Summary
为了阐明从局部场电位（的LFP）的复杂过渡到尖峰合适的刺激轻机械刺激外周建。作为一个应用，从躯体感觉皮层记录扣球活动由一个多目标优化策略进行了分析。结果表明，所提出的刺激是能够提供触觉刺激与毫秒和毫米精度。
Abstract
目前神经生理学的研究具有的宗旨，以制定方法，调查从神经元的信号途径神经元，即从峰值到局部场电位（的LFP）的转换和从局部区域电位尖峰。
局部区域电位有对秒杀活动的复杂的依赖，它们之间的关系仍然是了解1很差。这些信号关系的阐明将有助于双方为临床诊断（ 如刺激范式的深部脑刺激）和神经编码策略在正常和病理条件下（ 如癫痫，帕金森病，慢性疼痛）有更深的理解。到这个目的，就必须解决与刺激装置，刺激模式和计算分析的技术问题。因此，一个定制的刺激装置，以提供刺激以及调控的空间和时间，这并不在机械共振产生的开发。随后，作为一个示例，一组可靠LFP-穗关系萃取。
该设备的性能是由细胞外记录调查，共同尖峰和LFP反应施加的刺激，从大鼠初级躯体感觉皮层。然后，通过一个多目标优化策略的手段，估计基于局部区域电位的预测模型为尖峰发生。
这种模式的应用表明，该装置有足够的适合提供高频率的触觉刺激，表现优于常见的压电致动器。作为该装置的效能的证明，以下结果表示：1）磷酸锂铁的反应的时间和可靠性良好匹配穗反应，2）的LFP是对刺激敏感的历史和捕获不仅平均响应也是试验对试验的波动峰电活动，最后3）通过使用LFP信号是可能的估算范围Øf预测模型，捕捉了秒杀活动的不同方面。
Introduction
在信号的情况下处理所述脉冲响应提供了一种动力系统的行为的一个基本特征。
虽然理想的脉冲刺激几乎是无法实现的，它可以通过使用产生高频率的位移的致动器元件，以取得它的合理近似。这种类型的轻触觉振动刺激是众所周知的同时针对皮肤深层（ 如快速反应，快速适应环层小体）2和表面受体（ 如低门槛慢慢适应默克尔盘状结构）2。
电流刺激装置，主要是压电致动器，被装入许多缺点，尤其共振和小的位移。为了克服这些缺陷，另一种实现的类似脉冲刺激，提出了用钝尖（在我们的情况下，仙人掌平滑尖）垂直安装在一个中档扬声器纸盆膜中心。这提供了较大的位移和更广泛的频谱的优点。
这种装置的有效应用是局部区域电位的相关神经生理问题钉鞋依赖关系的研究。由于这些电活动之间的微妙时间关联的是需要为外设提供一个刺激的精细调节装置。刺激必须是尽可能快和空间选择性越好，以减少“背景噪音”和锐化感兴趣的信号。到这个目的，刺激装置及刺激传递协议的任务一同被优化。在本文中，我们描述了该技术，并提出了一些有代表性的结果。
基于随机配对脉冲刺激一个协议已被设计和优化，以避免习惯。这个协议提供了对经典的优点编脉冲和降低刺激和神经元活动的自发周期性脉冲串之间的杂散锁定的可能性。
通过使用这个随机配对脉冲有可能获得快速和可靠的LFP和穗反应和捕捉这些反应相关的两个局部区域电位和尖峰对刺激的历史依赖性的特殊功能。的确，从原始的LFP反应，一组3 LFP的特点（对LFP本身，LFP一阶导数的一阶导数和相位）与平均峰值响应强烈关联，也被提取。
几个方法被提出，以适应该预测从局部区域电位3,4尖峰模型。在一般的模型拟合过程的一个临界点，也常见于从刺激信号尖峰事件的预测，是通过对目标函数最大化/最小化的适当选择构成。虽然一系列的目标函数已经提出D（ 例如，相关性和连贯性）5没有这些共同捕捉尖峰响应的整体复杂性。因此，基于多目标优化的一种新的框架被引入。我们发现，通过使用建议的制定和这个计算框架，可以估算一个基于强大的LFP秒杀关系集合预测模型。
