Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

In situ TEM av biologiske forsamlinger i væske

Published: December 30, 2013 doi: 10.3791/50936
Automatic Translation
*1, *2, *2, 2, 2
1Applications Science, Protochips, Inc., 2Virginia Tech Carilion Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en prosedyre for å avbilde virale komplekser i væske ved nanometeroppløsning ved hjelp av et transmisjonselektronmikroskop.

Abstract

Forskere bruker regelmessig Transmission Electron Microscopes (TEMs) for å undersøke biologiske enheter og til å vurdere nye materialer. Her beskriver vi en ekstra applikasjon for disse instrumentene - visning av virale forsamlinger i et flytende miljø. Denne spennende og nye metoden for visualisering av biologiske strukturer benytter en nylig utviklet mikrofluidbasert prøveholder. Vår videoartikkel viser hvordan du monterer og bruker en mikrofluidisk holder for å avbilde væskeprøver i en TEM. Spesielt bruker vi simian rotavirus tolags partikler (DLC) som vårt modellsystem. Vi beskriver også trinn for å belegge overflaten av væskekammeret med affinitetsbiofilmer som tether DLPer til visningsvinduet. Dette tillater oss å bildesamlinger på en måte som passer for 3D-strukturbestemmelse. Dermed presenterer vi et første glimt av subvirale partikler i et innfødt flytende miljø.

Introduction

Et felles mål for biologer og ingeniører er å forstå molekylære maskiners indre arbeid. Transmission Electron Microscopes (TEMs) er ideelle instrumenter for å visualisere disse intrikate detaljene ved nesten atomisk oppløsning1-2. For å opprettholde høyvakuumsystemet til en TEM, er biologiske prøver vanligvis innebygd i tynne filmer av glassaktig is3, sukker4, tungmetallsalter5, eller en kombinasjon derav6. Som et resultat kan bilder av innebygde prøver bare avsløre begrensede øyeblikksbilder av dynamiske prosesser.

Tidlige forsøk på å opprettholde biologiske prøver hydrert i miljøvæskekamre ble utført av Parsons og kolleger ved hjelp av differensialpumpestadier. Elektrondiffraksjonsmønstre av unstained kataliseskrystaller ble vellykket registrert til en oppløsning på 3 Å i en hydrert tilstand7-8. I tillegg kan faseseparerte lipiddomener undersøkes i hydrerte membraner av humane erytrocytter9-10. Bevegelse forårsaket av diffus væske og dens interferens med elektronstrålen resulterte imidlertid i alvorlig oppløsningstap, og ytterligere eksperimenter ved hjelp av biologiske prøver ble ikke forsøkt før nylig.

Nyutviklede mikrofluidiske prøveholdere er introdusert som benytter halvledermikrochips for å danne et mikroskalert miljøkammer. Disse enhetene kan opprettholde prøver i væske mens de er plassert i enTEM-kolonne 11-12. Dette tekniske gjennombruddet i TEM-avbildning har gjort det mulig for forskere å se for første gang progressive hendelser på molekylærnivå13. Vi refererer til denne nye modaliteten som"in situ molekylær mikroskopi" da eksperimenter nå kan utføres "inne"EM-kolonnen 14-15. Det overordnede målet med denne metoden er å bilde biologiske forsamlinger i væske for å observere deres dynamiske oppførsel ved nanometeroppløsning. Begrunnelsen bak den utviklede teknikken er å registrere sanntidsobservasjoner og undersøke nye egenskaper til biologiske maskiner i løsning. Denne metodikken utvider bruken av TEMer til bredere formål i cellulær og molekylærbiologi12-16.

I den nåværende videoartikkelen presenterer vi en omfattende protokoll for å montere og bruke en kommersielt tilgjengelig mikrofluidisk prøveholder. Disse spesialiserte holderne bruker silisiumnitrittmikrochips produsert med integrerte avstandsstykker for å danne et flytende kammer som omslutter små mengder løsning. Tynne, gjennomsiktige vinduer etset inn i mikrobrikkene for bildebehandlingsformål12. Vi demonstrerer riktig bruk av en mikrofluidisk holder for å undersøke simian rotavirus dobbeltlags partikler (DLC) i væske ved hjelp av en TEM. For å sikre at biologiske forsamlinger, for eksempel DLP-er, ikke raskt sprer seg over store avstander mens vi ser for oss, bruker vi Affinity Capture-tilnærmingen til å tether dem til overflaten av mikrofluidiskkammer 16. Dette molekylære fangsttrinnet har en stor fordel i forhold til alternative teknikker for avbildning av biologiske prøver i væske fordi det muliggjør oppkjøp av bilder som vil bli brukt til nedstrøms prosesseringsrutiner. Dette fangsttrinnet som brukes sammen med mikrofluidisk avbildning er unikt for prosedyrene våre17. Lesere som benytter strukturelle biologiapplikasjoner ved hjelp av TEM eller mikrofluidiske bildekamre, kan vurdere bruken av affinitetsfangstteknikker når dynamiske observasjoner på molekylært nivå er sluttmålet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Klargjør affinitetsfangstenheter16

