Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

In situ TEM för biologiska sammansättningar i vätska

Published: December 30, 2013 doi: 10.3791/50936
Automatic Translation
*1, *2, *2, 2, 2
1Applications Science, Protochips, Inc., 2Virginia Tech Carilion Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

Här beskriver vi en procedur för att avbilda virala komplex i vätska vid nanometerupplösning med hjälp av ett transmissionselektronmikroskop.

Abstract

Forskare använder regelbundet Transmission Electron Microscopes (TEMs) för att undersöka biologiska enheter och för att bedöma nya material. Här beskriver vi ytterligare en applikation för dessa instrument - visning av virusenheter i en flytande miljö. Denna spännande och nya metod för att visualisera biologiska strukturer använder en nyligen utvecklad mikrofluidisk-baserad provhållare. Vår videoartikel visar hur man monterar och använder en mikrofluidisk hållare för att avbilda flytande exemplar inom en TEM. I synnerhet använder vi simian rotavirus dubbelskiktade partiklar (DLPs) som vårt modellsystem. Vi beskriver också steg för att täcka ytan på vätskekammaren med affinitetsbiofilmer som tjudrar DLPs till visningsfönstret. Detta gör det möjligt för oss att avbilda sammansättningar på ett sätt som är lämpligt för 3D-strukturbestämning. Således presenterar vi en första glimt av subvirala partiklar i en inhemsk flytande miljö.

Introduction

Ett gemensamt mål för biologer och ingenjörer är att förstå molekylära maskiners inre arbete. Transmission Electron Microscopes (TEMs) är idealiska instrument för att visualisera dessa invecklade detaljer med nära atomupplösning1-2. För att upprätthålla det höga vakuumsystemet hos en TEM är biologiska prover vanligtvis inbäddade i tunna filmer av glaskroppsis3,sockerarter 4, tungmetallsalter5, eller någon kombination därav6. Som ett resultat kan bilder av inbäddade exemplar avslöja endast begränsade ögonblicksbilder av dynamiska processer.

Tidiga försök att upprätthålla biologiska exemplar hydratiserade i miljö flytande kammare genomfördes av Parsons och kollegor med hjälp av differentialpumpningssteg. Elektron diffraktion mönster av osedd katalas kristaller registrerades framgångsrikt till en upplösning av 3 Å i ett hydratiserat tillstånd7-8. Dessutom kunde fasavskilda lipiddomäner undersökas i hydratiserade membran av mänskliga erytrocyter9-10. Rörelse orsakad av diffus vätska och dess interferens med elektronstrålen resulterade dock i allvarlig upplösningsförlust och ytterligare experiment med biologiska prover försöktes inte förrän nyligen.

Nyutvecklade mikrofluidiska provhållare har introducerats som använder halvledarmikrochips för att bilda en mikroskalad miljökammare. Dessa anordningar kan hålla prover i vätska medan de placeras i en TEM-kolumn11-12. Detta tekniska genombrott inom TEM-avbildning har gjort det möjligt för forskare att för första gången se progressiva händelser på molekylär nivå13. Vi hänvisar till denna nya modalitet som "in situ molekylär mikroskopi " eftersom experiment nu kan utföras "inuti"EM-kolumnen 14-15. Det övergripande målet med denna metod är att avbilda biologiska enheter i vätska för att observera deras dynamiska beteenden vid nanometerupplösning. Logiken bakom den utvecklade tekniken är att registrera realtidsobservationer och undersöka nya egenskaper hos biologiska maskiner i lösning. Denna metod utökar användningen av TEMs för bredare ändamål inom cellulär och molekylärbiologi12-16.

I den aktuella videoartikeln presenterar vi ett omfattande protokoll för att montera och använda en kommersiellt tillgänglig mikrofluidisk provhållare. Dessa specialiserade hållare använder kiselnitridmikrochips som produceras med integrerade distanser för att bilda en vätskekammare som omsluter minimala volymer lösning. Tunna, genomskinliga fönster etsas in i mikrochipsen för bildändamål12. Vi visar korrekt användning av en mikrofluidisk hållare för att undersöka simian rotavirus dubbelskiktade partiklar (DLPs) i vätska med hjälp av en TEM. För att säkerställa att biologiska enheter, såsom DLPs, inte snabbt sprids över stora avstånd under avbildning, använder vi Affinity Capture-metoden för att binda dem till ytan av den mikrofluidiskakammaren 16. Detta molekylära fångststeg har en stor fördel jämfört med alternativa tekniker för avbildning av biologiska exemplar i vätska eftersom det möjliggör förvärv av bilder som kommer att användas för bearbetningsrutiner nedströms. Detta fångststeg som används tillsammans med mikrofluidisk avbildning är unikt för våra procedurer17. Läsare som använder strukturbiologiska applikationer med hjälp av TEM eller mikrofluidiska bildkammare kan överväga användningen av affinitetsfångsttekniker när dynamiska observationer på molekylär nivå är slutmålet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förbered affinitetsfångstenheter16

  1. Rengör silikonnitriden E-chips genom att inkubera dem i 15 ml aceton i 2 minuter följt av 15 ml metanol i 2 min (figur 1A). Låt spånorna torka under laminärt luftflöde.
  2. Inkubera de torkade spånorna på en uppvärmd omrörningsplatta (utan omrörning) i 1,5 timmar vid 150 °C och låt dem sedan svalna till rumstemperatur före användning.
  3. Använd Hamilton sprutor för att komponera lipidblandningar i små glasrör för att innehålla 25% kloroform, 55% DLPC (1,2-dilauroyl-fosfokolin) i kloroform (1 mg/ml) och 20% Ni-NTA lipid (1,2-dioleoyl-iminodiacetic acid-succinyl-nickel salt) i kloroform (1 mg/ml) för en total volym på 40 μl.
  4. Applicera en 1 μl alikvot av blandningen över varje 15 μl droppe Milli-Q-vatten på en bit Parafilm i en fuktig petriskål (Figur 1B). Inkubera prover på is i minst 60 minuter.

2. Fånga makromolekyler17

  1. Placera ett E-chip med en 150 nm integrerad distans ovanpå ett monoskiktsprov och inkubera i 1 min(bild 1C).
  2. Lyft försiktigt av chippet från provet och tillsätt en 3 μl alikvot av hans märkta protein A. Inkubera i 1 minut vid rumstemperatur (figur 1D).
  3. Fläcka bort överskottsdroppen med Whatman #1 filterpapper och tillsätt omedelbart en 3 μl alikvot antikroppslösning. Inkubera i 1 minut vid rumstemperatur.
  4. Ta bort överskottslösningen med en Hamilton-spruta och tillsätt omedelbart en 1 μl alikvot rotavirus DLPs (0,1 mg/ml) i buffertlösning som innehåller 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 och 10 mM CaCl2. Inkubera i minst 2 minuter vid rumstemperatur. Utarbetandet av DLPs har beskrivits tidigare18.

3. Montera mikrofluidkammaren och lasta in situ-provhållaren

  1. Ladda det våta E-chipet som innehåller virusprovet i spetsen på den mikrofluidiska provhållaren. Glödurladdning ett andra platt E-chip i 1 min och laddas sedan ovanpå distanschipet(bild 2, panel 1-5).
  2. Alternativt, för att öka kontrasten mellan biologiska makromolekyler, kan tungmetallfläck(t.ex. 0,2% uranylformat) tillsättas våta exemplar innan det andra E-chipet placeras på våtprovet. E-chippet som innehåller provet måste dock tvättas med Milli-Q-vatten innan kontrastreagenset tillsätts.
  3. Sandwich hela enheten tillsammans för att bilda ett förseglat hölje, som hålls mekaniskt inuti hållaren med 3 mässingsskruvar (Figur 2,paneler 6-8).
  4. Efter montering pumpas hållarens spets till 10-6 Torr med hjälp av en turbopumpad torrpumpstation innan hållaren placeras inuti TEM.

