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Bioengineering

सीटू में तरल में जैविक विधानसभाओं के TEM

Published: December 30, 2013 doi: 10.3791/50936
Automatic Translation
*1, *2, *2, 2, 2
1Applications Science, Protochips, Inc., 2Virginia Tech Carilion Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके नैनोमीटर रिज़ॉल्यूशन पर तरल में वायरल कॉम्प्लेक्स को इमेज करने की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं।

Abstract

शोधकर्ता जैविक संस्थाओं की जांच करने और नई सामग्रियों का आकलन करने के लिए नियमित रूप से ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (TEMs) का उपयोग करते हैं । यहां, हम इन उपकरणों के लिए एक अतिरिक्त आवेदन का वर्णन-एक तरल वातावरण में वायरल विधानसभाओं को देखने । जैविक संरचनाओं की कल्पना करने की यह रोमांचक और उपन्यास विधि हाल ही में विकसित माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित नमूना धारक का उपयोग करती है। हमारा वीडियो लेख दर्शाता है कि कैसे एक TEM के भीतर तरल नमूनों की छवि के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक धारक को इकट्ठा और उपयोग करना है। विशेष रूप से, हम अपने मॉडल सिस्टम के रूप में सिमियन रोटावायरस डबल-लेयर्ड कणों (डीएलसीपी) का उपयोग करते हैं। हम एफिनिटी बायोफिल्म्स के साथ तरल कक्ष की सतह को कोट करने के चरणों का भी वर्णन करते हैं जो डीबीपीएस को देखने वाली खिड़की पर सीमित करते हैं। यह हमें इस तरीके से विधानसभाओं की छवि बनाने की अनुमति देता है जो 3डी संरचना निर्धारण के लिए उपयुक्त है। इस प्रकार, हम एक देशी तरल वातावरण में उपवायरल कणों की पहली झलक पेश करते हैं।

Introduction

जीव विज्ञानियों और इंजीनियरों का एक आम लक्ष्य आणविक मशीनों के आंतरिक कामकाज को समझना है। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (TEMs) के पास परमाणु संकल्प1-2पर इन जटिल विवरणों की कल्पना करने के लिए आदर्श उपकरण हैं । टेम की उच्च वैक्यूम प्रणाली को बनाए रखने के लिए, जैविक नमूने आमतौर पर विट्रियस आइस3,शर्करा4,भारी धातु लवण5,याउसकेकुछ संयोजन की पतली फिल्मों में एम्बेडेड होते हैं। नतीजतन, एम्बेडेड नमूनों की छवियां गतिशील प्रक्रियाओं के केवल सीमित स्नैपशॉट प्रकट कर सकती हैं।

पर्यावरणीय तरल कक्षों में हाइड्रेटेड जैविक नमूनों को बनाए रखने के प्रारंभिक प्रयास पार्संस और सहयोगियों द्वारा अंतर पंपिंग चरणों का उपयोग करके किए गए थे। अन दागदार कैटालैस क्रिस्टल के इलेक्ट्रॉन विवर्तन पैटर्न को सफलतापूर्वक हाइड्रेटेड राज्य7-8में 3 Å के संकल्प में दर्ज किया गया था। इसके अलावा, मानव एरिथ्रोसाइट्स9-10के हाइड्रेटेड झिल्ली में चरण-अलग लिपिड डोमेन की जांच की जा सकती है। हालांकि, तरल और इलेक्ट्रॉन बीम के साथ इसके हस्तक्षेप को फैलाने के कारण गति, गंभीर संकल्प हानि के परिणामस्वरूप और जैविक नमूनों का उपयोग करके आगे के प्रयोगों का हाल तक प्रयास नहीं किया गया था।

