Summary
Aqui descrevemos um procedimento para imagem de complexos virais em liquidez em resolução de nanômetros usando um microscópio eletrônico de transmissão.
Abstract
Os pesquisadores usam regularmente microscópios eletrônicos de transmissão (TEMs) para examinar entidades biológicas e avaliar novos materiais. Aqui, descrevemos uma aplicação adicional para esses instrumentos: visualização de conjuntos virais em um ambiente líquido. Este excitante e novo método de visualização de estruturas biológicas utiliza um suporte de espécimes de base microfluidic recentemente desenvolvido. Nosso artigo em vídeo demonstra como montar e usar um suporte microfluido para imagem de amostras líquidas dentro de um TEM. Em particular, usamos partículas de rotavírus de dupla camada (DLPs) como nosso sistema modelo. Também descrevemos passos para revestir a superfície da câmara líquida com biofilmes de afinidade que amarram DLPs à janela de visualização. Isso nos permite fazer assembleias de imagem de forma adequada para a determinação da estrutura 3D. Assim, apresentamos um primeiro vislumbre de partículas subvirais em um ambiente líquido nativo.
Introduction
Um objetivo comum de biólogos e engenheiros é entender o funcionamento interno das máquinas moleculares. Os microscópios eletrônicos de transmissão (TEMs) são instrumentos ideais para visualizar esses detalhes intrincados na resolução quase atômica1-2. Para sustentar o sistema de alto vácuo de um TEM, as amostras biológicas são tipicamente incorporadas em pelíneas de gelo vítreo3, açúcares4,sais de metal pesado5, ou alguma combinação de6. Como resultado, imagens de espécimes incorporados podem revelar apenas instantâneos limitados de processos dinâmicos.
As primeiras tentativas de manter espécimes biológicos hidratados em câmaras de líquidos ambientais foram realizadas por Parsons e colegas utilizando estágios diferenciais de bombeamento. Padrões de difração eletrônica de cristais catalase não manchados foram registrados com sucesso em uma resolução de 3 Å em um estado hidratado7-8. Além disso, domínios lipíduos separados em fases poderiam ser examinados em membranas hidratadas de eritrócitos humanos9-10. No entanto, o movimento causado pela difusão do líquido e sua interferência com o feixe de elétrons, resultou em perda severa de resolução e outros experimentos usando espécimes biológicos não foram tentados até recentemente.
Recém-desenvolvidos foram introduzidos portadores de amostras microfluidas que utilizam microchips semicondutores para formar uma câmara ambiental microes em escala. Estes dispositivos podem manter amostras em líquido enquanto estão posicionados em uma coluna TEM11-12. Esse avanço técnico na imagem TEM permitiu que os pesquisadores vissem, pela primeira vez, eventos progressivos no nível molecular13. Referimo-nos a esta nova modalidade como " microscopia molecularin situ", pois os experimentos agora podem ser realizados "dentro" da coluna EM14-15. O objetivo geral deste método é imaginar conjuntos biológicos em líquido, a fim de observar seus comportamentos dinâmicos na resolução de nanômetros. A lógica por trás da técnica desenvolvida é registrar observações em tempo real e examinar novas propriedades do maquinário biológico em solução. Essa metodologia amplia o uso de TEMs para fins mais amplos em biologia celular e molecular12-16.
No artigo de vídeo atual, apresentamos um protocolo abrangente para montar e usar um suporte de espécime microfluidic comercialmente disponível. Esses suportes especializados utilizam microchips de nitreto de silício produzidos com espaçadores integrados para formar uma câmara líquida que inclua volumes minuciosos de solução. Janelas finas e transparentes são gravadas nos microchips para fins de imagem12. Demonstramos o uso adequado de um suporte microfluido para examinar partículas de rotavírus de dupla camada (DLPs) em camadas sídicas em líquido usando um TEM. Para garantir que os conjuntos biológicos, como os DLPs, não se difundam rapidamente em grandes distâncias durante a imagem, empregamos a abordagem Affinity Capture para amarrá-los à superfície da câmara microfluidica16. Esta etapa de captura molecular tem uma grande vantagem sobre técnicas alternativas para imagens de amostras biológicas em líquido, pois permite a aquisição de imagens que serão usadas para rotinas de processamento a jusante. Esta etapa de captura usada em conjunto com a imagem microfluidica é exclusiva dos nossos procedimentos17. Os leitores que utilizam aplicações de biologia estrutural usando câmaras de imagem TEM ou microfluidic podem considerar o uso de técnicas de captura de afinidade quando observações dinâmicas no nível molecular são o objetivo final.
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Protocol
1. Prepare os dispositivos de captura de afinidade16
- Limpe o nitreto de silício E-chips incubando-os em 15 ml de acetona por 2 min seguido por 15 ml de metanol por 2 min(Figura 1A). Deixe os chips secarem sob o fluxo de ar laminar.
- Incubar os chips secos em uma placa de agitação aquecida (sem mexer) durante 1,5 h a 150 °C, em seguida, deixe esfriar até a temperatura ambiente antes de usar.
- Use seringas Hamilton para compor misturas lipídicas em pequenos tubos de vidro para conter 25% de clorofórmio, 55% DLPC (1,2-dilauroyl-fosfocolina) em clorofórmio (1 mg/ml) e lipídio ni-NTA de 20% (1,2-dioleoyl-iminodiacético ácido-succinyl-sal) em clorofórmio (1 mg/ml) para um volume total de 40 μl.
- Aplique uma alíquota de 1 μl da mistura sobre cada gota de 15 μl de água Milli-Q em um pedaço de Parafilm em uma placa de Petri úmida(Figura 1B). Incubar amostras no gelo por pelo menos 60 minutos.
2. Capturar macromoléculas17
- Coloque um E-chip com um espaçador integrado de 150 nm em cima de uma amostra de monocamadas e incubar por 1 min(Figura 1C).
- Retire suavemente o chip da amostra e adicione uma alíquota de 3 μl de Proteína A. Incubar por 1 min a temperatura ambiente(Figura 1D).
- Limpe a gota de excesso usando o Whatman #1 papel filtro e adicione imediatamente uma alíquota de 3 μl de solução de anticorpos. Incubar por 1 min a temperatura ambiente.
- Remova a solução em excesso usando uma seringa Hamilton e adicione imediatamente uma alíquota de 1 μl de DLPs rotavírus (0,1 mg/ml) em solução tampão contendo HEPES de 50 mM (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 e 10 mM CaCl2. Incubar por pelo menos 2 minutos em temperatura ambiente. A preparação dos DLPs foi descrita anteriormente18.
3. Monte a Câmara Microfluiídica e Carregue o Porta-Espécimes In situ
- Carregue o e-chip molhado contendo a amostra viral na ponta do suporte da amostra microfluida. Descarregue um segundo e-chip plano por 1 min e depois carregado em cima do chip espaçador(Figura 2, painéis 1-5).
- Alternativamente, para aumentar o contraste das macromoléculas biológicas, a mancha de metal pesado (por exemplo, 0,2% de formação de urano) pode ser adicionada a espécimes molhados antes de colocar o segundo e-chip no espécime molhado. No entanto, o e-chip contendo o espécime precisará ser lavado com água Milli-Q antes de adicionar o reagente de contraste.
- Sanduíche toda a montagem para formar um gabinete selado, mantido no lugar mecanicamente dentro do suporte por 3 parafusos de latão (Figura 2, painéis 6-8).
- Após o montagem, a ponta do suporte é bombeada para 10-6 Torr usando uma estação de bombeamento a seco turbo-bombeada antes de colocar o suporte dentro do TEM.
4. Imagem em líquido usando um microscópio eletrônico de transmissão
- Carregue o porta-espécimes in situ em um microscópio eletrônico de transmissão (FEI Company) equipado com um filamento LaB6 e operando a 120 kV.
- Ligue o filamento TEM e ajuste a altura eucêntrica do estágio do microscópio em relação à amostra usando a função wobbler para inclinar a amostra de -15° para +15° para frente e para trás na coluna. Este procedimento ajusta o estágio na direção z para ajudar a explicar a espessura adequada da câmara líquida. Esta etapa também garante que uma ampliação precisa seja usada ao gravar imagens.
- Registo as imagens ao longo das bordas e nas regiões do canto da câmara microfluidica primeiro. Essas áreas normalmente contêm a solução mais fina. Registo imagens de amostras em condições de baixa dose (1-3 elétrons/Å2) usando uma câmera CCD. Use ampliações nominais de 6.000X - 30.000X.
- Determine o valor adequado do desfoco focando na borda da câmara fluida. Use um valor de -1,5 μm para gravar imagens a 30.000X de ampliação. Se a solução espessa for encontrada ou se o agente de contraste não for usado na preparação da amostra, use valores de desfoco mais elevados na faixa de -2 a -4 μm.
- Para garantir que a solução esteja contida na câmara microfluida durante os experimentos, concentre o feixe de elétrons até que as bolhas sejam formadas no líquido dentro do dispositivo.
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Representative Results
Imagens representativas de DLPs em líquido usando E-chips que foram descarregadas por brilho(Figura 3A) mostram menos DLPs em uma determinada área de visualização, presumivelmente devido à difusão, em comparação com DLPs que são enriquecidos em dispositivos affinity capture(Figura 3B). A adição de formato de urano na câmara de imagem aumenta o contraste da amostra e, consequentemente, a visibilidade de DLPs individuais na solução(Figura 3C, painel superior). Um melhor contraste permite o processamento de imagem a jusante, como a média de partículas(Figura 3C, painel inferior) e rotinas de reconstrução 3D(Figura 3C, inset) como descrito anteriormente17. Resumidamente, para a reconstrução 3D, selecionamos 600 partículas de DLPs usando o pacote de software SPIDER19. As partículas selecionadas foram refinadas em relação a um modelo inicial do rotavírus DLP20 que foi filtrado para resolução de 80 Å. Usamos o pacote de software RELION21 para calcular uma reconstrução 3D em uma resolução de aproximadamente 25 Å. Nosso mapa 3D em bom acordo com o modelo inicial e com uma reconstrução crio-EM independente que foi calculada usando os mesmos parâmetros e amostra DLP17.
Figura 1. Preparando microchips de nitreto de silício para imagens líquidas. A) Os microchips de nitreto de silício são limpos submergindo por 2 min em acetona seguido de 2 min em metanol para remover fotoresist residual usado no processo de fabricação. B) As amostras de monocamadas lipídicas são preparadas em gotas de água Milli-Q adicionadas ao Parafilm em uma placa de Petri úmida17. C) Microchips limpos são colocados em cima das monocamadas e removidos após uma etapa de incubação de 1 min. D) Os adaptadores moleculares (ou seja, proteína A e anticorpos em solução) são adicionados diretamente aos chips revestidos de monocamadas e a solução em excesso é removida antes de adicionar DLPs. O chip de espécime molhado é então carregado no suporte microfluido.
Figura 2. Montando a câmara líquida de um suporte de espécime microfluido. A ponta da câmara de espécime é montada adicionando encaixes o-ring à ponta vazia (passos 1-2). O chip de espécime molhado contendo espaçadores integrados é gentilmente colocado nos encaixes usinados dentro da ponta do suporte (passos 3-4). Um chip plano com descarga de brilho é colocado sobre o chip de espécime (passo 5). O conjunto é então coberto com uma placa facial metálica(passo 6) que é mantida no lugar por 3 parafusos de latão (passos 7-8).
Figura 3. Resultados representativos para DLPs em líquido. A) Microchips com descarga de brilho ligam pouquíssimos DLPs em solução em comparação com microchips decorados por afinidade(B). Barras de escala, 2 μm. C) Imagem representativa (painel superior) e reconstrução 3D (inset) de DLPs em líquido contendo reagente de contraste. Barra de escala, 150 nm. O diâmetro da reconstrução é de 80 nm. As médias de classe dos DLPs em líquido (painel inferior) revelam características bem definidas ao longo de sua superfície externa. Os painéis individuais são de 110 nm.
Figura 4. Resultados representativos para a formação de bolhas em amostras líquidas no TEM. Imagens de bolhas formadas em amostras líquidas após a exposição contínua do feixe de elétrons a 5elétrons/Å 2 por aproximadamente 2 min(A) e 5 min(B). A barra de escala é de 100 nm.
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Discussion
Em nosso trabalho apresentado, utilizamos a abordagem de captura de afinidade para dLPs rotavírus de tether para uma plataforma microfluida. Isso permitiu imagens in situ de complexos macromoleculares em um microambiente líquido. A abordagem de captura é significativa em relação a outras técnicas de imagem microfluidica, pois localiza espécimes biológicos na janela de imagem para negar grandes problemas difusivos que surgem durante a gravação de imagens em líquido. No entanto, uma das etapas mais críticas em nosso protocolo envolve a transferência do biofilme lipíduo para a superfície do microchip. Se a monocamada lipídica não se espalhar uniformemente sobre a grade, isso resultará em um experimento falho. Uma indicação de um passo de transferência ruim é que pouco ou nenhum conjunto viral será vinculado ao chip fluido. Uma limitação na etapa de transferência é a estabilidade térmica relacionada à fluidez da camada lipídica. Se a etapa de transferência for inadequada, como avaliado pela propagação desigual da gota, as camadas lipídicas devem incubar no gelo por mais tempo ou em uma sala fria livre de vibrações. Além disso, a placa de Petri deve ser adequadamente selada com Parafilm para manter a umidade adequada.
Um excesso de complexos virais ou proteínas adaptadoras nas amostras de microchip pode levar a um agrupamento excessivo das partículas. Esta é uma limitação no protocolo que pode ser facilmente gerenciada. Para minimizar o efeito de agrupamento, os fatores proteicos podem ser incubados por um período de tempo mais curto ou a amostra do vírus deve ser diluída. Se for detectado um excesso de proteínas não específicas, a inclusão de imidazol recém-preparado (aproximadamente 50 mM) na solução tampão pode diminuir o fundo. O uso de imidazol fresco é um passo crucial no protocolo. Da mesma forma, não sobrecarregue os chips com proteínas purificadas, pois isso não garantirá uma ligação específica e resultará em um experimento falho. As imagens conterão um excesso de proteínas de fundo e não serão adequadas para rotinas de processamento a jusante. Uma faixa de concentração ideal para proteínas purificadas é de aproximadamente 0,01-0,1 mg/ml. No entanto, se essa faixa não fornecer o nível previsto de partículas, a concentração da amostra deve ser aumentada até que um nível ideal seja alcançado. Um enriquecimento de partículas virais deve ocorrer em relação a amostras de controle negativas que não possuem adaptadores moleculares, como anticorpos. Pequenas quantidades de ligação inespecífica em seu controle negativo podem ocorrer raramente, no entanto, os microchips decorados com afinidade devem sempre servir para enriquecer as partículas virais. No caso do rotavírus, atualmente não há sistema genético reverso para introduzir Suas tags em proteínas capsíides como um meio de capturar diretamente complexos virais em superfícies decoradas Ni-NTA. Seus ribossomos marcados, no entanto, foram recrutados com sucesso de lises bacterianas para e-chips E decorados ni-NTA para experimentos de imagem líquida16. Assim, fornecendo evidências, embora limitadas neste ponto, para que interações biológicas nativas ocorram em células líquidas enquanto em uma coluna TEM.
