Summary
Aquí describimos un procedimiento para obtener imágenes de complejos virales en líquido a resolución nanométrica utilizando un microscopio electrónico de transmisión.
Abstract
Los investigadores utilizan regularmente microscopios electrónicos de transmisión (MEE) para examinar las entidades biológicas y evaluar nuevos materiales. Aquí, describimos una aplicación adicional para estos instrumentos: ver conjuntos virales en un ambiente líquido. Este método emocionante y novedoso de visualizar estructuras biológicas utiliza un soporte de espécimen a base de microfluídicos recientemente desarrollado. Nuestro artículo en video demuestra cómo ensamblar y usar un soporte microfluídico para obtener imágenes de especímenes líquidos dentro de un TEM. En particular, utilizamos partículas de doble capa (DLPs) de rotavirus simios como nuestro sistema modelo. También se describen los pasos para recubrir la superficie de la cámara líquida con biopelículas de afinidad que atar DLPs a la ventana de visualización. Esto nos permite obtener imágenes de ensamblajes de una manera que es adecuada para la determinación de la estructura 3D. Por lo tanto, presentamos una primera visión de partículas subvirales en un ambiente líquido nativo.
Introduction
Un objetivo común de los biólogos e ingenieros es comprender el funcionamiento interno de las máquinas moleculares. Los microscopios electrónicos de transmisión (TEMs) son instrumentos ideales para visualizar estos intrincados detalles a una resolución casi atómica1-2. Con el fin de sostener el sistema de alto vacío de un TEM, las muestras biológicas se incrustan típicamente en películas delgadas de hielo vítreo3,azúcares4,sales de metales pesados5,o alguna combinación de las mismas6. Como resultado, las imágenes de especímenes incrustados pueden revelar sólo instantáneas limitadas de procesos dinámicos.
Los primeros intentos de mantener las muestras biológicas hidratadas en cámaras líquidas ambientales fueron llevados a cabo por Parsons y sus colegas utilizando etapas de bombeo diferencial. Los patrones de difracción de electrones de cristales de catalasa no manchados se registraron con éxito a una resolución de 3 Å en un estado hidratado7-8. Además, los dominios lipídicos separados por fases podrían examinarse en membranas hidratadas de eritrocitos humanos9-10. Sin embargo, el movimiento causado por la difusión de líquido y su interferencia con el haz de electrones, dio lugar a una severa pérdida de resolución y otros experimentos con especímenes biológicos no se intentaron hasta hace poco.
Se han introducido soportes de muestras microfluídicas recientemente desarrollados que utilizan microchips semiconductores para formar una cámara ambiental microescala. Estos dispositivos pueden mantener las muestras en líquido mientras se colocan en una columna TEM11-12. Este avance técnico en la imagen TEM ha permitido a los investigadores ver, por primera vez, eventos progresivos a nivel molecular13. Nos referimos a esta nueva modalidad como "microscopía molecularin situ" ya que los experimentos ahora se pueden realizar "dentro" de la columna EM14-15. El objetivo general de este método es obtener imágenes de ensamblajes biológicos en líquido para observar sus comportamientos dinámicos a resolución nanométrica. La razón detrás de la técnica desarrollada es registrar observaciones en tiempo real y examinar las nuevas propiedades de la maquinaria biológica en solución. Esta metodología amplía el uso de los TEM para fines más amplios en biología celular y molecular12-16.
En el artículo de video actual, presentamos un protocolo completo para ensamblar y usar un soporte de muestra microfluídico disponible comercialmente. Estos soportes especializados utilizan microchips de nitruro de silicio producidos con espaciadores integrados para formar una cámara líquida que encierra volúmenes minúsculos de solución. Las ventanas delgadas y transparentes se graban en los microchips con fines de imagen12. Se demuestra el uso adecuado de un soporte microfluídico para examinar las partículas de doble capa de rotavirus simios (DLPs) en líquido utilizando un TEM. Para garantizar que los ensamblajes biológicos, como los DLPs, no se difundan rápidamente a grandes distancias durante la obtención de imágenes, empleamos el enfoque affinity capture para atarlos a la superficie de la cámara microfluídica16. Este paso de captura molecular tiene una gran ventaja sobre las técnicas alternativas para la obtención de imágenes de especímenes biológicos en líquido, ya que permite la adquisición de imágenes que se utilizarán para las rutinas de procesamiento aguas abajo. Este paso de captura utilizado en conjunción con imágenes microfluídicas es exclusivo de nuestros procedimientos17. Los lectores que emplean aplicaciones de biología estructural utilizando TEM o cámaras de imágenes microfluídicas pueden considerar el uso de técnicas de captura de afinidad cuando las observaciones dinámicas a nivel molecular son el objetivo final.
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Protocol
1. Preparar dispositivos de captura de afinidad16
- Limpie los E-chips de nitruro de silicio incubando en 15 ml de acetona durante 2 min seguidos de 15 ml de metanol durante 2 min(Figura 1A). Deje que las virutas se sequen bajo el flujo de aire laminar.
- Incube las virutas secas en una placa de agitación calentada (sin agitar) durante 1,5 horas a 150 °C, luego déjenlas enfriar a temperatura ambiente antes de usarlas.
- Utilice jeringas Hamilton para componer mezclas de lípidos en pequeños tubos de vidrio para contener 25% de cloroformo, 55% dlpc (1,2-dilauroil-fosfocolina) en cloroformo (1 mg/ml) y 20% de lípidos de Ni-NTA (1,2-dioleoil-iminodiacéctico ácido-succinil-níquel sal) en cloroformo (1 mg/ml) para un volumen total de 40 μl.
- Aplicar una alícuota de 1 μl de la mezcla sobre cada gota de 15 μl de agua Milli-Q en un trozo de Parafilm en una placa de Petri húmeda (Figura 1B). Incubar muestras sobre hielo durante al menos 60 min.
2. Capturar macromoléculas17
- Coloque un E-chip con un espaciador integrado de 150 nm encima de una muestra de monocapa e incube durante 1 min (Figura 1C).
- Levante suavemente el chip de la muestra y agregue una alícuota de 3 μl de proteína A etiquetada por His. Incubar durante 1 minuto a temperatura ambiente (Figura 1D).
- Elimine el exceso de gota usando Whatman #1 papel de filtro y agregue inmediatamente una alícuota de 3 μl de solución de anticuerpos. Incubar durante 1 min a temperatura ambiente.
- Retire el exceso de solución con una jeringa Hamilton y agregue inmediatamente una alícuota de 1 μl de DLPs de rotavirus (0,1 mg/ml) en una solución tampón que contenga 50 mM de HEPES (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2 y 10 mM de CaCl2. Incubar durante al menos 2 min a temperatura ambiente. La preparación de dlps se ha descrito previamente18.
3. Montar la cámara microfluídica y cargar el soporte de muestras in situ
- Cargue el E-chip húmedo que contiene la muestra viral en la punta del soporte de la muestra microfluídica. Descarga incandescente de un segundo E-chip plano durante 1 min y luego cargado en la parte superior del chip espaciador(Figura 2, paneles 1-5).
- Alternativamente, para aumentar el contraste de las macromoléculas biológicas, se puede agregar una mancha de metal pesado(por ejemplo, formiato de uranilo al 0,2%) a los especímenes húmedos antes de colocar el segundo chip E en el espécimen húmedo. Sin embargo, el chip E que contiene la muestra deberá lavarse con agua Milli-Q antes de agregar el reactivo de contraste.
- Sándwich de todo el conjunto juntos para formar un recinto sellado, mantenido en su lugar mecánicamente dentro del soporte por 3 tornillos de latón(Figura 2,paneles 6-8).
- Después del montaje, la punta del soporte se bombea a 10-6 Torr utilizando una estación de bombeo seco turbobombada antes de colocar el soporte dentro del TEM.
4. Imágenes en líquido usando un microscopio electrónico de transmisión
- Cargue el soporte de la muestra in situ en un microscopio electrónico de transmisión (FEI Company) equipado con un filamento LaB6 y funcionando a 120 kV.
- Encienda el filamento TEM y ajuste la altura eucéntrica de la etapa del microscopio con respecto a la muestra utilizando la función wobbler para inclinar la muestra de -15° a +15° hacia adelante y hacia atrás en la columna. Este procedimiento ajusta la etapa en la dirección z para ayudar a tener en cuenta el espesor adecuado de la cámara de líquido. Este paso también garantiza que se utilice una ampliación precisa al grabar imágenes.
- Grabe primero imágenes a lo largo de los bordes y en las regiones de las esquinas de la cámara microfluídica. Estas áreas suelen contener la solución más delgada. Registre imágenes de especímenes en condiciones de dosis bajas (1-3electrones/Å 2)utilizando una cámara CCD. Utilice aumentos nominales de 6,000X - 30,000X.
- Determine el valor de desenfoque adecuado enfocando en el borde de la cámara fluic. Utilice un valor de -1,5 μm para grabar imágenes con un aumento de 30.000X. Si se encuentra una solución gruesa o si no se utiliza el agente de contraste en la preparación de la muestra, utilice valores de desenfoque más altos en el rango de -2 a -4 μm.
- Para asegurarse de que la solución está contenida en la cámara microfluídica a lo largo de los experimentos, enfoque el haz de electrones hasta que se formen las burbujas en el líquido dentro del dispositivo.
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Representative Results
Las imágenes representativas de DLPs en líquido utilizando E-chips que fueron descargados por resplandor (Figura 3A) muestran menos DLPs en un área de visualización dada, presumiblemente debido a la difusión, en comparación con los DLPs que se enriquecen en dispositivos affinity capture (Figura 3B). La adición de formiato de uranilo en la cámara de imágenes mejora el contraste de la muestra y, por lo tanto, la visibilidad de los DLPs individuales en solución(Figura 3C,panel superior). Un mejor contraste permite el procesamiento de imágenes aguas abajo, como el promedio de partículas(Figura 3C,panel inferior) y las rutinas de reconstrucción 3D(Figura 3C,recuadro) como se describió anteriormente17. Brevemente, para la reconstrucción 3D seleccionamos 600 partículas de DLPs utilizando el paquete de software SPIDER19. Las partículas seleccionadas se refinaron contra un modelo inicial del rotavirus DLP20 que se filtró a una resolución de 80 Å. Utilizamos el paquete de software RELION21 para calcular una reconstrucción 3D a una resolución de aproximadamente 25 Å. Nuestro mapa 3D en buena concordancia con el modelo inicial y con una reconstrucción crio-EM independiente que se calculó utilizando los mismos parámetros y dlp muestra17.
Figura 1. Preparación de microchips de nitruro de silicio para imágenes líquidas. A)Los microchips de nitruro de silicio se limpian sumergiendo durante 2 min en acetona seguido de 2 min en metanol para eliminar el fotorresistentes residuales utilizados en el proceso de fabricación. B)Las muestras de monocapa lipídica se preparan sobre gotas de agua Milli-Q añadidas a Parafilm en una placa de Petri húmeda17. C)Los microchips limpiados se colocan encima de las monocapas y se retiran después de un paso de incubación de 1 min. D)Los adaptadores moleculares(es decir, la proteína A y los anticuerpos en solución) se añaden directamente a los chips recubiertos de monocapa y el exceso de solución se elimina antes de añadir DLPs. El chip de muestra húmeda se carga en el soporte microfluídico.
Figura 2. Montaje de la cámara líquida de un soporte de muestra microfluídica. La punta de la cámara de la muestra se ensambla agregando accesorios de anillos tóricas a la punta vacía (pasos 1-2). El chip de muestra húmeda que contiene espaciadores integrados se coloca suavemente en los accesorios mecanizados dentro de la punta del soporte (pasos 3-4). Un chip plano con descarga de resplandor se coloca sobre la parte superior del chip de la muestra (paso 5). El conjunto se cubre con una placa frontal de metal(paso 6)que se mantiene en su lugar mediante 3 tornillos de latón (pasos 7-8).
Figura 3. Resultados representativos para DLPs en líquido. A)Los microchips descargados por resplandor se unen a muy pocos DLPs en solución en comparación con los microchips decorados por afinidad(B). Barras de escala, 2 μm. C)Imagen representativa (panel superior) y reconstrucción 3D (inserto) de DLPs en reactivo de contraste que contiene líquido. Barra de escala, 150 nm. El diámetro de la reconstrucción es de 80 nm. Los promedios de clase de los DLPs en líquido (panel inferior) revelan características bien definidas a lo largo de su superficie exterior. Los paneles individuales son de 110 nm.
Figura 4. Resultados representativos para la formación de burbujas en especímenes líquidos en el TEM. Imágenes de burbujas formadas en especímenes líquidos tras la exposición continua del haz de electrones a 5electrones/Å 2 durante aproximadamente 2 min(A)y 5 min(B). La barra de escala es de 100 nm.
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Discussion
En nuestro trabajo presentado, empleamos el acercamiento de la captura de la afinidad a la correa rotavirus DLPs a una plataforma microfluidic. Esto permitió la proyección de imagen in situ de complejos macromoleculares en un microambiente líquido. El enfoque de captura es significativo con respecto a otras técnicas de imagen microfluídicas porque localiza especímenes biológicos a la ventana de imágenes para negar los grandes problemas difusivos que surgen al grabar imágenes en líquido. Sin embargo, uno de los pasos más críticos en nuestro protocolo implica la transferencia de la biopelícula lipídica a la superficie del microchip. Si la monocapa lipídica no se extiende uniformemente sobre la red, esto resultará en un experimento defectuoso. Una indicación de un paso de transferencia pobre es que poco o ningún conjunto viral se une al chip fluítico. Una limitación en la etapa de transferencia es la estabilidad térmica en relación con la fluidez de la capa lipídica. Si la etapa de transferencia es inadecuada, evaluada por la dispersión desigual de la gota, las capas lipídicas deben incubarse en el hielo durante más tiempo o en una cámara frigorífica libre de vibraciones. Además, la placa de Petri debe estar sellada adecuadamente con Parafilm para mantener la humedad adecuada.
Un exceso de complejos virales o proteínas adaptadoras en las muestras de microchip puede conducir a un agrupamiento excesivo de las partículas. Esta es una limitación en el protocolo que se puede administrar fácilmente. Para minimizar el efecto de agrupamiento, los factores proteicos se pueden incubar durante un período de tiempo más corto o la muestra del virus debe diluirse aún más. Si se detecta un exceso de proteínas inespecíficas, la inclusión de imidazol recién preparado (aproximadamente 50 mM) en la solución tampón puede disminuir el fondo. El uso de imidazol fresco es un paso crucial en el protocolo. Del mismo modo, no sobrecargue los chips con proteínas purificadas, ya que esto no asegurará una unión específica y dará lugar a un experimento defectuoso. Las imágenes contendrán un exceso de proteínas de fondo y no serán adecuadas para las rutinas de procesamiento aguas abajo. Un rango de concentración óptimo para las proteínas purificadas es de aproximadamente 0.01-0.1 mg / ml. Sin embargo, si este rango no proporciona el nivel previsto de partículas, la concentración de la muestra debe aumentarse hasta que se haya alcanzado un nivel óptimo. Debe producirse un enriquecimiento de partículas virales con respecto a las muestras de control negativas que carecen de adaptadores moleculares, como los anticuerpos. Pequeñas cantidades de unión inespecífica en su control negativo pueden ocurrir con poca frecuencia, sin embargo, los microchips decorados por afinidad siempre deben servir para enriquecer las partículas virales. En el caso del rotavirus, actualmente no existe un sistema genético inverso para introducir sus etiquetas en las proteínas de la cápside como un medio para capturar directamente los complejos virales en las superficies decoradas con Ni-NTA. Los ribosomas marcados con his, sin embargo, han sido reclutados con éxito a partir de lisos bacterianos en E-chips decorados con Ni-NTA para experimentos de imágenes líquidas16. Por lo tanto, proporciona evidencia, aunque limitada en este punto, de que las interacciones biológicas nativas ocurran en células líquidas mientras se encuentran en una columna TEM.
El uso de detergentes, glicerol y altos niveles de sacarosa debe evitarse para la toma de imágenes in situ. El uso de estos reactivos creará artefactos en imágenes EM que incluyen características excesivas de burbujeo y silenciadas en partículas, lo que resulta en imágenes de mala calidad. Si estos reactivos se utilizan en preparaciones de virus, la muestra se puede dializado en una solución tampón que carece de estos componentes. Los dispositivos affinity capture pueden soportar cierto grado de detergentes durante un breve período de tiempo, aunque esto debe determinarse caso por caso. Consulte la lista de reactivos compatibles descrita anteriormente22.
Para habilitar las rutinas de procesamiento de imágenes aguas abajo, se puede agregar una baja concentración de reactivo de contraste a la cámara microfluídica. Este reactivo no fija muestras de proteínas, como los procedimientos tradicionales de tinción17. Para asegurarse de que el líquido está presente en la cámara de imágenes durante todo el tiempo y el curso de los experimentos, enfoque el haz de electrones hasta que se produzca la formación de burbujas (Figura 4). Esta es una medida sencilla para indicar que los ejemplares permanecen hidratados. Las muestras líquidas encuentran daños graves dentro de los 2 min(Figura 4A)de la exposición continua del haz de electrones a 5 electrones/Å2. La exposición prolongada al haz de electrones continuo durante 5 min(Figura 4B)y más allá en esta dosis dará lugar a una formación excesiva de burbujas en el área de imágenes.
La microscopia molecular in situ usada conjuntamente con los dispositivos de la captura de la afinidad permite la examinación de complejos biológicos en solución usando microscopia electrónica de transmisión. Estos avances técnicos son posibles gracias al uso de soportes de muestras microfluídicas recientemente desarrolladas. Tales dispositivos emplean membranas delgadas de nitruro de silicio para formar una cámara de imágenes a microescala. Basándonos en el trabajo pionero de Parsons y sus colegas7-10, proporcionamos una estrategia útil para obtener imágenes de ensamblajes virales individuales en solución. El protocolo descrito aquí explica metodologías que son compatibles con rutinas de procesamiento de imágenes de una sola partícula y cálculos de reconstrucción 3D. Las aplicaciones futuras que resultarán del dominio de estas técnicas pueden incluir imágenes en vivo em de macromoléculas. Anticipamos que la proyección de imagen in situ puede revelar los pasos para la asamblea viral, la regulación de la transcripción o la invasión de la célula huesped. En resumen, el uso de estos protocolos debería permitir a los investigadores investigar los procesos dinámicos en solución de una manera completamente nueva.
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Disclosures
La autora, Madeline J. Dukes, es empleada de Protochips, Inc.
Acknowledgments
Los autores reconocen al Dr. Michael J. Friedlander, Director del Virginia Tech Carilion Research Institute por alentar nuestros esfuerzos de investigación. Este proyecto fue apoyado por fondos de desarrollo para S.M.M y D.F.K. y en parte por la iniciativa Nano-Bio del Instituto de Tecnología Crítica y Ciencia Aplicada de Virginia Tech.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-chips, spacer chip | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μm x 50 μm window |
| E-chip, top chip | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μm x 50 μm window |
| Ni-NTA lipid | Avanti Polar Lipids | 790404P | Powder form |
| DLPC (12:0) lipid | Avanti Polar Lipids | 850335P | Powder form |
| Volumetric flasks | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
| Hamilton Syringes | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μl; 1-25 μl |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Glass Petri dishes | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
| Glass culture tubes | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
| Chloroform | Electron Microcopy Sciences | 12550 | 100 ml |
| His-tagged Protein A | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
| Milli-Q water system | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Ultrapure Water |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
| Equipment | |||
| Poseidon In situ specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible | |
| FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
| Eagle 2k HS CCD camera | FEI Co. | 10 Å/pixel sampling at 30,000X | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Isotemp heated stir plate | Fisher Scientific | Heat to 150 ºC for 1.5 hr |
References
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