नव विकसित माइक्रोफ्लुइडिक नमूना धारकों को पेश किया गया है जो माइक्रो-स्केल पर्यावरण कक्ष बनाने के लिए सेमीकंडक्टर माइक्रोचिप्स का उपयोग करते हैं। ये उपकरण तरल में नमूनों को बनाए रख सकते हैं, जबकि वे एक TEM कॉलम11-12में तैनात हैं । TEM इमेजिंग में इस तकनीकी सफलता शोधकर्ताओं को देखने के लिए, पहली बार, आणविक स्तर13पर प्रगतिशील घटनाओं की अनुमति दी गई है । हम इस नए तौर-तरीके को'सीटू आणविक माइक्रोस्कोपी में' के रूप में संदर्भित करते हैं क्योंकि प्रयोग अब ईएम कॉलम14-15के "अंदर" किए जा सकते हैं। इस विधि का समग्र लक्ष्य नैनोमीटर संकल्प पर उनके गतिशील व्यवहार का निरीक्षण करने के लिए तरल में जैविक विधानसभाओं की छवि बनाना है। विकसित तकनीक के पीछे तर्क वास्तविक समय टिप्पणियों को रिकॉर्ड करना और समाधान में जैविक मशीनरी के नए गुणों की जांच करना है। यह पद्धति सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान12-16में व्यापक उद्देश्यों के लिए TEMs के उपयोग का विस्तार करती है ।

वर्तमान वीडियो लेख में, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोफ्लुइडिक नमूना धारक को इकट्ठा करने और उपयोग करने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। ये विशेष धारक एकीकृत स्पेसर्स के साथ उत्पादित सिलिकॉन नाइट्राइड माइक्रोचिप्स का उपयोग एक तरल कक्ष बनाने के लिए करते हैं जो समाधान की मिनट की मात्रा को संलग्न करता है। पतली, पारदर्शी खिड़कियां इमेजिंग उद्देश्यों के लिए माइक्रोचिप्स में नक़्क़ाशीदार हैं12। हम एक TEM का उपयोग कर तरल में सिमियन रोटावायरस डबल स्तरित कणों (DLPs) की जांच करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक धारक के उचित उपयोग का प्रदर्शन करते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि डीएलसीपी जैसी जैविक असेंबली, इमेजिंग करते समय बड़ी दूरी पर तेजी से फैलाना नहीं है, हम उन्हें माइक्रोफ्लुइडिक चैंबर16की सतह पर सीमित करने के लिए आत्मीयता कैप्चर दृष्टिकोण को नियोजित करते हैं। इस आणविक कैप्चर चरण को तरल में जैविक नमूनों की इमेजिंग के लिए वैकल्पिक तकनीकों पर एक बड़ा लाभ है क्योंकि यह उन छवियों के अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है जिनका उपयोग डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण दिनचर्या के लिए किया जाएगा। माइक्रोफ्लुइडिक इमेजिंग के साथ मिलकर इस्तेमाल किया जाने वाला यह कैप्चर स्टेप हमारी प्रक्रियाओं के लिए अद्वितीय है17. TEM या microfluidic इमेजिंग कक्षों का उपयोग कर संरचनात्मक जीव विज्ञान अनुप्रयोगों को रोजगार पाठकों आत्मीयता पर कब्जा तकनीकों के उपयोग पर विचार कर सकते है जब आणविक स्तर पर गतिशील टिप्पणियों अंत लक्ष्य हैं ।