  1. Rengjør silisiumnitritt-e-brikkene ved å inkubere dem i 15 ml aceton i 2 minutter etterfulgt av 15 ml metanol i 2 min (Figur 1A). La sjetongene tørke under laminær luftstrøm.
  2. Inkuber de tørkede sjetongene på en oppvarmet røreplate (uten omrøring) i 1,5 timer ved 150 °C, og la dem avkjøles til romtemperatur før bruk.
  3. Bruk Hamilton sprøyter til å komponere lipidblandinger i små glassrør for å inneholde 25% kloroform, 55% DLPC (1,2-dilauroyl-fosfocholin) i kloroform (1 mg/ml) og 20% Ni-NTA lipid (1,2-dioleoyl-iminodiketisk syre-succinyl-nikkel salt) i kloroform (1 mg/ml) for et totalt volum på 40 μl.
  4. Påfør en 1 μl aliquot av blandingen over hver 15 μl dråpe Milli-Q vann på et stykke Parafilm i en fuktig Petri-tallerken (Figur 1B). Inkuber prøver på is i minst 60 min.

2. Fange makromolekyler17

  1. Plasser en E-chip med et 150 nm integrert avstandsstykke på toppen av en monolagsprøve og inkuber i 1 min (figur 1C).
  2. Løft forsiktig brikken av prøven og tilsett en 3 μl aliquot av Hans-taggede Protein A. Inkuber i 1 min ved romtemperatur (Figur 1D).
  3. Flekk bort overflødig dråpe ved hjelp av Whatman #1 filterpapir og tilsett umiddelbart en 3 μl aliquot antistoffoppløsning. Inkuber i 1 min ved romtemperatur.
  4. Fjern overflødig oppløsning ved hjelp av en Hamilton-sprøyte og tilsett umiddelbart en 1 μl aliquot rotavirus DLPer (0,1 mg/ml) i bufferoppløsning som inneholder 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 og 10 mM CaCl2. Inkuber i minst 2 min ved romtemperatur. Utarbeidelsen av DLP-er er beskrevet tidligere18.

3. Monter det mikrofluidiske kammeret og last inn in situ specimen holderen

  1. Legg den våte E-brikken som inneholder virusprøven, i spissen av den mikrofluidiske prøveholderen. Glødeutladning en ekstra flat E-chip i 1 min og deretter lastet på toppen av avstandsstykken (Figur 2, paneler 1-5).
  2. Alternativt, for å øke kontrasten til biologiske makromolekyler, kan tungmetallflekk(f.eks. 0,2% uranylformat) legges til våte prøver før du legger den andre E-brikken på den våte prøven. E-brikken som inneholder prøven, må imidlertid vaskes med Milli-Q vann før du tilsetter kontrastreagenset.
  3. Smør hele enheten sammen for å danne et forseglet kabinett, holdt mekanisk inne i holderen med 3 messingskruer (Figur 2, paneler 6-8).
  4. Etter montering pumpes spissen av holderen til10-6 Torr ved hjelp av en turbopumpet tørr pumpestasjon før holderen plasseres inne i TEM.