O uso de detergentes, glicerol e altos níveis de sacarose deve ser evitado para imagens in situ. O uso desses reagentes criará artefatos em imagens EM que incluem excesso de borbulha e recursos silenciados em partículas, resultando em imagens de má qualidade. Se esses reagentes forem usados em preparações de vírus, a amostra pode ser dialisada em solução tampão sem esses componentes. Os dispositivos affinity capture podem suportar algum grau de detergentes por um breve período de tempo, embora isso precise ser determinado caso a caso. Consulte a lista de reagentes compatíveis descritos anteriormente22.
Para permitir rotinas de processamento de imagem a jusante, uma baixa concentração de reagente de contraste pode ser adicionada à câmara microfluidica. Este reagente não fixa amostras de proteínas, como os procedimentos tradicionais de coloração17. Para garantir que o líquido esteja presente na câmara de imagem durante todo o período de tempo dos experimentos, concentre o feixe de elétrons até que a formação da bolha ocorra(Figura 4). Esta é uma medida simples para indicar que os espécimes permanecem hidratados. As amostras líquidas encontram danos graves dentro de 2 min(Figura 4A) de exposição contínua do feixe de elétrons a 5 elétrons/Å2. Exposição contínua prolongada de feixe de elétrons por 5 min (Figura 4B) e além nesta dosagem resultará em formação excessiva de bolhas na área de imagem.
A microscopia molecular in situ usada em combinação com dispositivos Affinity Capture permite o exame de complexos biológicos em solução usando microscopia eletrônica de transmissão. Esses avanços técnicos são possíveis pelo uso de recém-desenvolvidos porta-espécimes microfluidos. Tais dispositivos empregam membranas finas de nitreto de silício para formar uma câmara de imagem microescamada. Com base no trabalho pioneiro de Parsons e colegas7-10, fornecemos uma estratégia útil para imagem de conjuntos virais individuais em solução. O protocolo aqui descrito explica metodologias compatíveis com rotinas de processamento de imagem de partículas únicas e cálculos de reconstrução 3D. Aplicações futuras resultantes do domínio dessas técnicas podem incluir imagens live-EM de macromoléculas. Prevemos que imagens in situ podem revelar etapas para montagem viral, regulação de transcrição ou invasão de células hospedeiras. Em resumo, o uso desses protocolos deve permitir que os pesquisadores investiguem processos dinâmicos em solução de forma completamente nova.
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Disclosures
A autora, Madeline J. Dukes, é funcionária da Protochips, Inc.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o Dr. Michael J. Friedlander, Diretor do Instituto de Pesquisa Virginia Tech Carilion por incentivar nossos esforços de pesquisa. Este projeto foi apoiado por fundos de desenvolvimento para S.M.M e D.F.K. e, em parte, pela iniciativa Nano-Bio do Institute for Critical Technology and Applied Science da Virginia Tech.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-chips, spacer chip | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μm x 50 μm window |
| E-chip, top chip | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μm x 50 μm window |
| Ni-NTA lipid | Avanti Polar Lipids | 790404P | Powder form |
| DLPC (12:0) lipid | Avanti Polar Lipids | 850335P | Powder form |
| Volumetric flasks | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
| Hamilton Syringes | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μl; 1-25 μl |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Glass Petri dishes | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
| Glass culture tubes | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
| Chloroform | Electron Microcopy Sciences | 12550 | 100 ml |
| His-tagged Protein A | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
| Milli-Q water system | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Ultrapure Water |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
| Equipment | |||
| Poseidon In situ specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible | |
| FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
| Eagle 2k HS CCD camera | FEI Co. | 10 Å/pixel sampling at 30,000X | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Isotemp heated stir plate | Fisher Scientific | Heat to 150 ºC for 1.5 hr |
References
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