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Protocol

1. एफ़िनिटी कैप्चर डिवाइस तैयार करें16

  1. सिलिकॉन नाइट्राइड ई-चिप्स को 2 मिनट के लिए 15 मिलीलीटर एसीटोन में इनक्यूबेटिंग करके साफ करें और इसके बाद 2 मिनट(चित्रा 1 ए)के लिए 15 मिलीलीटर मेथनॉल । लैमिनार हवा के प्रवाह के तहत चिप्स को सूखने दें।
  2. सूखे चिप्स को 150 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए गर्म हलचल प्लेट (सरगर्मी के बिना) पर इनक्यूबेट करें, फिर उन्हें उपयोग से पहले कमरे के तापमान को ठंडा करने की अनुमति दें।
  3. 25% क्लोरोफॉर्म को नियंत्रित करने के लिए छोटे ग्लास ट्यूबों में लिपिड मिश्रण रचना करने के लिए हैमिल्टन सीरिंज का उपयोग करें, क्लोरोफॉर्म (1 मिलीग्राम/मिलीलीटर) में 55% डीएलपीसी (1,2-डिलौरॉयल-फॉस्फोकोलिन) और 20% नी-एनटीए लिपिड (1,2-डाइलियोल-इमिनोमोडियाटिक एसिड-स्व्यूसिल-निकल नमक) क्लोरोफॉर्म (1 मिलीग्राम/एमएल) की कुल मात्रा के लिए 40 μl की कुल मात्रा के लिए।
  4. एक आर्द्र पेट्री डिश(चित्रा 1B)में पैराफिल्म के एक टुकड़े पर मिल्ली-क्यू पानी की प्रत्येक 15 माइक्रोन बूंद पर मिश्रण का 1 μl aliquot लागू करें। कम से कम 60 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने इनक्यूबेट।

2. मैक्रोमॉलिक्यूल्स पर कब्जा17

  1. एक मोनोलेयर नमूने के शीर्ष पर 150 एनएम एकीकृत स्पेसर के साथ एक ई-चिप रखें और 1 मिनट(चित्रा 1C)के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. धीरे से नमूना के चिप लिफ्ट और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए अपने टैग प्रोटीन ए Incubate के एक 3 μl aliquot जोड़ें(चित्रा 1D)।
  3. Whatman का उपयोग करके अतिरिक्त बूंद को दूर #1 फिल्टर पेपर और तुरंत एंटीबॉडी समाधान का 3 माइक्रोल एलिकोट जोड़ें। कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  4. हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग करके अतिरिक्त समाधान निकालें और तुरंत बफर समाधान में रोटावायरस डील्प (0.1 मिलीग्राम/मिलीलीटर) का 1 माइक्रोल एलिकोट जोड़ें जिसमें 50 एमएल एचईपी (पीएच 7.5), 150 एमएमएम एनएसीएल, 10 एमएम एमजीसीएल2 और 10 एमएमएम सीएसीएल2शामिल हैं। कमरे के तापमान पर कम से कम 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट। डीलडीपीओ की तैयारी पहले18बताई गईहै .

3. माइक्रोफ्लुइडिक चैंबर को इकट्ठा करें और सीटू नमूना धारक में लोड करें

  1. माइक्रोफ्लुइडिक नमूना धारक की नोक में वायरल नमूने युक्त गीला ई-चिप लोड करें। ग्लो-डिस्चार्ज 1 मिनट के लिए एक दूसरे फ्लैट ई-चिप तो स्पेसर चिप(चित्रा 2, पैनल 1-5) के शीर्ष पर लोड किया ।
  2. वैकल्पिक रूप से, जैविक मैक्रोमॉलिक्यूल्स के विपरीत को बढ़ाने के लिए, भारी धातु दाग(उदाहरण के लिए 0.2% यूरेरियल फोरमेट) गीले नमूनों पर दूसरी ई-चिप रखने से पहले गीले नमूनों में जोड़ा जा सकता है। हालांकि, नमूना युक्त ई-चिप को कंट्रास्ट रिएजेंट जोड़ने से पहले मिल्ली-क्यू पानी से धोया जाना चाहिए ।
  3. सैंडविच पूरी विधानसभा एक साथ एक सील बाड़े बनाने के लिए, जगह में यंत्रवत् 3 पीतल शिकंजा(चित्रा 2,पैनल 6-8) द्वारा धारक के भीतर आयोजित किया ।
  4. विधानसभा के बाद, धारक की नोक TEM के अंदर धारक रखने से पहले एक टर्बो पंप सूखी पंपिंग स्टेशन का उपयोग कर10-6 टोरर के लिए पंप है ।

4. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके तरल में इमेजिंग

  1. एक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (FEI कंपनी) में सीटू नमूना धारक लोड एक LaB6 फिलामेंट से लैस है और १२० केवी पर काम कर रहे ।
  2. टेम फिलामेंट चालू करें और कॉलम में -15 डिग्री से +15 डिग्री तक नमूने को झुकाने के लिए डस्टर फ़ंक्शन का उपयोग करके नमूने के संबंध में माइक्रोस्कोप चरण की यूसेंट्रिक ऊंचाई को समायोजित करें। यह प्रक्रिया तरल कक्ष की उचित मोटाई के लिए खाते में मदद करने के लिए जेड-दिशा में चरण को समायोजित करती है। यह चरण यह भी सुनिश्चित करता है कि छवियों को रिकॉर्ड करते समय सटीक आवर्धन का उपयोग किया जाता है।
  3. किनारों के साथ और माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष के कोने क्षेत्रों में पहले रिकॉर्ड छवियों। इन क्षेत्रों में आम तौर पर सबसे पतला समाधान होता है। कम खुराक की स्थिति के तहत नमूनों की छवियों रिकॉर्ड (1-3 इलेक्ट्रॉनों/Å2)एक सीसीडी कैमरे का उपयोग कर । 6,000X - 30,000X के नाममात्र आवर्धन का उपयोग करें।
  4. तरल कक्ष के किनारे पर ध्यान केंद्रित करके उचित डेफोकस मूल्य निर्धारित करें। 30,000X आवर्धन पर छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए -1.5 माइक्रोन के मूल्य का उपयोग करें। यदि मोटी समाधान का सामना करना पड़ता है या यदि नमूना तैयारी में कंट्रास्ट एजेंट का उपयोग नहीं किया जाता है, तो -2 से -4 माइक्रोन की सीमा में उच्च डेफोकस मूल्यों का उपयोग करें।
  5. यह सुनिश्चित करने के लिए कि पूरे प्रयोगों में माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष में समाधान निहित है, इलेक्ट्रॉन बीम को तब तक केंद्रित करें जब तक कि डिवाइस के भीतर तरल में बुलबुले न बन जाएं।

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Representative Results

ई-चिप्स का उपयोग करके तरल में डीलबीपीएस की प्रतिनिधि छवियां जो चमक-निर्वहन(चित्रा 3 ए)किसी दिए गए देखने के क्षेत्र में कम डीलप्स दिखाती हैं, संभवतः प्रसार के कारण, डीलिप की तुलना में जो आत्मीयता कैप्चर उपकरणों(चित्रा 3B)पर समृद्ध हैं। इमेजिंग कक्ष में यूरेरियल फोरमेट के अलावा नमूने के विपरीत को बढ़ाता है और इसलिए समाधान में व्यक्तिगत डीलिप की दृश्यता(चित्रा 3C,शीर्ष पैनल)। बेहतर कंट्रास्ट डाउनस्ट्रीम इमेज प्रोसेसिंग जैसे पार्टिकल औसत(चित्र 3सी,बॉटम पैनल) और 3डी पुनर्निर्माण दिनचर्या(चित्रा 3 सी,इनसेट) के रूप में पहले वर्णित17की अनुमति देता है । संक्षेप में, 3 डी पुनर्निर्माण के लिए हमने स्पाइडर सॉफ्टवेयर पैकेज19का उपयोग करके डीएलपीएस के 600 कणों का चयन किया। चयनित कणों रोटावायरस डीएलपी20 के एक प्रारंभिक मॉडल के खिलाफ परिष्कृत किया गया था कि ८० Å संकल्प को फ़िल्टर किया गया था । हमने लगभग25 Å के संकल्प पर 3 डी पुनर्निर्माण की गणना करने के लिए RELION सॉफ्टवेयर पैकेज 21 का उपयोग किया। प्रारंभिक मॉडल के साथ और एक स्वतंत्र क्रायो-ईएम पुनर्निर्माण के साथ हमारे 3 डी मानचित्र की गणना एक ही पैरामीटर और डीएलपी नमूना17का उपयोग करके की गई थी।