4. Avbildning i væske ved hjelp av et transmisjonselektronmikroskop

  1. Legg in situ-prøveholderen i et transmission electron-mikroskop (FEI Company) utstyrt med en LaB6-filament og opererer ved 120 kV.
  2. Slå på TEM-filamentet og juster den eusentriske høyden på mikroskopstadiet med hensyn til prøven ved å bruke wobbler-funksjonen til å vippe prøven fra -15° til +15° frem og tilbake i kolonnen. Denne prosedyren justerer scenen i z-retningen for å gjøre rede for riktig tykkelse på væskekammeret. Dette trinnet sikrer også at en nøyaktig forstørrelse brukes når du tar opp bilder.
  3. Ta opp bilder langs kantene og i hjørneområdene i mikrofluidisk kammer først. Disse områdene inneholder vanligvis den tynneste løsningen. Ta opp bilder av prøver under lavdoseforhold (1-3 elektroner/Å2) ved hjelp av et CCD-kamera. Bruk nominelle forstørrelser på 6000X - 30 000X.
  4. Bestem riktig defokuseringsverdi ved å fokusere på kanten av fluidisk kammer. Bruk verdien -1,5 μm til å spille inn bilder med 30 000 X forstørrelse. Hvis tykk løsning oppstår, eller hvis kontrastmiddel ikke brukes i prøvepreparatet, bruk høyere defokusverdier i området -2 til -4 μm.
  5. For å sikre at løsningen finnes i mikrofluidisk kammer gjennom forsøkene, fokuser elektronstrålen til boblene dannes i væsken i enheten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representative bilder av DLL-filer i væske ved hjelp av E-brikker som ble glød-utladet (Figur 3A) viser færre DLPer i et gitt visningsområde, antagelig på grunn av diffusjon, sammenlignet med DLL-filer som er beriket på Affinity Capture-enheter (Figur 3B). Tilsetningen av uranylformat i bildekammeret forbedrer kontrasten til prøven og dermed synligheten av individuelle DLP-er i løsning (Figur 3C, topppanel). Bedre kontrast gir mulighet for nedstrøms bildebehandling som partikkelgjennomsnitt (figur 3C, bunnpanel) og 3D-rekonstruksjonsrutiner (figur 3C, innsett) som tidligere beskrevet17. Kort sagt, for 3D-rekonstruksjonen valgte vi 600 partikler av DLP-er ved hjelp av SPIDER-programvarepakken19. Utvalgte partikler ble raffinert mot en innledende modell av rotaviruset DLP20 som ble filtrert til 80 Å-oppløsning. Vi brukte RELION-programvarepakken21 til å beregne en 3D-rekonstruksjon med en oppløsning på ca. 25 Å. Vårt 3D-kart i god avtale med den opprinnelige modellen og med en uavhengig kryo-EM-rekonstruksjon som ble beregnet ved hjelp av de samme parametrene og DLP-prøve17.

Figure 1
Figur 1. Forbereder silisiumnitmidmikrochips for flytende avbildning. A) Silisiumnitrittmikrochips rengjøres ved å nedsenke i 2 min i aceton etterfulgt av 2 min i metanol for å fjerne gjenværende fotoresist som brukes i produksjonsprosessen. B) Lipid monolayerprøver fremstilles på dråper Milli-Q vann tilsatt parafilm i en fuktig Petri-tallerken17. C) Rengjorte mikrochips plasseres på toppen av monolayers og fjernes etter et 1 min inkubasjonstrinn. D) Molekylære adaptere (dvs. protein A og antistoffer i oppløsning) tilsettes direkte til monolayerbelagte sjetonger og den overskytende løsningen fjernes før tilsetning av DLPer. Den våte prøvebrikken lastes deretter inn i mikrofluidisk holder.

Figure 2
Figur 2. Montering av væskekammeret til en mikrofluidisk prøveholder. Spissen på prøvekammeret monteres ved å legge O-ringbeslag til den tomme spissen (trinn 1-2). Den våte prøvebrikken som inneholder integrerte avstandsstykker, plasseres forsiktig i de bearbeidede beslagene i spissen av holderen (trinn 3-4). En glød-utladet flat chip er plassert over toppen av prøvebrikken (trinn 5). Monteringen er deretter dekket med en metall ansiktsplate (trinn 6) som holdes på plass av 3 messingskruer (trinn 7-8).

Figure 3
Figur 3. Representative resultater for DLP-er i væske. A) Glødeutladede mikrochips binder svært få DLP-er i oppløsning i forhold til affinitetspyntede mikrochips (B). Skalastenger, 2 μm. C) Representativt bilde (topppanel) og 3D-rekonstruksjon (innsatt) av DLP-er i væske som inneholder kontrastreagens. Vektstang, 150 nm. Diameteren på rekonstruksjonen er 80 nm. Klassegjennomsnittet av DLP-ene i flytende (bunnpanel) avslører pent definerte funksjoner langs deres ytre overflate. Individuelle paneler er 110 nm.

Figure 4
Figur 4. Representative resultater for bobledannelse i væskeprøver i TEM. Bilder av bobler dannet i væskeprøver ved kontinuerlig eksponering av elektronstrålen ved 5 elektroner / Å2 i ca. 2 min (A) og 5 min (B). Skala bar er 100 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I vårt presenterte arbeid benyttet vi affinitetsfangsttilnærmingen til tether rotavirus-DLP-er til en mikrofluidisk plattform. Dette tillot in situ avbildning av makromolekylære komplekser i et flytende mikromiljø. Fangsttilnærmingen er betydelig med hensyn til andre mikrofluidiske avbildningsteknikker fordi den lokaliserer biologiske prøver til bildevinduet for å store diffusive problemer som oppstår mens du registrerer bilder i væske. Imidlertid innebærer et av de mest kritiske trinnene i vår protokoll overføring av lipidbiofilmen til mikrochipoverflaten. Skulle lipidmonolayeren ikke spre seg jevnt over rutenettet, vil dette resultere i et feileksperiment. En indikasjon på et dårlig overføringstrinn er at lite eller ingen virale forsamlinger vil være bundet til den fluidiske brikken. En begrensning i overføringstrinnet er termisk stabilitet i forhold til fluiditeten til lipidlaget. Hvis overføringstrinnet er utilstrekkelig, som vurdert ved ujevn spredning av dråpen, bør lipidlagene inkubere på is lenger eller i et vibrasjonsfritt kaldt rom. Petri-parabolen må også være tilstrekkelig forseglet med Parafilm for å opprettholde riktig fuktighet.

Et overskudd av virale komplekser eller adapterproteiner i mikrochip-prøvene kan føre til overdreven klynge av partiklene. Dette er en begrensning i protokollen som enkelt kan administreres. For å minimere klyngeeffekten kan proteinfaktorene inkuberes i en kortere tidsperiode, eller virusprøven bør fortynnes ytterligere. Hvis det oppdages et overskudd av ikke-spesifikke proteiner, kan inkludering av nylaget imidazol (ca. 50 mM) i bufferløsningen redusere bakgrunnen. Bruken av fersk imidazol er et avgjørende skritt i protokollen. På samme måte må du ikke overbelaste sjetongene med rensede proteiner, da dette ikke vil sikre spesifikk binding og vil resultere i et feileksperiment. Bilder vil inneholde et overskudd av bakgrunnsproteiner og vil ikke være egnet for nedstrøms prosesseringsrutiner. Et optimalt konsentrasjonsområde for rensede proteiner er omtrent 0,01-0,1 mg/ml. Men hvis dette området ikke gir det forventede nivået av partikler, bør konsentrasjonen av prøven økes til et optimalt nivå er oppnådd. En berikelse av virale partikler bør forekomme med hensyn til negative kontrollprøver som mangler molekylære adaptere, for eksempel antistoffer. Små mengder ikke-spesifikk binding i din negative kontroll kan sjelden forekomme, men de affinitetsdekorerte mikrochipsene skal alltid tjene til å berike viruspartiklene. Når det gjelder rotavirus, er det for tiden ikke noe omvendt genetisk system for å introdusere hans koder i kapsidproteiner som et middel til å direkte fange virale komplekser på Ni-NTA dekorerte overflater. Hans taggede ribosomer har imidlertid blitt rekruttert fra bakterielle lysater til Ni-NTA dekorerte E-chips for flytende bildebehandlingsforsøk16. Dermed gir bevis, om enn begrenset på dette tidspunktet, for innfødte biologiske interaksjoner som skal forekomme i flytende celler mens de er i en TEM-kolonne.

Bruk av vaskemidler, glyserol og høye nivåer av sukrose må unngås ved in situ avbildning. Bruken av disse reagensene vil skape artefakter i EM-bilder som inkluderer overdreven boblende og dempede funksjoner i partikler, noe som resulterer i bilder av dårlig kvalitet. Hvis disse reagensene brukes i viruspreparater, kan prøven ringes inn i bufferløsningen som mangler disse komponentene. Affinity Capture-enheter kan tåle en viss grad av vaskemidler i en kort periode, selv om dette må bestemmes fra sak til sak. Se listen over kompatible reagenser som tidligere er beskrevet22.

For å muliggjøre nedstrøms bildebehandlingsrutiner kan en lav konsentrasjon av kontrastreagens legges til mikrofluidisk kammer. Dette reagenset fikser ikke proteinprøver, som tradisjonelle fargingsprosedyrer17. For å sikre at væske er til stede i bildekammeret gjennom hele tidsforløpet for forsøkene, fokuser elektronstrålen til bobledannelse oppstår (Figur 4). Dette er et enkelt tiltak for å indikere at prøvene forblir hydrert. Væskeprøver påløper alvorlig skade innen 2 min (Figur 4A) ved kontinuerlig eksponering av elektronstrålen ved 5 elektroner/Å2. Langvarig kontinuerlig elektronstråleeksponering i 5 min (Figur 4B) og utover ved denne dosen vil resultere i overdreven bobledannelse i bildeområdet.

