且新颖的生物结构可视化方法利用了 recently developed 基于微流控技术的样品台。我们的视频文章展示了如何组装和使用微流控样品台，在透射电子显微镜中对液体样品进行成像。具体而言，我们以灵长类轮状病毒双层颗粒（DLPs）作为模型系统。我们还描述了用亲和生物膜包被液体腔室表面的步骤，以将 DLPs 固定在观察窗口上。这使得我们能够以适用于三维结构解析的方式对组装体进行成像。因此，本文首次展示了亚病毒颗粒在天然液体环境中的形态。

引言

生物学家和工程师的共同目标是理解分子机器的内部工作机制。透射电子显微镜（TEM）是用于在接近原子分辨率下观察这些复杂细节的理想仪器^1-2。为了维持透射电子显微镜的高真空系统，生物样本通常被包埋在玻璃态冰薄层³、糖类⁴、重金属盐⁵或其某种组合中⁶。因此，包埋样本的图像可能仅能揭示动态过程的有限快照。

帕森斯（Parsons）及其同事曾利用差分抽气腔室，尝试在环境液体腔中保持生物样本的水合状态。未染色的过氧化氢酶晶体在水合状态下成功获得了分辨率为3 Å的电子衍射图谱^7-8。此外，还可观察人红细胞水合膜中的相分离脂质区域^9-10。然而，由于液体扩散引起的样本运动及其对电子束的干扰，导致分辨率严重下降，因此直到最近之前，尚未再开展针对生物样本的进一步实验。

新开发的微流控样品 holder 采用半导体微芯片构建微尺度环境腔室。这些装置可在样品置于透射电子显微镜（TEM）镜筒内的同时，使其保持在液态环境中^11-12。这一透射电镜成像技术的突破，首次使研究人员能够观察到分子水平上的动态过程¹³。我们将这种新兴技术模式称为“原位分子显微术”（in situ molecular microscopy），因为实验现在可以直接在....

方案

1. 准备亲和捕获装置¹⁶

1. 将硅氮化物E芯片在15 ml丙酮中孵育2分钟，随后在15 ml甲醇 中孵育2分钟，以清洁芯片（图 1A）。在层流通风条件下使芯片自然干燥。
2. 将干燥后的芯片置于加热搅拌板上（不搅拌），在150 °C下孵育1.5小时，然后冷却至室温后再使用。
3. 使用汉密尔顿注射器在小玻璃管中配制脂质混合物，其中包含25%氯仿、55% DLPC（1,2-二月桂酰基-磷脂酰胆碱）氯仿溶液（1 mg/ml）和20% Ni-NTA脂质（1,2-二油酰基-亚氨基二乙酸-琥珀酰-镍盐）氯仿溶液（1 mg/ml），总体积为40 μl。
4. 在湿润的培养皿中，将1 μl该混合物滴加至Parafilm表面的每滴15 μl Milli-Q水中（图 1B）。将样品在冰上孵育至少60分钟。

2. 捕获大分子¹⁷

1. 将带有150 nm集成垫片的E芯片置于单层样品上方，孵育1 min（图 1C）。
2. 轻轻将芯片从样品上提起，加入3 μl His标签蛋白A。室温孵育1 min（

结果

使用经过辉光放电处理的E芯片在液体中观察双层颗粒（DLPs）的代表性图像显示，在给定视野范围内DLPs数量较少（图3A），这可能是由于扩散作用所致，相比之下，通过亲和捕获装置富集的DLPs更为集中（图3B）。在成像腔室中加入甲酸铀酰可增强样品的对比度，从而提高溶液中单个DLPs的可见性（图3C，上图）。更高的对比度有利于后续的图像处理，例如颗粒平均化（图3C，下图）和三维重构分析（图3C，插图），如先前所述¹⁷。简而言之，在进行三维重构时，我们使用SPIDER软件包¹⁹选取了600个DLP颗粒。所选颗粒基于一个初始的轮状病毒DLP模型进行优化²⁰，该模型被滤波至80 Å分辨率。我们采用RELION软件包²¹计算得到一个分辨率约为25 Å的三维重构图。我们的三维密度图与初始模型以及使用相同参数和DLP样品计算出的独立冷冻电镜三维重构结果均具有良好一致性¹⁷。

讨论

在本研究中，我们采用亲和捕获方法将轮状病毒双层颗粒（DLPs）固定于微流控平台，从而实现了 原位 在液体微环境中的大分子复合物成像。该 捕获方法相较于其他微流控成像技术具有重要意义 因为它能将生物样本定位到成像窗口，从而避免在液体中记录图像时出现的大范围扩散问题。然而，其中一个 我们方案中最关键的步骤 涉及将脂质生物膜转移至微芯片表面。若脂质单层未能均匀铺展在网格上，则会导致实验失败。转移步骤不佳的一个表现是流体芯片上结合的病毒组装颗粒极少甚至没有。转移步骤的一个限制因素是脂质层流动性相关的热稳定性。若经评估发现液滴铺展不均，表明转移步骤不充分，此时应将脂质层在冰上或无振动的低温环境中孵育更长时间。此外，培养皿必须用Parafilm充分密封，以维持适当的湿度。

微芯片样品中病毒复合物或衔接蛋白过量可能导致颗粒过度聚集。这是该实验方案中的一个局限性，但可轻松控制。为尽量减少聚集效应，可缩短蛋白因子的孵育时间，或对病毒样品进行进一步稀释。若检测到非特异性蛋白过量，可在缓冲液中加入新鲜配制的咪唑（约50 m.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
E-chips，间隔芯片	Protochips, Inc.	EPB-52TBD	400 μm × 50 μm 窗口
E-chip，顶芯片	Protochips, Inc.	EPT-45W	400 μm × 50 μm 窗口
Ni-NTA 脂质	Avanti Polar Lipids	790404P	粉末形态
DLPC (12:0) 脂质	Avanti Polar Lipids	850335P	粉末形态
容量瓶	Fisher Scientific	20-812A；20-812C	1 ml；5 ml
Hamilton 注射器	Hamilton Co.	80300，80400	1–10 μl；1–25 μl
Whatman #1 滤纸	Whatman	1001 090	100 张，90 mm
玻璃培养皿	Corning	70165-101	100 mm × 15 mm
玻璃巴斯德吸管	VWR	14673-010	14673-010
玻璃培养管	VWR	47729-566	6 mm × 50 mm
丙酮	Fisher Scientific	A11-1	1 L
甲醇	Fisher Scientific	A412-1	1 L
氯仿	Electron Microscopy Sciences	12550	100 ml
带 His 标签的 Protein A	Abcam, Inc.	ab52953	10 mg
Milli-Q 超纯水系统	EMD Millipore Corp.	Z00QSV001	超纯水
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500	500 g
设备
Poseidon 原位样品台	Protochips, Inc.		与 FEI 兼容
FEI Spirit BioTwin 透射电子显微镜（TEM）	FEI Co.		120 kV
Eagle 2k HS CCD 相机	FEI Co.		在 30,000× 下采样分辨率为 10 Å/像素
Gatan 655 干泵站	Gatan, Inc.		将样品台尖端抽至 10-6  范围
PELCO easiGlow 电晕放电仪	Ted Pella, Inc.		负极性模式
Isotemp 加热搅拌器	Fisher Scientific		加热至 150 ºC，持续 1.5 小时