Figure 1
चित्रा 1. तरल इमेजिंग के लिए सिलिकॉन नाइट्राइड माइक्रोचिप्स तैयार करना। A)सिलिकॉन नाइट्राइड माइक्रोचिप्स को एसीटोन में 2 मिनट के लिए जलमग्न करके साफ किया जाता है और इसके बाद निर्माण प्रक्रिया में इस्तेमाल अवशिष्ट फोटोरेसिस्ट को हटाने के लिए मेथनॉल में 2 मिनट का समय होता है । B) लिपिड मोनोलेयर नमूने एक आर्द्र पेट्री डिश17में पैराफिल्म में जोड़े गए मिल्ली-क्यू पानी की बूंदों पर तैयार किए जाते हैं । C)साफ माइक्रोचिप्स मोनोलेयर्स के ऊपर रखा जाता है और एक मिनट इनक्यूबेशन कदम के बाद हटा दिया जाता है । घ)आणविक एडाप्टर(यानी प्रोटीन ए और समाधान में एंटीबॉडी) सीधे मोनोलेयर कोटेड चिप्स में जोड़े जाते हैं और डीएलपीएस जोड़ने से पहले अतिरिक्त समाधान हटा दिया जाता है। इसके बाद गीले नमूने की चिप को माइक्रोफ्लुइडिक होल्डर में लोड किया जाता है।

Figure 2
चित्रा 2। एक माइक्रोफ्लुइडिक नमूना धारक के तरल कक्ष को कोडांतरण। नमूना कक्ष की नोक खाली टिप (चरण 1-2) में ओ-रिंग फिटिंग जोड़कर इकट्ठा की जाती है। एकीकृत स्पेसर युक्त गीले नमूना चिप को धीरे-धीरे धारक की नोक (चरण 3-4) के भीतर मशीनी फिटिंग में रखा जाता है। एक चमक-डिस्चार्ज फ्लैट चिप नमूना चिप (चरण 5) के शीर्ष पर रखा गया है। विधानसभा तो एक धातु चेहरा प्लेट(चरण 6)है कि जगह में 3 पीतल शिकंजा (कदम 7-8) द्वारा आयोजित किया जाता है के साथ कवर किया जाता है ।

Figure 3
चित्र 3। तरल में डील्प के लिए प्रतिनिधि परिणाम। A) ग्लो-डिस्चार्ज किए गए माइक्रोचिप्स एफ़िनिटी-डेकोरेटिव माइक्रोचिप्स(बी)की तुलना में समाधान में बहुत कम डील्प्स बांधते हैं । स्केल बार, 2 माइक्रोन। C)लिक्विड में डीएलपीएस की रिप्रेजेंटेटिव इमेज (टॉप पैनल) और 3डी रिकंस्ट्रक्शन (इनसेट) कंट्रास्ट रिएजेंट युक्त लिक्विड में। स्केल बार, 150 एनएम। पुनर्निर्माण का व्यास 80 एनएम है। तरल (नीचे पैनल) में डीएलपीएस के वर्ग औसत उनके बाहरी सतह के साथ अच्छी तरह से परिभाषित सुविधाओं को प्रकट करते हैं। अलग-अलग पैनल 110 एनएम हैं।

Figure 4
चित्र 4. TEM में तरल नमूनों में बुलबुला गठन के लिए प्रतिनिधि परिणाम। लगभग 2 मिनट(ए)और 5 मिनट(बी)के लिए 5 इलेक्ट्रॉन/Å2 पर इलेक्ट्रॉन बीम के निरंतर जोखिम पर तरल नमूनों में गठित बुलबुले की छवियां । स्केल बार 100 एनएम है।

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Discussion

हमारे प्रस्तुत काम में, हमने रोटावायरस डील्प्स को माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म पर आत्मीयता कैप्चर दृष्टिकोण नियोजित किया। यह तरल माइक्रोएनवायरमेंट में मैक्रोमॉलिकुलर परिसरों की सीटू इमेजिंग में अनुमति देता है। कैप्चर दृष्टिकोण अन्य माइक्रोफ्लुइडिक इमेजिंग तकनीकों के संबंध में महत्वपूर्ण है क्योंकि यह तरल में छवियों को रिकॉर्ड करते समय उत्पन्न होने वाले बड़े डिफ्यूजनी मुद्दों को नकारने के लिए इमेजिंग विंडो पर जैविक नमूनों को स्थानीयकृत करता है। हालांकि, हमारे प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक में लिपिड बायोफिल्म को माइक्रोचिप सतह पर स्थानांतरित करना शामिल है। लिपिड मोनोलेयर ग्रिड पर समान रूप से फैलने में विफल होना चाहिए, यह एक त्रुटिपूर्ण प्रयोग में परिणाम होगा । एक गरीब हस्तांतरण कदम का एक संकेत यह है कि कोई वायरल विधानसभाओं के लिए थोड़ा तरल चिप के लिए बाध्य किया जाएगा । हस्तांतरण चरण में एक सीमा थर्मल स्थिरता है जैसा कि लिपिड परत की तरलता से संबंधित है। यदि स्थानांतरण कदम अपर्याप्त है, जैसा कि बूंद के असमान प्रसार द्वारा मूल्यांकन किया जाता है, तो लिपिड परतों को बर्फ पर लंबे समय तक या कंपन मुक्त ठंडे कमरे में इनक्यूबेट करना चाहिए। इसके अलावा, पेट्री डिश को उचित आर्द्रता बनाए रखने के लिए पैराफिल्म के साथ पर्याप्त रूप से सील किया जाना चाहिए।

माइक्रोचिप नमूनों में वायरल कॉम्प्लेक्स या एडाप्टर प्रोटीन की अधिकता कणों के अत्यधिक क्लस्टरिंग का कारण बन सकती है। यह प्रोटोकॉल में एक सीमा है जिसे आसानी से प्रबंधित किया जा सकता है। क्लस्टरिंग प्रभाव को कम करने के लिए, प्रोटीन कारकों को कम समय अवधि के लिए इनक्यूबेटेड किया जा सकता है या वायरस के नमूने को और पतला किया जाना चाहिए। यदि गैर-विशिष्ट प्रोटीन की अधिकता का पता लगाया जाता है, तो बफर समाधान में ताजा रूप से तैयार इमिडाजोल (लगभग 50 mM) को शामिल करने से पृष्ठभूमि कम हो सकती है। ताजा इमिडाजोल का उपयोग प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदमहै। इसी तरह, शुद्ध प्रोटीन के साथ चिप्स अधिभार नहीं है क्योंकि यह विशिष्ट बाध्यकारी सुनिश्चित नहीं करेगा और एक त्रुटिपूर्ण प्रयोग में परिणाम होगा। छवियों में पृष्ठभूमि प्रोटीन की अधिकता होगी और डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग दिनचर्या के लिए उपयुक्त नहीं होगी। शुद्ध प्रोटीन के लिए एक इष्टतम एकाग्रता सीमा मोटे तौर पर 0.01-0.1 मिलीग्राम/मिलीलीटर है । हालांकि, यदि यह सीमा कणों के प्रत्याशित स्तर प्रदान नहीं करती है, तो नमूने की एकाग्रता को तब तक बढ़ाया जाना चाहिए जब तक कि इष्टतम स्तर प्राप्त नहीं हो जाता है। वायरल कणों का संवर्धन नकारात्मक नियंत्रण नमूनों के संबंध में होना चाहिए जिसमें आणविक एडाप्टर की कमी होती है, जैसे एंटीबॉडी। आपके नकारात्मक नियंत्रण में गैर-विशिष्ट बाध्यकारी की छोटी मात्रा कभी-कभी हो सकती है, हालांकि, आत्मीयता से सजाए गए माइक्रोचिप्स को हमेशा वायरल कणों को समृद्ध करने की सेवा करनी चाहिए। रोटावायरस के मामले में, वर्तमान में नी-एनटीए सजाए गए सतहों पर वायरल परिसरों पर कब्जा करने के साधन के रूप में कैप्सिड प्रोटीन में उनके टैग को पेश करने के लिए कोई रिवर्स जेनेटिक सिस्टम नहीं है। हालांकि, उनके टैग किए गए राइबोसोम्स को तरल इमेजिंग प्रयोगों के लिए नी-एनटीए से सजाए गए ई-चिप्स पर बैक्टीरियल लाइसेट्स से सफलतापूर्वक भर्ती किया गयाहै। इस प्रकार सबूत प्रदान करना, हालांकि इस बिंदु पर सीमित, देशी जैविक बातचीत के लिए तरल कोशिकाओं में होने के लिए, जबकि एक TEM कॉलम में ।

डिटर्जेंट, ग्लिसरोल और सुक्रोज के उच्च स्तर के उपयोग से सिटू इमेजिंग से बचा जाना चाहिए। इन अभिकर्णों के उपयोग से ईएम छवियों में कलाकृतियां बनाई जाएंगी जिनमें कणों में अत्यधिक बुदबुदाती और मौन विशेषताएं शामिल हैं, जिसके परिणामस्वरूप खराब गुणवत्ता वाली छवियां हैं। यदि इन अभिकर्णों का उपयोग वायरस की तैयारी में किया जाता है, तो नमूने को इन घटकों की कमी वाले बफर समाधान में दिया जा सकता है। आत्मीयता कैप्चर डिवाइस थोड़े समय के लिए कुछ हद तक डिटर्जेंट का सामना कर सकते हैं, हालांकि इसे केस-बाय-केस आधार पर निर्धारित करने की आवश्यकता है। कृपया पहले वर्णित संगत अभिकर्दकों की सूची का उल्लेखकरें.

डाउनस्ट्रीम इमेज प्रोसेसिंग दिनचर्या को सक्षम करने के लिए, माइक्रोफ्लुइडिक चैंबर में कंट्रास्ट रिएजेंट की कम एकाग्रता जोड़ी जा सकती है। यह अभिकर्ण प्रोटीन के नमूनों को ठीक नहीं करता है, जैसे पारंपरिक धुंधला प्रक्रियाएं17। यह सुनिश्चित करने के लिए कि तरल प्रयोगों के समय-पाठ्यक्रम के दौरान इमेजिंग कक्ष में मौजूद है, इलेक्ट्रॉन बीम को तब तक केंद्रित करें जब तक किबुलबुला गठन (चित्र 4)न हो जाए। यह नमूनों को हाइड्रेटेड रहने का संकेत देने का एक सरल उपाय है । तरल नमूनों को 5 इलेक्ट्रॉन/Å 2 पर इलेक्ट्रॉन बीम के निरंतर बेनकाब के2मिनट(चित्रा 4A)के भीतर गंभीर क्षति का सामना करना पड़ता है । 5 मिनट(चित्रा 4B)के लिए लंबे समय तक निरंतर इलेक्ट्रॉन बीम एक्सपोजर और इस खुराक पर से परे इमेजिंग क्षेत्र में अत्यधिक बुलबुला गठन में परिणाम होगा।

एफ़िनिटी कैप्चर उपकरणों के संयोजन में उपयोग की जाने वाली सीटू आणविक माइक्रोस्कोपी में ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके समाधान में जैविक परिसरों की परीक्षा की अनुमति देता है। ये तकनीकी प्रगति नव विकसित माइक्रोफ्लुइडिक नमूना धारकों के उपयोग से संभव बनाई जाती है। इस तरह के उपकरणों को एक सूक्ष्म स्केल इमेजिंग चैंबर बनाने के लिए पतली सिलिकॉन नाइट्राइड झिल्ली कार्यरत हैं । पार्संस और सहयोगियों के अग्रणी काम पर निर्माण7-10 हम समाधान में व्यक्तिगत वायरल विधानसभाओं छवि के लिए एक उपयोगी रणनीति प्रदान करते हैं । यहां वर्णित प्रोटोकॉल तरीके बताते हैं जो एकल कण छवि प्रसंस्करण दिनचर्या और 3 डी पुनर्निर्माण गणनाओं के साथ संगत हैं। भविष्य के अनुप्रयोगों है कि इन तकनीकों माहिर से परिणाम होगा मैक्रोमॉलिक्यूल्स के लाइव ईएम इमेजिंग शामिल हो सकते हैं । हम सीटू इमेजिंग में आशा वायरल विधानसभा, प्रतिलेखन विनियमन या मेजबान सेल आक्रमण के लिए कदम प्रकट कर सकते हैं । संक्षेप में, इन प्रोटोकॉल के उपयोग से शोधकर्ताओं को पूरी तरह से नए तरीके से समाधान में गतिशील प्रक्रियाओं की जांच करने की अनुमति नी चाहिए ।

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Disclosures

लेखक मैडलीन जे ड्यूक्स प्रोटोचिप्स, इंक के कर्मचारी हैं ।

Acknowledgments

लेखक हमारे शोध प्रयासों को प्रोत्साहित करने के लिए वर्जीनिया टेक कैरिलियन रिसर्च इंस्टीट्यूट के निदेशक डॉ माइकल जे फ्रीलैंडर को स्वीकार करते हैं । इस परियोजना को विकास कोष द्वारा एस.M.M और D.F.K. के लिए और भाग में क्रिटिकल टेक्नोलॉजी और एप्लाइड साइंस के लिए वर्जीनिया टेक में संस्थान के नैनो जैव पहल द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E-chips, spacer chip Protochips, Inc. EPB-52TBD 400 μm x 50 μm window
E-chip, top chip Protochips, Inc. EPT-45W 400 μm x 50 μm window
Ni-NTA lipid Avanti Polar Lipids 790404P Powder form
DLPC (12:0) lipid Avanti Polar Lipids 850335P Powder form
Volumetric flasks  Fisher Scientific 20-812A; 20-812C 1 ml; 5 ml 
Hamilton Syringes Hamilton Co. 80300, 80400 1-10 μl; 1-25 μl
Whatman #1 filter paper Whatman 1001 090 100 pieces, 90 mm
Glass Petri dishes Corning 70165-101 100 mm x 15 mm
Glass Pasteur pipettes VWR 14673-010 14673-010
Glass culture tubes VWR 47729-566 6 mm x 50 mm
Acetone Fisher Scientific A11-1 1 L
Methanol Fisher Scientific A412-1 1 L
Chloroform  Electron Microcopy Sciences 12550 100 ml 
His-tagged Protein A Abcam, Inc. ab52953 10 mg
Milli-Q water system EMD Millipore Corp. Z00QSV001 Ultrapure Water
HEPES Fisher Scientific BP310-500 500 g
Equipment 
Poseidon In situ specimen holder Protochips, Inc.  FEI compatible
FEI Spirit BioTwin TEM FEI Co. 120 kV
Eagle 2k HS CCD camera FEI Co. 10 Å/pixel sampling at 30,000X
Gatan 655 Dry pump station Gatan, Inc. Pump holder tip to 10-6 range
PELCO easiGlow, glow discharge unit Ted Pella, Inc.  Negative polarity mode
Isotemp heated stir plate Fisher Scientific Heat to 150 ºC for 1.5 hr

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 82 माइक्रोफ्लुइडिक्स ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) सीटू इमेजिंग, रोटावायरस सिमियन रोटावायरस डबल-लेयर्ड कणों (डीएलसी) 3 डी संरचना निर्धारण में
<em>सीटू में</em> तरल में जैविक विधानसभाओं के TEM
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Dukes, M. J., Gilmore, B. L.,… More

Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid. J. Vis. Exp. (82), e50936, doi:10.3791/50936 (2013).

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