In situ molekylær mikroskopi som brukes i kombinasjon med Affinity Capture-enheter tillater undersøkelse av biologiske komplekser i løsning ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi. Disse tekniske fremskrittene er muliggjort ved bruk av nyutviklede mikrofluidiske prøveholdere. Slike enheter bruker tynne silisiumnitrittmembraner for å danne et mikroskalert bildekammer. Basert på det banebrytende arbeidet til Parsons og kolleger7-10 tilbyr vi en nyttig strategi for å avbilde individuelle virale forsamlinger i løsning. Protokollen som er beskrevet her forklarer metoder som er kompatible med enkeltpartikkelbildebehandlingsrutiner og 3D-rekonstruksjonsberegninger. Fremtidige anvendelser som vil være et resultat av å mestre disse teknikkene kan omfatte live-EM-avbildning av makromolekyler. Vi forventer in situ avbildning kan avsløre trinn for viral montering, transkripsjon regulering eller vert celle invasjon. Oppsummert bør bruken av disse protokollene tillate forskere å undersøke dynamiske prosesser i løsning på en helt ny måte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren Madeline J. Dukes er ansatt i Protochips, Inc.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner Dr. Michael J. Friedlander, direktør for Virginia Tech Carilion Research Institute for å oppmuntre våre forskningsinnsatser. Dette prosjektet ble støttet av utviklingsmidler til S.M.M og D.F.K. og delvis av Nano-Bio-initiativet fra Institute for Critical Technology and Applied Science ved Virginia Tech.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E-chips, spacer chip Protochips, Inc. EPB-52TBD 400 μm x 50 μm window
E-chip, top chip Protochips, Inc. EPT-45W 400 μm x 50 μm window
Ni-NTA lipid Avanti Polar Lipids 790404P Powder form
DLPC (12:0) lipid Avanti Polar Lipids 850335P Powder form
Volumetric flasks  Fisher Scientific 20-812A; 20-812C 1 ml; 5 ml 
Hamilton Syringes Hamilton Co. 80300, 80400 1-10 μl; 1-25 μl
Whatman #1 filter paper Whatman 1001 090 100 pieces, 90 mm
Glass Petri dishes Corning 70165-101 100 mm x 15 mm
Glass Pasteur pipettes VWR 14673-010 14673-010
Glass culture tubes VWR 47729-566 6 mm x 50 mm
Acetone Fisher Scientific A11-1 1 L
Methanol Fisher Scientific A412-1 1 L
Chloroform  Electron Microcopy Sciences 12550 100 ml 
His-tagged Protein A Abcam, Inc. ab52953 10 mg
Milli-Q water system EMD Millipore Corp. Z00QSV001 Ultrapure Water
HEPES Fisher Scientific BP310-500 500 g
Equipment 
Poseidon In situ specimen holder Protochips, Inc.  FEI compatible
FEI Spirit BioTwin TEM FEI Co. 120 kV
Eagle 2k HS CCD camera FEI Co. 10 Å/pixel sampling at 30,000X
Gatan 655 Dry pump station Gatan, Inc. Pump holder tip to 10-6 range
PELCO easiGlow, glow discharge unit Ted Pella, Inc.  Negative polarity mode
Isotemp heated stir plate Fisher Scientific Heat to 150 ºC for 1.5 hr

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhou, Z. H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).
  2. Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Subunit interactions in bovine papillomavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).
  3. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).
  4. Unwin, P. N., Henderson, R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).
  5. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
  6. Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. Cryo-negative staining. Micron. 29, 145-160 (1998).
  7. Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186, 407-414 (1974).
  8. Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects. Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).
  9. Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184, 77-78 (1974).
  10. Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).
  11. Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
  12. Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).
  13. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
  14. Peckys, D. B., de Jonge, N. Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).
  15. Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. J. Microsc. 242, 117-123 (2011).
  16. Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).
  17. Gilmore, B. L., et al. Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere. Lab Chip. 13, 216-219 (2013).
  18. Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. Purification and characterization of bovine rotavirus cores. J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).
  19. Frank, J., et al. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).
  20. Zhang, X., et al. Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).
  21. Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).
  22. Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification. J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).

Tags

Bioingeniør Utgave 82 Mikrofluidikk Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) In situ-avbildning, Rotavirus simian rotavirus dobbeltlagspartikler (DLC-er) bestemmelse av 3D-struktur
<em>In situ</em> TEM av biologiske forsamlinger i væske
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dukes, M. J., Gilmore, B. L.,… More

Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid. J. Vis. Exp. (82), e50936, doi:10.3791/50936 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter