Summary
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Abbildung viraler Komplexe in Flüssigkeit in Nanometerauflösung mit einem Transmissionselektronenmikroskop.
Abstract
Die Forscher verwenden regelmäßig Transmission Electron Microscopes (TEMs), um biologische Einheiten zu untersuchen und neue Materialien zu bewerten. Hier beschreiben wir eine zusätzliche Anwendung für diese Instrumente - die Anzeige viraler Baugruppen in einer flüssigen Umgebung. Diese spannende und neuartige Methode zur Visualisierung biologischer Strukturen nutzt einen kürzlich entwickelten mikrofluidischen Probenhalter. Unser Videoartikel zeigt, wie man einen mikrofluidischen Halter zusammenbaut und verwendet, um flüssige Proben innerhalb eines TEM abzubilden. Insbesondere verwenden wir simian Rotavirus Doppelschichtpartikel (DLPs) als Modellsystem. Wir beschreiben auch Schritte, um die Oberfläche der Flüssigkeitskammer mit Affinitätsbiofilmen zu beschichten, die DLPs an das Sichtfenster ankleben. Dies ermöglicht es uns, Baugruppen so abzubilden, dass sie für die 3D-Strukturbestimmung geeignet sind. So präsentieren wir einen ersten Einblick in subvirale Partikel in einer nativen flüssigen Umgebung.
Introduction
Ein gemeinsames Ziel von Biologen und Ingenieuren ist es, das Innenleben molekularer Maschinen zu verstehen. Transmission Electron Microscopes (TEMs) sind ideale Instrumente, um diese komplizierten Details mit nahezu atomarer Auflösung1-2zu visualisieren. Um das Hochvakuumsystem eines TEM aufrecht zu erhalten, sind biologische Proben typischerweise in dünne Folien aus Glaseis3, Zucker4, Schwermetallsalze5oder eine Kombination davon6eingebettet. Daher können Bilder eingebetteter Proben nur begrenzte Momentaufnahmen dynamischer Prozesse zeigen.
Erste Versuche, biologische Proben in Flüssigkammern der Umwelt hydratisiert zu halten, wurden von Parsons und Kollegen mit Differentialpumpstufen unternommen. Elektronenbeugungsmuster von ungefärbten Kataalasekristallen wurden erfolgreich mit einer Auflösung von 3 ° in einem hydratisierten Zustand7-8aufgezeichnet. Darüber hinaus könnten phasengetrennte Lipiddomänen in hydratisierten Membranen menschlicher Erythrozyten9-10untersucht werden. Bewegungsstörungen durch das Ausstreuen von Flüssigkeit und deren Interferenz mit dem Elektronenstrahl führten jedoch zu einem starken Auflösungsverlust, und weitere Experimente mit biologischen Proben wurden erst vor kurzem versucht.
Neu entwickelte mikrofluidische Probenhalter wurden eingeführt, die Halbleiter-Mikrochips verwenden, um eine mikroskalierte Umweltkammer zu bilden. Diese Geräte können Proben in Flüssigkeit halten, während sie in einerTEM-Säule 11-12positioniert sind. Dieser technische Durchbruch in der TEM-Bildgebung hat es Forschern ermöglicht, zum ersten Mal progressive Ereignisse auf molekularer Ebene13zu sehen. Wir bezeichnen diese neue Modalität als"in situ molekulare Mikroskopie", da Experimente nun "innerhalb" derEM-Säule 14-15durchgeführt werden können. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, biologische Baugruppen in Flüssigkeit abzubilden, um ihr dynamisches Verhalten bei Nanometerauflösung zu beobachten. Der Grund gedanke hinter der entwickelten Technik ist es, Echtzeitbeobachtungen aufzuzeichnen und neue Eigenschaften biologischer Maschinen in Lösung zu untersuchen. Diese Methode erweitert die Verwendung von TEMs für breitere Zwecke in der Zell- und Molekularbiologie12-16.
Im aktuellen Videoartikel stellen wir ein umfassendes Protokoll zur Montage und Verwendung eines handelsüblichen mikrofluidischen Probenhalters vor. Diese spezialisierten Halter verwenden Siliziumnitrid-Mikrochips, die mit integrierten Abstandshaltern hergestellt werden, um eine flüssige Kammer zu bilden, die winzige Lösungsvolumina umschließt. Dünne, transparente Fenster werden zu Bildgebungszwecken in die Mikrochips eingeätzt12. Wir zeigen die ordnungsgemäße Verwendung eines mikrofluidischen Halters zur Untersuchung von simianrotavirus double-layered particles (DLPs) in Flüssigkeit mit einem TEM. Um sicherzustellen, dass biologische Baugruppen, wie z. B. DLPs, während der Bildgebung nicht schnell über große Entfernungen diffundieren, verwenden wir den Affinity Capture-Ansatz, um sie an die Oberfläche der mikrofluidischen Kammer16zu fesseln. Dieser molekulare Erfassungsschritt hat einen großen Vorteil gegenüber alternativen Verfahren zur Abbildung biologischer Proben in Flüssigkeit, da er die Erfassung von Bildern ermöglicht, die für nachgelagerte Verarbeitungsroutinen verwendet werden. Dieser Erfassungsschritt in Verbindung mit mikrofluidischer Bildgebung ist einzigartig in unseren Verfahren17. Leser, die strukturbiologische Anwendungen mit TEM oder mikrofluidischen Bildgebungskammern verwenden, können den Einsatz von Affinitätserfassungstechniken in Betracht ziehen, wenn dynamische Beobachtungen auf molekularer Ebene das Endziel sind.
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Protocol
1. Vorbereiten von Affinity Capture-Geräten16
- Reinigen Sie die Siliziumnitrid-E-Chips, indem Sie sie in 15 ml Aceton für 2 min, gefolgt von 15 ml Methanol für 2 min(Abbildung 1A). Lassen Sie Diesunter laminarem Luftstrom trocknen.
- Die getrockneten Späne auf einer erhitzten Rührplatte (ohne Rühren) 1,5 Stunden bei 150 °C inkubieren und vor Gebrauch auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
- Verwenden Sie Hamilton-Spritzen, um Lipidmischungen in kleinen Glasröhren zu komponieren, die 25% Chloroform, 55% DLPC (1,2-Dilauroyl-Phosphocholin) in Chloroform (1 mg/ml) und 20% Ni-NTA-Lipid (1,2-Dioleoyl-Iminodiessigsäure-Succinyl-Nickel-Salz) in Chloroform (1 mg/ml) für ein Gesamtvolumen von 40 l enthalten.
- Tragen Sie einen 1 l Aliquot des Gemischs über jeden 15-l-Tropfen Milli-Q-Wasser auf ein Stück Parafilm in einer feuchten Petrischale auf (Abbildung 1B). Proben mindestens 60 min auf Eis inkubieren.
2. Erfassen von Makromolekülen17
- Legen Sie einen E-Chip mit einem 150 nm integrierten Abstandsraum auf eine Monolayer-Probe und inkubieren Sie 1 min(Abbildung 1C).
- Heben Sie den Chip vorsichtig von der Probe ab und fügen Sie ein 3-l-Aliquot von Seinem mit Tags versehenen Protein A hinzu. Inkubieren Sie 1 min bei Raumtemperatur(Abbildung 1D).
- Den überschüssigen Tropfen mit Whatman #1 Filterpapier wegblasen und sofort eine 3-l-Aliquot-Antikörperlösung hinzufügen. 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Entfernen Sie die überschüssige Lösung mit einer Hamilton-Spritze und fügen Sie sofort eine 1 l Aliquot von Rotavirus-DLPs (0,1 mg/ml) in Pufferlösung mit 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 und 10 mM CaCl2hinzu. Mindestens 2 min bei Raumtemperatur inkubieren. Die Vorbereitung von DLPs wurde bereits beschrieben18.
3. Montieren Sie die Mikrofluidische Kammer und laden Sie den In-situ-Probenhalter
- Laden Sie den nassen E-Chip mit der Virusprobe in die Spitze des mikrofluidischen Probenhalters. Glühen-Entladung eines zweiten flachen E-Chips für 1 min und dann auf den Abstandschip geladen(Abbildung 2, Panels 1-5).
- Alternativ kann der Kontrast biologischer Makromoleküle erhöht werden, schwermetallstain(z.B. 0,2% Uranylformat) zu nassen Proben hinzugefügt werden, bevor der zweite E-Chip auf die nasse Probe gesetzt wird. Der E-Chip, der die Probe enthält, muss jedoch vor zugabe des Kontrastreagenzes mit Milli-Q-Wasser gewaschen werden.
- Die gesamte Baugruppe zu einem versiegelten Gehäuse verschließen, das mechanisch innerhalb des Halters durch 3 Messingschrauben gehalten wird(Abbildung 2,Platten 6-8).
- Nach der Montage wird die Spitze des Halters mit einer turbogepumpten Trockenpumpstation auf 10-6 Torr gepumpt, bevor der Halter im TEM platziert wird.
4. Bildgebung in Flüssigkeit mit einem Transmissionselektronenmikroskop
- Laden Sie den In-situ-Probenhalter in ein Transmission Electron Microscope (FEI Company), das mit einem LaB6-Filament ausgestattet ist und mit 120 kV arbeitet.
- Schalten Sie das TEM-Filament ein und passen Sie die euzentrische Höhe der Mikroskopstufe in Bezug auf die Probe an, indem Sie die Wobblerfunktion verwenden, um die Probe in der Säule von -15° bis +15° hin und her zu neigen. Dieses Verfahren passt die Stufe in z-Richtung an, um die richtige Dicke der Flüssigkeitskammer zu berücksichtigen. Dieser Schritt stellt auch sicher, dass eine genaue Vergrößerung bei der Aufnahme von Bildern verwendet wird.
- Zeichnen Sie zuerst Bilder entlang der Ränder und in den Eckbereichen der mikrofluidischen Kammer auf. Diese Bereiche enthalten in der Regel die dünnste Lösung. Zeichnen Sie Bilder von Proben unter niedrig dosierten Bedingungen(1-3 Elektronen/2 ) mit einer CCD-Kamera auf. Verwenden Sie nenne Vergrößerungen von 6.000X - 30.000X.
- Bestimmen Sie den richtigen Defokuswert, indem Sie sich am Rand der Fluidkammer fokussieren. Verwenden Sie einen Wert von -1,5 m, um Bilder mit einer Vergrößerung von 30.000 X aufzuzeichnen. Wenn eine dicke Lösung gefunden wird oder wenn in der Probenvorbereitung kein Kontrastmittel verwendet wird, verwenden Sie höhere Defokuswerte im Bereich von -2 bis -4 m.
- Um sicherzustellen, dass die Lösung während der Experimente in der mikrofluidischen Kammer enthalten ist, fokussieren Sie den Elektronenstrahl, bis sich die Blasen in der Flüssigkeit innerhalb des Geräts bilden.
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Representative Results
Repräsentative Bilder von DLPs in Flüssigkeit mit E-Chips, die glühend entladen wurden (Abbildung 3A) zeigen weniger DLPs in einem bestimmten Betrachtungsbereich, vermutlich aufgrund der Diffusion, im Vergleich zu DLPs, die auf Affinity Capture-Geräten angereichert sind (Abbildung 3B). Die Zugabe von Uranylformat in der Bildkammer erhöht den Kontrast der Probe und damit die Sichtbarkeit einzelner DLPs in Lösung(Abbildung 3C, oberes Panel). Ein besserer Kontrast ermöglicht die nachgeschaltete Bildverarbeitung wie Partikelmittelung(Abbildung 3C, Bodenplatte) und 3D-Rekonstruktionsroutinen(Abbildung 3C, Inset) wie zuvor beschrieben17. Kurz gesagt, für die 3D-Rekonstruktion haben wir 600 Partikel von DLPs mit dem SPIDER Softwarepaket19ausgewählt. Ausgewählte Partikel wurden gegen ein erstes Modell des Rotavirus DLP20 verfeinert, das auf eine Auflösung von 80 °C gefiltert wurde. Wir haben das RELION-Softwarepaket21 verwendet, um eine 3D-Rekonstruktion mit einer Auflösung von ca. 25 ° zu berechnen. Unsere 3D-Karte in Übereinstimmung mit dem ursprünglichen Modell und mit einer unabhängigen Kryo-EM-Rekonstruktion, die mit den gleichen Parametern und DLP-Beispiel17berechnet wurde.
Abbildung 1. Vorbereitung von Siliziumnitrid-Mikrochips für die flüssige Bildgebung. A) Siliziumnitrid-Mikrochips werden durch 2 min Aceton- und 2 min Methanol durch Tauchen gereinigt, um den bei der Herstellung verwendeten Restphotowiderstand zu entfernen. B) Lipid-Monolayer-Proben werden auf Tropfen Milli-Q-Wasser hergestellt, die Parafilm in einer feuchten Petrischale zugesetzt werden17. C) Gereinigte Mikrochips werden auf die Monolayer gelegt und nach einem 1 min Inkubationsschritt entfernt. D) Molekulare Adapter(d.h. Protein A und Antikörper in Lösung) werden direkt zu den monolayerbeschichteten Chips hinzugefügt und die überschüssige Lösung vor zugabe von DLPs entfernt. Der nasse Probenchip wird dann in den mikrofluidischen Halter geladen.
Abbildung 2. Montage der Flüssigkeitskammer eines mikrofluidischen Probenhalters. Die Spitze der Probenkammer wird durch Zugabe von O-Ring-Fittings an der leeren Spitze (Schritte 1-2) montiert. Der nasse Probenchip mit integrierten Abstandshaltern wird innerhalb der Halterspitze (Schritte 3-4) schonend in die bearbeiteten Armaturen gelegt. Ein glühend entladener Flachchip wird über dem Probenchip (Schritt 5) platziert. Die Baugruppe wird dann mit einer Metall-Frontplatte (Schritt 6) abgedeckt, die von 3 Messingschrauben (Schritte 7-8) gehalten wird.
Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse für DLPs in flüssig. A) Glow-discharged microchips binden sehr wenige DLPs in Lösung im Vergleich zu affinitätsverzierten Mikrochips (B). Skalenbalken, 2 m. C) Repräsentatives Bild (oberes Panel) und 3D-Rekonstruktion (Einset) von DLPs in flüssigkeitshaltigem Kontrastreagenz. Schuppenstange, 150 nm. Der Durchmesser der Rekonstruktion beträgt 80 nm. Klassendurchschnitte der DLPs in Flüssigkeit (unteres Panel) zeigen gut definierte Merkmale entlang ihrer außen sosten Oberfläche. Einzelne Paneele sind 110 nm.
Abbildung 4. Repräsentative Ergebnisse für die Blasenbildung in flüssigen Proben im TEM. Bilder von Blasen, die in flüssigen Proben bei kontinuierlicher Exposition des Elektronenstrahls bei 5 Elektronen/2 für ca. 2 min (A) und 5 min (B) gebildet wurden. Die Maßstabsleiste beträgt 100 nm.
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Discussion
In unserer vorgestellten Arbeit haben wir den Affinitätserfassungsansatz verwendet, um dlPs mit Rotavirus auf eine mikrofluidische Plattform zu bringen. Dies ermöglichte die In-situ-Bildgebung makromolekularer Komplexe in einer flüssigen Mikroumgebung. Der Erfassungsansatz ist im Vergleich zu anderen mikrofluidischen Bildgebungsverfahren von Bedeutung, da er biologische Proben in das Bildgebungsfenster lokalisiert, um große diffusive Probleme zu negieren, die bei der Aufnahme von Bildern in Flüssigkeit auftreten. Einer der kritischsten Schritte in unserem Protokoll ist jedoch die Übertragung des Lipid-Biofilms auf die Mikrochip-Oberfläche. Sollte sich die Lipidmonoschicht nicht gleichmäßig über das Gitter ausbreiten, führt dies zu einem fehlerhaften Experiment. Ein Hinweis auf einen schlechten Übertragungsschritt ist, dass wenig bis keine viralen Baugruppen an den Fluidchip gebunden werden. Eine Einschränkung im Übertragungsschritt ist die thermische Stabilität in Bezug auf die Fließfähigkeit der Lipidschicht. Ist der Transferschritt unzureichend, wie durch eine ungleichmäßige Ausbreitung des Tropfens beurteilt, sollten die Lipidschichten länger auf Eis oder in einem vibrationsfreien Kühlraum brüten. Außerdem muss die Petrischale ausreichend mit Parafilm versiegelt werden, um die richtige Feuchtigkeit zu erhalten.
Ein Überschuss an viralen Komplexen oder Adapterproteinen in den Mikrochipproben kann zu einer übermäßigen Clusterbildung der Partikel führen. Dies ist eine Einschränkung im Protokoll, die leicht verwaltet werden kann. Um den Clustering-Effekt zu minimieren, können die Proteinfaktoren für einen kürzeren Zeitraum inkubiert oder die Virusprobe weiter verdünnt werden. Wenn ein Überschuss an unspezifischen Proteinen nachgewiesen wird, kann die Aufnahme von frisch zubereitetem Imidazol (ca. 50 mM) in die Pufferlösung den Hintergrund verringern. Die Verwendung von frischem Imidazol ist ein entscheidender Schritt im Protokoll. Ebenso nicht überladen die Chips mit gereinigten Proteinen, da dies nicht bestimmte Bindung gewährleisten und in einem fehlerhaften Experiment führen wird. Bilder enthalten einen Überschuss an Hintergrundproteinen und sind nicht für nachgelagerte Verarbeitungsroutinen geeignet. Ein optimaler Konzentrationsbereich für gereinigte Proteine liegt bei etwa 0,01-0,1 mg/ml. Wenn dieser Bereich jedoch nicht den erwarteten Partikelgehalt liefert, sollte die Konzentration der Probe erhöht werden, bis ein optimaler Wert erreicht ist. Eine Anreicherung von Viruspartikeln sollte in Bezug auf Negativkontrollproben auftreten, denen molekulare Adapter fehlen, wie Antikörper. Kleine Mengen unspezifischer Bindung in Ihrer Negativkontrolle können selten auftreten, aber die affinitätsverzierten Mikrochips sollten immer dazu dienen, die viralen Partikel anzureichern. Im Falle des Rotavirus gibt es derzeit kein umgekehrtes genetisches System, um seine Tags in Kapsidproteine einzuführen, um virale Komplexe direkt auf Ni-NTA-dekorierten Oberflächen zu erfassen. Seine mit Tags versehenen Ribosomen wurden jedoch erfolgreich aus bakteriellen Lysaten auf Ni-NTA-verzierte E-Chips für flüssige Bildgebungsexperimente rekrutiert16. Somit liefert die Sevidenz, wenn auch begrenzt zu diesem Zeitpunkt, für native biologische Wechselwirkungen in flüssigen Zellen auftreten, während in einer TEM-Säule.
Die Verwendung von Reinigungsmitteln, Glycerin und hohen Saccharosegehalten muss für die In-situ-Bildgebung vermieden werden. Die Verwendung dieser Reagenzien erzeugt Artefakte in EM-Bildern, die übermäßige sprudelnde und gedämpfte Features in Partikeln enthalten, was zu bildern schlechter Qualität führt. Wenn diese Reagenzien in Viruspräparaten verwendet werden, kann die Probe in Pufferlösung ohne diese Komponenten dialyziert werden. Affinity Capture-Geräte können für einen kurzen Zeitraum einem gewissen Grad an Reinigungsmitteln standhalten, obwohl dies von Fall zu Fall festgelegt werden muss. Bitte beachten Sie die Liste der kompatiblen Reagenzien, die zuvor beschrieben sind22.
Um nachgeschaltete Bildverarbeitungsroutinen zu ermöglichen, kann der mikrofluidischen Kammer eine geringe Konzentration an Kontrastreagenz zugesetzt werden. Dieses Reagenz fixiert keine Proteinproben, wie herkömmliche Färbeverfahren17. Um sicherzustellen, dass während des gesamten Versuchsverlaufs Flüssigkeit in der Bildkammer vorhanden ist, konzentrieren Sie den Elektronenstrahl, bis Blasenbildung auftritt (Abbildung 4). Dies ist eine einfache Maßnahme, um anzuzeigen, dass die Proben hydratisiert bleiben. Flüssige Proben stoßen innerhalb von 2 min (Abbildung 4A) auf schwere Schäden durch kontinuierliche Belichtung des Elektronenstrahls bei 5 Elektronen/2. Längere kontinuierliche Elektronenstrahl-Exposition für 5 min(Abbildung 4B) und darüber hinaus bei dieser Dosierung führt zu einer übermäßigen Blasenbildung im Bildgebungsbereich.
Die in situ-Molekularmikroskopie in Kombination mit Affinity Capture-Geräten ermöglicht die Untersuchung biologischer Komplexe in Lösung mittels Transmissionselektronenmikroskopie. Diese technischen Fortschritte werden durch den Einsatz neu entwickelter mikrofluidischer Probenhalter ermöglicht. Solche Geräte verwenden dünne Siliziumnitridmembranen, um eine mikroskalierte Bildgebungskammer zu bilden. Aufbauend auf der Pionierarbeit von Parsons und Kollegen7-10 bieten wir eine nützliche Strategie, um einzelne virale Assemblys in Lösung abzubilden. Das hier beschriebene Protokoll erläutert Methoden, die mit Einzelpartikelbildverarbeitungsroutinen und 3D-Rekonstruktionsberechnungen kompatibel sind. Zukünftige Anwendungen, die sich aus der Beherrschung dieser Techniken ergeben werden, können die Live-EM-Bildgebung von Makromolekülen umfassen. Wir gehen davon aus, dass die In-situ-Bildgebung Schritte für die virale Montage, Transkriptionsregulierung oder Die Invasion von Gastzellen aufdecken kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verwendung dieser Protokolle es den Forschern ermöglichen sollte, dynamische Prozesse in Lösung auf völlig neue Weise zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autorin, Madeline J. Dukes, ist Mitarbeiterin von Protochips, Inc.
Acknowledgments
Die Autoren würdigen Dr. Michael J. Friedlander, Direktor des Virginia Tech Carilion Research Institute für die Förderung unserer Forschungsbemühungen. Dieses Projekt wurde durch Entwicklungsgelder an S.M.M und D.F.K. und teilweise durch die Nano-Bio-Initiative des Institute for Critical Technology and Applied Science bei Virginia Tech unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-chips, spacer chip | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μm x 50 μm window |
| E-chip, top chip | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μm x 50 μm window |
| Ni-NTA lipid | Avanti Polar Lipids | 790404P | Powder form |
| DLPC (12:0) lipid | Avanti Polar Lipids | 850335P | Powder form |
| Volumetric flasks | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
| Hamilton Syringes | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μl; 1-25 μl |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Glass Petri dishes | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
| Glass culture tubes | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
| Chloroform | Electron Microcopy Sciences | 12550 | 100 ml |
| His-tagged Protein A | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
| Milli-Q water system | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Ultrapure Water |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
| Equipment | |||
| Poseidon In situ specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible | |
| FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
| Eagle 2k HS CCD camera | FEI Co. | 10 Å/pixel sampling at 30,000X | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Isotemp heated stir plate | Fisher Scientific | Heat to 150 ºC for 1.5 hr |
References
- Zhou, Z. H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).
- Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C.
- Dubochet, J., et al.
- Unwin, P. N., Henderson, R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
- Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R.
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186, 407-414 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects. Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184, 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).
- Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
- Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
- Peckys, D. B., de Jonge, N. Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).
- Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. J. Microsc. 242, 117-123 (2011).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).
- Gilmore, B. L., et al. Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere. Lab Chip. 13, 216-219 (2013).
- Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. Purification and characterization of bovine rotavirus cores. J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).
- Frank, J., et al. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).
- Zhang, X., et al. Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).
- Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).
- Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification. J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).