4. Avbildning i vätska med hjälp av ett transmissionselektronmikroskop

  1. Ladda in situ-provhållaren i ett transmissionselektronmikroskop (FEI Company) utrustat med en LaB6-glödtråd och som arbetar vid 120 kV.
  2. Slå på TEM-glödtråden och justera mikroskopets eucentriska höjd med avseende på provet genom att använda wobblerfunktionen för att luta provet från -15° till +15° fram och tillbaka i kolonnen. Denna procedur justerar scenen i z-riktningen för att hjälpa till att ta hänsyn till den korrekta tjockleken på vätskekammaren. Det här steget säkerställer också att en korrekt förstoring används när du spelar in bilder.
  3. Spela in bilder längs kanterna och i hörnregionerna i den mikrofluidiska kammaren först. Dessa områden innehåller vanligtvis den tunnaste lösningen. Spela in bilder av prover under lågdosförhållanden (1-3 elektroner/Å2) med hjälp av en CCD-kamera. Använd nominella förstoringar på 6 000X - 30 000X.
  4. Bestäm rätt defokuseringsvärde genom att fokusera vid kanten av vätskekammaren. Använd värdet -1,5 μm för att spela in bilder vid 30 000X förstoring. Om tjock lösning påträffas eller om kontrastmedel inte används i provberedningen, använd högre defokusvärden i intervallet -2 till -4 μm.
  5. För att säkerställa att lösningen finns i den mikrofluidiska kammaren under hela experimenten, fokusera elektronstrålen tills bubblorna bildas i vätskan i enheten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representativa bilder av DLPs i vätska med E-chips som var glödfria (Figur 3A) visar färre DLPs i ett visst visningsområde, förmodligen på grund av diffusion, i jämförelse med DLPs som är berikade på Affinity Capture-enheter (Figur 3B). Tillsats av uranylformat i bildkammaren förstärker provexemplarets kontrast och därmed synligheten hos enskilda DLPs i lösning(figur 3C, övre panelen). Bättre kontrast möjliggör nedströms bildbehandling som partikelgenomsnitt(figur 3C,bottenpanelen) och 3D-rekonstruktionsrutiner(figur 3C,inset) som tidigare beskrivits17. Kort, för 3D-rekonstruktionen valde vi 600 partiklar av DLPs med hjälp av SPIDER-programvarupaketet19. Utvalda partiklar förfinades mot en första modell av rotaviruset DLP20 som filtrerades till 80 Å-upplösning. Vi använde RELION mjukvarupaket21 för att beräkna en 3D-rekonstruktion med en upplösning på cirka 25 Å. Vår 3D-karta i god överenskommelse med den ursprungliga modellen och med en oberoende cryo-EM-rekonstruktion som beräknades med samma parametrar och DLP-prov17.

Figure 1
Figur 1. Förbereder mikrochips av kiselnitrid för flytande avbildning. A) Mikrochips av kiselnitrid rengörs genom nedsänkning i 2 min i aceton följt av 2 min i metanol för att avlägsna restfotoresist som används i tillverkningsprocessen. B) Lipid monolayer prover bereds på droppar Milli-Q vatten som tillsätts Parafilm i en fuktig Petri skål17. C) Rengjorda mikrochips placeras ovanpå monoskikten och avlägsnas efter ett 1 min inkubationssteg. D) Molekylära adaptrar (dvs. protein A och antikroppar i lösningen) tillsätts direkt till monoskiktsbelagda spånoch överskottslösningen avlägsnas innan DLPs tillsätts. Det våta provchipet laddas sedan i mikrofluidhållaren.

Figure 2
Figur 2. Montering av vätskekammaren på en mikrofluidisk provhållare. Provkammarens spets monteras genom att O-ringbeslag tillsätts på den tomma spetsen (steg 1-2). Det våta provchipet som innehåller integrerade distanser placeras försiktigt i de bearbetade kopplingarna i hållarens spets (steg 3-4). Ett glödurladdningschip placeras ovanpå provchipet (steg 5). Monteringen är sedan täckt med en ansiktsplatta av metall(steg 6)som hålls på plats av 3 mässingsskruvar (steg 7-8).

Figure 3
Figur 3. Representativa resultat för DLPs i vätska. A) Glödurladdningsfria mikrochips binder mycket få DLPs i lösning i jämförelse med affinitetsdekorerade mikrochips (B). Skalstänger, 2 μm. C) Representativ bild (övre panelen) och 3D-rekonstruktion (inset) av DLPs i vätska som innehåller kontrastreagens. Skalstång, 150 nm. Rekonstruktionens diameter är 80 nm. Klassgenomsnitt för DLPs i vätska (bottenpanelen) avslöjar snyggt definierade funktioner längs deras yttre yta. Enskilda paneler är 110 nm.

Figure 4
Figur 4. Representativa resultat för bubbelbildning i flytande exemplar i TEM. Bilder av bubblor som bildas i flytande exemplar vid kontinuerlig exponering av elektronstrålen vid 5 elektroner/Å2 i cirka 2 min(A)och 5 min (B). Skalstången är 100 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I vårt presenterade arbete använde vi affinitetsfångstmetoden för att tjuder rotavirus DLPs till en mikrofluidisk plattform. Detta möjliggde in situ imaging av makromolekylära komplex i en flytande mikromiljö. Fångstmetoden är signifikant med avseende på andra mikrofluidiska avbildningstekniker eftersom den lokaliserar biologiska prover till bildfönstret för att förneka stora diffusiva problem som uppstår när man registrerar bilder i vätska. Ett av de mest kritiska stegen i vårt protokoll är dock överföringen av lipidbiofilmen till mikrochipytan. Om lipidmonaggaren misslyckas med att sprida sig jämnt över gallret kommer detta att resultera i ett felaktigt experiment. En indikation på ett dåligt överföringssteg är att små eller inga virusenheter kommer att bindas till det fluidiska chipet. En begränsning i överföringssteget är termisk stabilitet när det gäller lipidskiktens fluiditet. Om överföringssteget är otillräckligt, vilket bedöms genom ojämn spridning av droppen, bör lipidskikten inkubera på is längre eller i ett vibrationsfritt kylrum. Petriskålen måste också förseglas tillräckligt med Parafilm för att upprätthålla rätt fuktighet.

Ett överskott av viruskomplex eller adaptorproteiner i mikrochipproverna kan leda till överdriven klustring av partiklarna. Detta är en begränsning i protokollet som enkelt kan hanteras. För att minimera klustringseffekten kan proteinfaktorerna inkuberas under en kortare tidsperiod eller virusprovet spädas ut ytterligare. Om ett överskott av ospecificerade proteiner upptäcks kan införandet av nylagad imidazol (cirka 50 mM) i buffertlösningen minska bakgrunden. Användningen av färsk imidazol är ett avgörande steg i protokollet. På samma sätt överbelasta inte chipsen med renade proteiner eftersom detta inte kommer att säkerställa specifik bindning och resultera i ett bristfälligt experiment. Bilder kommer att innehålla ett överskott av bakgrundsproteiner och kommer inte att vara lämpliga för bearbetningsrutiner nedströms. Ett optimalt koncentrationsområde för renade proteiner är ungefär 0,01-0,1 mg/ml. Om detta intervall inte ger den förväntade nivån av partiklar bör dock koncentrationen av provet ökas tills en optimal nivå har uppnåtts. En anrikning av viruspartiklar bör ske med avseende på negativa kontrollprover som saknar molekylära adaptrar, såsom antikroppar. Små mängder ospecificerad bindning i din negativa kontroll kan sällan uppstå, men de affinitetsdekorerade mikrochipsen bör alltid tjäna till att berika viruspartiklarna. När det gäller rotavirus finns det för närvarande inget omvändt genetiskt system för att introducera hans taggar i kapsejsade proteiner som ett sätt att direkt fånga viruskomplex på Ni-NTA-dekorerade ytor. Hans märkta ribosomer har dock framgångsrikt rekryterats från bakterielyssnater till Ni-NTA-dekorerade E-chips för flytande bildexperiment16. Således ger bevis, om än begränsade vid denna tidpunkt, för inhemska biologiska interaktioner att uppstå i flytande celler medan i en TEM kolumn.

Användning av tvättmedel, glycerol och höga halter av sackaros måste undvikas för in situ-avbildning. Användningen av dessa reagenser kommer att skapa artefakter i EM-bilder som inkluderar överdriven bubblande och dämpade funktioner i partiklar, vilket resulterar i bilder av dålig kvalitet. Om dessa reagenser används i viruspreparat kan provet dialyseras till buffertlösning som saknar dessa komponenter. Affinity Capture-enheter kan motstå en viss grad av tvättmedel under en kort tidsperiod, även om detta måste bestämmas från fall till fall. Se listan över kompatibla reagenser som tidigare beskrivits22.

För att möjliggöra nedströms bildbehandlingsrutiner kan en låg koncentration av kontrastreagens läggas till mikrofluidkammaren. Detta reagens fixar inte proteinprover, som traditionella färgningsprocedurer17. För att säkerställa att vätska finns i bildkammaren under hela experimentens tidsföring, fokusera elektronstrålen tills bubbelbildning sker (figur 4). Detta är ett enkelt mått för att indikera att proverna förblir hydratiserade. Flytande exemplar får allvarliga skador inom 2 min (figur 4A) av kontinuerlig exponering av elektronstrålen vid 5 elektroner/Å2. Långvarig kontinuerlig exponering av elektronstrålen i 5 min (figur 4B) och därefter vid denna dos kommer att resultera i överdriven bubbelbildning i bildområdet.

In situ molekylär mikroskopi som används i kombination med Affinity Capture enheter tillåter undersökning av biologiska komplex i lösning med hjälp av transmission elektronmikroskopi. Dessa tekniska framsteg görs möjliga genom användning av nyutvecklade mikrofluidiska provhållare. Sådana anordningar använder tunna kiselnitridmembran för att bilda en mikroskalad bildkammare. Med hjälp av Parsons och kollegornasbanbrytande arbete 7-10 tillhandahåller vi en användbar strategi för att avbilda enskilda virusenheter i lösning. Protokollet som beskrivs här förklarar metoder som är kompatibla med enskilda partikel bild bearbetning rutiner och 3D återuppbyggnad beräkningar. Framtida applikationer som kommer att bli resultatet av att behärska dessa tekniker kan inkludera live-EM-avbildning av makromolekyler. Vi förväntar oss in situ imaging kan avslöja steg för viral montering, transkription reglering eller värd cell invasion. Sammanfattningsvis bör användningen av dessa protokoll göra det möjligt för forskare att undersöka dynamiska processer i lösning på ett helt nytt sätt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författaren Madeline J. Dukes är anställd av Protochips, Inc.

Acknowledgments

Författarna erkänner Dr. Michael J. Friedlander, chef för Virginia Tech Carilion Research Institute för att uppmuntra våra forskningsbesparare. Detta projekt stöddes av utvecklingsfonder till S.M.M och D.F.K. och delvis av Nano-Bio-initiativet från Institute for Critical Technology and Applied Science vid Virginia Tech.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E-chips, spacer chip Protochips, Inc. EPB-52TBD 400 μm x 50 μm window
E-chip, top chip Protochips, Inc. EPT-45W 400 μm x 50 μm window
Ni-NTA lipid Avanti Polar Lipids 790404P Powder form
DLPC (12:0) lipid Avanti Polar Lipids 850335P Powder form
Volumetric flasks  Fisher Scientific 20-812A; 20-812C 1 ml; 5 ml 
Hamilton Syringes Hamilton Co. 80300, 80400 1-10 μl; 1-25 μl
Whatman #1 filter paper Whatman 1001 090 100 pieces, 90 mm
Glass Petri dishes Corning 70165-101 100 mm x 15 mm
Glass Pasteur pipettes VWR 14673-010 14673-010
Glass culture tubes VWR 47729-566 6 mm x 50 mm
Acetone Fisher Scientific A11-1 1 L
Methanol Fisher Scientific A412-1 1 L
Chloroform  Electron Microcopy Sciences 12550 100 ml 
His-tagged Protein A Abcam, Inc. ab52953 10 mg
Milli-Q water system EMD Millipore Corp. Z00QSV001 Ultrapure Water
HEPES Fisher Scientific BP310-500 500 g
Equipment 
Poseidon In situ specimen holder Protochips, Inc.  FEI compatible
FEI Spirit BioTwin TEM FEI Co. 120 kV
Eagle 2k HS CCD camera FEI Co. 10 Å/pixel sampling at 30,000X
Gatan 655 Dry pump station Gatan, Inc. Pump holder tip to 10-6 range
PELCO easiGlow, glow discharge unit Ted Pella, Inc.  Negative polarity mode
Isotemp heated stir plate Fisher Scientific Heat to 150 ºC for 1.5 hr

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhou, Z. H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).
  2. Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Subunit interactions in bovine papillomavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).
  3. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).
  4. Unwin, P. N., Henderson, R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).
  5. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
  6. Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. Cryo-negative staining. Micron. 29, 145-160 (1998).
  7. Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186, 407-414 (1974).
  8. Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects. Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).
  9. Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184, 77-78 (1974).
  10. Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).
  11. Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
  12. Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).
  13. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
  14. Peckys, D. B., de Jonge, N. Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).
  15. Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. J. Microsc. 242, 117-123 (2011).
  16. Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).
  17. Gilmore, B. L., et al. Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere. Lab Chip. 13, 216-219 (2013).
  18. Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. Purification and characterization of bovine rotavirus cores. J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).
  19. Frank, J., et al. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).
  20. Zhang, X., et al. Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).
  21. Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).
  22. Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification. J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).

Tags

Bioengineering utgåva 82 mikrofluidik transmissionselektronmikroskopi (TEM) In situ imaging Rotavirus simian rotavirus dubbelskiktade partiklar (DLPs) 3D-strukturbestämning
<em>In situ</em> TEM för biologiska sammansättningar i vätska
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dukes, M. J., Gilmore, B. L.,… More

Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid. J. Vis. Exp. (82), e50936, doi:10.3791/50936 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter