Summary
여기서는 투과 전자 현미경을 이용하여 나노미터 해상도로 액체에 바이러스 성 복합체를 이미지화하는 절차를 설명합니다.
Abstract
연구원은 정기적으로 전염 전자 현미경 (TEM)을 사용하여 생물학적 개체를 검사하고 새로운 물질을 평가합니다. 여기서는 액체 환경에서 이러한 계측기-바이러스 성 어셈블리를 볼 수 있는 추가 응용 프로그램에 대해 설명합니다. 생물학적 구조를 시각화하는 이 흥미롭고 새로운 방법은 최근에 개발된 미세 유체 기반 표본 홀더를 활용합니다. 비디오 기사에서는 미세 유체 홀더를 조립하고 사용하여 TEM 내에서 액체 표본을 이미지화하는 방법을 보여 줍니다. 특히, 우리는 우리의 모델 시스템으로 시미안 로타 바이러스 이중 층 입자 (DlP)를 사용합니다. 우리는 또한 보기 창에 DLP를 묶는 친화성 생물막으로 액체 챔버의 표면을 코팅하는 단계를 설명합니다. 이렇게 하면 3D 구조 결정에 적합한 방식으로 어셈블리를 이미지할 수 있습니다. 따라서, 우리는 네이티브 액체 환경에서 서브 바이러스 입자의 첫 번째 엿볼을 제시한다.
Introduction
생물학자와 엔지니어의 공통된 목표는 분자 기계의 내부 작동을 이해하는 것입니다. 전송 전자 현미경 (TEM)은 거의 원자 해상도1-2에서이러한 복잡한 세부 사항을 시각화하기에 이상적인 도구입니다. TEM의 높은 진공 시스템을 유지하기 위해, 생물학적 샘플은 전형적으로 유리체3,설탕4,중금속 염5,또는 그일부조합6의 박막에 내장되어 있다. 따라서 임베디드 표본의 이미지는 동적 프로세스의 제한된 스냅샷만 나타낼 수 있습니다.
환경 액체 챔버에서 수화 된 생물학적 표본을 유지하기 위한 초기 시도는 파슨스와 동료들이 차동 펌핑 단계를 사용하여 수행되었습니다. 스테인드 카탈라제 결정의 전자 회절 패턴은7-8수화 상태에서 3Å의 해상도로 성공적으로 기록되었다. 또한, 위상 분리지질 도메인은 인간 적혈구9-10의수화 막에서 검사될 수 있었다. 그러나, 액체를 확산시키고 전자빔과의 간섭으로 인한 움직임은, 생물학적 표본을 이용한 심한 분해능 손실 및 추가 실험이 최근까지 시도되지 않았다.
새로 개발된 미세유체 표본 홀더는 반도체 마이크로칩을 활용하여 마이크로 스케일환경챔버를 형성하는 것으로 소개되었습니다. 이러한 장치는 TEM 컬럼11-12에위치하는 동안 액체로 샘플을 유지할 수 있습니다. TEM 이미징의 이러한 기술적 돌파구는 연구자들이 분자 수준13에서처음으로 진보적인 사건을 볼 수 있게 해 주어 왔다. 우리는 실험이 이제 EM 컬럼14-15를"내부"수행 할 수 있으므로"시투 분자 현미경 검사법에서"로이 새로운 양식도를 지칭한다. 이 방법의 전반적인 목표는 나노미터 해상도에서 그들의 동적 행동을 관찰하기 위하여 액체에 있는 생물학 어셈블리를 심상하는 것입니다. 개발 된 기술의 근거는 실시간 관찰을 기록하고 용액에서 생물학적 기계의 새로운 특성을 검사하는 것입니다. 이 방법론은 세포 및 분자 생물학12-16에서더 넓은 목적을 위해 TEM의 사용을 확장합니다.
현재 비디오 문서에서는 시판되는 미세 유체 표본 홀더를 조립하고 사용하는 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 이 전문 홀더는 통합 스페이서로 생성된 실리콘 트랜티드 마이크로칩을 사용하여 미세량의 용액을 둘러싸는 액체 챔버를 형성합니다. 얇고 투명한 창문은 이미징 목적을 위해 마이크로칩에 새겨져있다(12). 우리는 TEM을 사용하여 액체에 있는 simian rotavirus 이중 층 입자 (DlPs)를 검사하기 위하여 미세 유체 홀더의 적당한 사용을 보여줍니다. DP와 같은 생물학적 어셈블리가 이미징 하는 동안 먼 거리에서 빠르게 확산되지 않도록 하기 위해, 우리는 미세 유체챔버(16)의표면에 그들을 묶기 위해 선호도 캡처 접근법을 채택한다. 이 분자 포획 단계는 다운스트림 처리 루틴에 사용될 이미지의 수집을 허용하기 때문에 액체에서 생물학적 표본을 이미징하기위한 대체 기술에 비해 주요 이점이 있습니다. 미세 유체 이미징과 함께 사용되는 이 캡처 단계는 당사의절차(17)에고유합니다. TEM 또는 미세 유체 이미징 챔버를 사용하여 구조 생물학 응용 프로그램을 사용하는 독자는 분자 수준에서 동적 관찰이 최종 목표일 때 친화성 캡처 기술의 사용을 고려할 수 있습니다.
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Protocol
1. 선호도 캡처 장치 준비장치16
- 실리콘 질화물 E 칩을 15 ml의 아세톤으로 2 분 동안 배양하고 2 분 동안 메탄올 15 ml(그림 1A)를청소하십시오. 칩이 라미나르 공기 흐름 아래에서 건조하도록 허용합니다.
- 150°C에서 1.5시간 동안 가열된 교반판에 말린 칩을 배양한 다음 사용하기 전에 실온으로 식힙니다.
- 해밀턴 주사기를 사용하여 작은 유리 튜브에 지질 혼합물을 구성하여 25 % 클로로폼을 함유하고, 클로로폼(1mg/ml)의 55%의 DLPC(1,2-딜라우로일-인포콜린)와 20% Ni-NTA 지질(1,2-디오틸-이미노이아세트산-succinyl-니켈 소금)을 총 40μl의 부피량에 대해 클로로폼(1 mg/ml)이다.
- 습한 페트리접시(그림 1B)에서파라필름 조각에 밀리-Q 물 15μl 방울에 혼합물의 1 μl 알리쿼트를 적용한다. 얼음에 샘플을 60분 이상 배양합니다.
2. 매크로 분자 캡처17
- 단층 샘플 위에 150 nm 통합 스페이서가 있는 E 칩을 1분 동안 배양한다(그림1C).
- 시료의 칩을 부드럽게 들어 올리고 실온에서 1 분 동안 그의 태그 된 단백질 A. 인큐베이터의 3 μl 알리쿼트(그림 1D)를추가합니다.
- Whatman #1 필터 용지를 사용하여 초과 낙하를 블롯하고 즉시 항체 용액의 3 μl 알리쿼트를 추가합니다. 실온에서 1분 동안 배양하십시오.
- 해밀턴 주사기를 사용하여 초과 용액을 제거하고 즉시 50mM HEPES (pH 7.5), 150 mM M NaCl, 10mM MgCl2 및 10mM CaCl2를포함하는 버퍼 용액에 로타 바이러스 DLP (0.1 mg /ml)의 1 μl 알리쿼트를 추가합니다. 실온에서 최소 2분 동안 배양하십시오. DlP의 준비는 이전에 설명되었습니다18.
3. 미세 유체 챔버를 조립하고 시투 시편 홀더를 로드
- 바이러스 성 시료를 포함하는 젖은 E 칩을 미세 유체 표본 홀더의 끝에 적재합니다. 제2 플랫 E-칩을 1분 동안 발광한 다음 스페이서 칩 위에 적재합니다(그림2, 패널 1-5).
- 대안적으로, 생물학적 거대분자의 대비를 높이기 위해 중금속얼룩(예를 들어 0.2% uranyl formate)은 습식 시편에 제2 E칩을 배치하기 전에 습식 시편에 첨가될 수 있다. 그러나 시편을 함유한 E-칩은 대비 시약을 추가하기 전에 밀리-Q 물로 세척해야 합니다.
- 전체 어셈블리를 함께 샌드위치하여 3개의 황동나사(그림 2,패널 6-8)로 홀더 내에서 기계적으로 제자리에 고정된 밀봉된 인클로저를 형성합니다.
- 조립 후 홀더의 끝은 TEM 내부에 홀더를 배치하기 전에 터보 펌핑 건조 펌핑 스테이션을 사용하여10-6 Torr로 펌핑됩니다.
4. 전송 전자 현미경을 사용하여 액체에서 이미징
- LaB6 필라멘트가 장착된 전송 전자 현미경(FEI Company)에 시투 시편 홀더를 적재하고 120kV에서 작동합니다.
- TEM 필라멘트를 켜고 보블러 기능을 사용하여 시편과 관련하여 현미경 단계의 유중심 높이를 조정하여 컬럼에서 -15°에서 +15°로 샘플을 기울이고 있습니다. 이 절차는 액체 챔버의 적절한 두께를 설명하기 위해 z 방향으로 스테이지를 조정합니다. 또한 이 단계는 이미지를 기록할 때 정확한 배율이 사용되도록 합니다.
- 먼저 미세 유체 챔버의 가장자리와 모서리 영역에 이미지를 기록합니다. 이러한 영역에는 일반적으로 가장 얇은 솔루션이 포함됩니다. CCD 카메라를 사용하여 저용량 조건(1-3 전자/Å2)에서표본의 이미지를 기록합니다. 명목 배율을 6,000X - 30,000X로 사용하십시오.
- 유체 챔버의 가장자리에 초점을 맞추어 적절한 디포커스 값을 결정합니다. -1.5 μm값을 사용하여 30,000배율로 이미지를 기록합니다. 두꺼운 용액이 발생하거나 시편 제조에 조영제가 사용되지 않는 경우 -2 ~ -4 μm 범위에서 더 높은 디포커스 값을 사용합니다.
- 용액이 실험 전반에 걸쳐 미세 유체 챔버에 포함되도록 하기 위해 장치 내의 액체에 기포가 형성될 때까지 전자 빔에 초점을 맞춥니다.
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Representative Results
광분 방출된 E칩을 이용한 액체의 DlP의 대표적인이미지(그림 3A)는선호도 캡처 장치(그림3B)에농축된 DlP에 비해 확산으로 인한 특정 보기 영역에서 더 적은 DP를 보여준다. 이미징 챔버에 우라알 수감자를 첨가하면 시편의 대비를 향상시키고 따라서 용액에서 개별 DlP의가시성(도 3C,상단 패널). 더 나은 콘트라스트는 이전에 설명된17과같이 입자평균(도 3C,하단 패널) 및 3D 재구성 루틴(도3C,인셋)과 같은 다운스트림 이미지 처리를 가능하게 한다. 간단히, 3D 재구성을 위해 우리는 SPIDER 소프트웨어패키지(19)를사용하여 600개의 DP 입자를 선택했습니다. 선택된 입자는 80Å 해상도로 여과된 로타바이러스DLP(20)의 초기 모델에 대해 정제되었다. 우리는 RELION 소프트웨어 패키지(21)를 사용하여 약 25 Å의 해상도로 3D 재구성을 계산했습니다. 당사의 3D 맵은 초기 모델과 양호한 관계및 동일한 파라미터 및 DLP샘플(17)을사용하여 계산된 독립적인 cryo-EM 재구성과 함께 합니다.
그림 1. 액체 이미징을 위한 실리콘 진타체 마이크로칩을 준비합니다. A)실리콘 진타마이크로칩은 아세톤에서 2분 동안 침수한 후 메탄올에서 2분 간 침수하여 제조 공정에 사용되는 잔류 포토레지스트를 제거한다. B)지질 단층 샘플은 습한 페트리접시(17)에서파라필름에 첨가된 밀리-Q 물 방울에 제조된다. C)청소된 마이크로칩은 단층 의 상단에 놓고 1분 잠복 단계 후에 제거됩니다. D)분자 어댑터(즉, 단백질 A 및 항체용액)를 단층 코팅 칩에 직접 첨가하고 과량용액이 DP를 첨가하기 전에 제거된다. 젖은 시편 칩은 미세 유체 홀더에 로드됩니다.
그림 2. 미세 유체 표본 홀더의 액체 챔버를 조립합니다. 표본 챔버의 끝은 빈 팁 (단계 1-2)에 O 링 피팅을 추가하여 조립됩니다. 통합 스페이서가 들어 있는 습식 시편 칩은 홀더 의 끝(3-4단계) 내의 가공 된 피팅에 부드럽게 배치됩니다. 글로우 배출 플랫 칩은 시편 칩(5단계)의 상단에 배치됩니다. 조립은 3 개의 황동 나사 (단계 7-8)에 의해 제자리에 고정되는 금속 면판(6 단계)으로덮여있다.
그림 3. 액체의 DP에 대한 대표적인 결과. A)글로우 배출 마이크로칩은 친화성 으로 장식된 마이크로칩(B)과비교하여 용액에서 거의 DP를 결합합니다. 스케일 바, 2 μm. C)대조 시약을 포함하는 액체에서 DP의 대표적인 이미지 (상단 패널) 및 3D 재구성 (inset). 스케일 바, 150 nm. 재건의 직경은 80 nm입니다. 액체(하단 패널)의 DlP클래스 평균은 바깥쪽 표면을 따라 잘 정의된 특징을 드러냅니다. 개별 패널은 110 nm입니다.
그림 4. TEM에서 액체 표본의 기포 형성을 위한 대표적인 결과. 약2분(A)및 5분(B)에 대해 5전자/Å2에서 전자빔을 지속적으로 노출하면액체 시편에서 형성된 기포의 이미지. 스케일 바는 100nm입니다.
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Discussion
제시된 작업에서, 우리는 마이크로 유체 플랫폼에 밧줄 로타 바이러스 DLP에 친화성 캡처 접근 방식을 채택했다. 이것은 액체 미세 환경에서 매크로 분자 복합체의 시상 화상 진찰에서 허용했습니다. 포획 접근법은 다른 미세 유체 이미징 기술과 관련하여 중요한데, 이는 액체에서 이미지를 기록하는 동안 발생하는 큰 확산 문제를 부정하기 위해 이미징 창에 생물학적 표본을 국소화하기 때문입니다. 그러나, 우리의 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 마이크로 칩 표면에 지질 생물막의 전송을 포함한다. 지질 단층이 그리드 위로 고르게 퍼지지 못하면 결함이 있는 실험이 발생합니다. 가난한 전송 단계의 표시는 거의 또는 전혀 바이러스 성 어셈블리 는 유체 칩에 바인딩됩니다. 이송 단계의 한계는 지질 층의 유동성에 관한 열 안정성이다. 이송 단계가 부적절한 경우, 드롭의 고르지 않은 확산에 의해 평가, 지질 층은 더 이상 얼음또는 진동없는 차가운 방에서 인큐베이션해야합니다. 또한 페트리 접시는 적절한 습도를 유지하기 위해 파라필름으로 적절하게 밀봉되어야 합니다.
마이크로칩 샘플에서 바이러스 성 복합체 또는 어댑터 단백질을 초과하면 입자의 과도한 클러스터링으로 이어질 수 있습니다. 이는 쉽게 관리할 수 있는 프로토콜의 제한입니다. 군집 효과를 최소화하기 위해 단백질 인자는 짧은 기간 동안 배양될 수 있거나 바이러스 샘플을 더 희석시켜야 합니다. 과도한 비특이적 단백질이 검출되면 완충액에 갓 준비된 이미다졸(약 50mMM)을 포함하면 배경이 감소할 수 있다. 신선한 imidazole의 사용은 프로토콜에서 중요한 단계입니다. 마찬가지로, 정제 된 단백질칩을 과부하시키지 마십시오. 이미지는 과도한 배경 단백질을 포함하며 다운스트림 처리 루틴에 적합하지 않습니다. 정제 된 단백질에 대 한 최적의 농도 범위는 대략 0.01-0.1 mg/ml. 그러나, 이 범위가 예상되는 수준의 입자를 제공하지 않는 경우, 최적의 수준이 달성될 때까지 시료의 농도를 높여야 한다. 바이러스 성 입자의 농축은 항체와 같은 분자 어댑터가 부족한 부정적인 대조료에 대하여 이루어져야 합니다. 부정적인 제어에 소량의 비특이적 결합이 드물게 발생할 수 있지만 선호도로 장식된 마이크로칩은 항상 바이러스 입자를 풍부하게 하는 역할을 해야 합니다. 로타바이러스의 경우, 현재 Ni-NTA 장식 표면에 바이러스 복합체를 직접 포획하는 수단으로 그의 태그를 캡시드 단백질에 도입하는 역유전 시스템이 없습니다. 그러나 그의 태그가 붙은 리보솜은 액체 이미징 실험16을위해 Ni-NTA 장식 E 칩에 세균용 용액용액에서 성공적으로 모집되었습니다. 따라서 이 시점에서 제한적이기는 하지만, TEM 컬럼에 있는 동안 액체 세포에서 토착 생물학적 상호 작용이 발생하는 증거를 제공한다.
세제의 사용, 글리세롤과 자당의 높은 수준은 situ 이미징에서 피해야한다. 이러한 시약을 사용하면 EM 이미지에서 파티클의 과도한 버블링 및 음소거 된 피쳐가 포함된 아티팩트가 생성되어 품질이 저하됩니다. 이러한 시약이 바이러스 제제에 사용되는 경우 샘플은 이러한 구성 요소가 부족한 버퍼 솔루션으로 투석될 수 있습니다. 선호도 캡처 장치는 일정별로 결정해야 하지만 일정 기간 동안 어느 정도의 세제를 견딜 수 있습니다. 이전에 설명된 호환 시약목록(22)을참조하십시오.
다운스트림 이미지 처리 루틴을 활성화하기 위해 저농도의 콘트라스트 시약을 미세 유체 챔버에 추가할 수 있습니다. 이 시약은 전통적인 염색 절차(17)와같은 단백질 샘플을 수정하지 않습니다. 실험의 시간 과정 전반에 걸쳐 이미징 챔버에 액체가 존재하도록 하기 위해, 기포 형성이 발생할 때까지 전자 빔에 초점을 맞춥니다(도4). 이것은 표본이 수화된 남아 있음을 나타내는 간단한 측정값입니다. 액체 표본은 전자 빔을 연속 노출하는 2분(도4A)이내에 심각한손상을 발생합니다. 5분(도4B)에대한 장기간 연속 전자 빔 노출이 이 투여량에서 과도한 기포 형성을 초래할 것이다.
선호도 캡처 장치와 함께 사용되는 시투 분자 현미경 검사법은 전송 전자 현미경 을 사용하여 용액에서 생물학적 복합체의 검사를 허용합니다. 이러한 기술적 발전은 새로 개발된 미세 유체 표본 홀더의 사용에 의해 가능하게 됩니다. 이러한 장치는 얇은 실리콘 진타막을 사용하여 마이크로 스케일 이미징 챔버를 형성합니다. 파슨스와 동료의 선구적인 작업을 기반으로7-10 우리는 솔루션에 개별 바이러스 성 어셈블리를 이미지하는 유용한 전략을 제공합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 단일 입자 이미지 처리 루틴 및 3D 재구성 계산과 호환되는 방법론을 설명합니다. 이러한 기술을 습득함으로써 발생하는 향후 응용 프로그램에는 거대 분자의 라이브 EM 이미징이 포함될 수 있습니다. 우리는 시투 이미징에서 바이러스 성 조립, 전사 조절 또는 숙주 세포 침공을위한 단계를 공개 할 수 있다고 예상합니다. 요약하자면, 이러한 프로토콜을 사용하면 연구원이 완전히 새로운 방식으로 솔루션의 동적 프로세스를 조사할 수 있도록 해야 합니다.
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Disclosures
저자, 매들린 J. 듀크스, 프로토 칩스의 직원입니다, Inc.
Acknowledgments
저자는 우리의 연구 노력을 장려하기위한 버지니아 기술 캐릴리온 연구소의 이사 마이클 J. 프리들랜더 박사를 인정합니다. 이 프로젝트는 S.M.M 및 D.F.K.에 대한 개발 기금에 의해 지원되었으며 버지니아 공대의 중요 기술 및 응용 과학 연구소의 나노 바이오 이니셔티브에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-chips, spacer chip | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μm x 50 μm window |
| E-chip, top chip | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μm x 50 μm window |
| Ni-NTA lipid | Avanti Polar Lipids | 790404P | Powder form |
| DLPC (12:0) lipid | Avanti Polar Lipids | 850335P | Powder form |
| Volumetric flasks | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
| Hamilton Syringes | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μl; 1-25 μl |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Glass Petri dishes | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
| Glass culture tubes | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
| Chloroform | Electron Microcopy Sciences | 12550 | 100 ml |
| His-tagged Protein A | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
| Milli-Q water system | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Ultrapure Water |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
| Equipment | |||
| Poseidon In situ specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible | |
| FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
| Eagle 2k HS CCD camera | FEI Co. | 10 Å/pixel sampling at 30,000X | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Isotemp heated stir plate | Fisher Scientific | Heat to 150 ºC for 1.5 hr |
References
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