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Protocol
道德声明
研究感官刺激是如何通过神经元的活动表示没有替代使用动物及使用体内的方法。沿着科研（意大利语生物伦理委员会，对动物的研究中治疗法法令，1992年1月27日，第116号）动物诊疗意大利和欧洲法律的所有动物所受到的待遇。国家研究理事会，这里的实验已经进行，坚持国际委员会实验动物科学（的ICLA）代表联合国教育，科学及文化组织（教科文组织），理事会的国际医学科学组织（CIOMS的）和国际生物科学联合会（生物科联）。因此，概无特定协议的批准是必要的。卫生部的批准，被列为“比耶拉1，3/2011”到的伦理委员会的文件米兰大学。
1。实验动物的制备
- 选择雄性大鼠的规模约300-400克。
- 麻醉大鼠的实验制备。
- 腹腔注射巴比妥类溶液（戊巴比妥钠，50毫克/千克的感应，10毫克/千克维护）。
- 检查麻醉水平低阈值和高阈值机械刺激过一爪子保证不回缩反射的发生。
- 通过准确，然后做一个切口，显露颅面妆颅顶准备颅皮肤。
- 导管插入气管，通过气管套管（2毫米和2.5mm的外径内径）由围绕气管本身手术结扎固定它。
- 横向的气管段露出颈静脉和导管插入它插入连接到注射器，容器周围手术结扎固定它的插管（PE10）。
- 安装到大鼠立体定位仪。
- 固定鼠体，并装在仰卧位置。
- 由耳棒固定头和阻塞口鼻部。放入老鼠的耳朵一两滴麻药（利多卡因）配售耳酒吧前。
- 调节立体定向垫由一个电子控制的加热垫的温度，将温度保持在37.5℃。
- 气管导管连接到呼吸麻醉设备。
- 在1冲程/ s的传送异氟醚（2.5％0.4-0.8升/分）和O 2（0.15-0.2升/分钟）设置呼吸麻醉设备。
- 由聚维酮碘局部消毒剂仔细清理颅顶。
- 取无菌手术刀切纵向上从吻端的基础上中线枕骨的角度。
- 由拉钩极叉开的伤口边界和两个小镊子娇养修复它们应用于吨Ø伤口边界。
- 通过指向一个灯的一个骷髅跳马观察半透明表面识别骨膜。小心划伤骨库取出骨膜和暴露的骨面。
- 提供止血用棉签或海绵手术在骨面上，如果焦点出血出现在骨。
- 用细尖笔，找出立体定向点前囟门在mediosagittal和冠状suturas的交叉点。
- 在手术显微镜控制，识别立体定向区（S1HL）覆盖躯体感觉皮层对侧用于实验（前囟门，美联社-0.5至1.2毫米，LL -2.3至2.5毫米）的后爪。
- 用细尖钢笔绘制正方形周长划定要钻的孔。
- 钻在先前确定的蓝色正方形去除骨瓦9 平方毫米的孔。
- 清洁和吸收潜在的骨出血。 小心取出硬脑膜并覆盖皮质表面与外科海绵浸泡在保持在37.5℃，人工脑脊液
- 固定在电极基体，以连接到电子显微操作器的保持器。
- 由microconnector矩阵的头部连接到前置放大器。
- （在手术显微镜控制）手动驱动电极矩阵到皮质表面（不接触它）。
- 开关与听觉信号的放大器。
- 驱动，由电子控制，电极矩阵触摸皮质表面，直到接触达成，通过明确的噪声音变信号。
- 直到350-400微米的深度达到（皮质层四）由电子控制的步骤（2微米/步）拉下电极矩阵。
- 检查神经元的反应由光触摸对侧后方的爪子。
- 通过几个步骤进一步调整的深度，直到一个明确的扣球反应观察。
- 通过静脉加拉碘thriethiodide（20毫克/千克/小时）麻痹的大鼠。使用剂量折射整个实验过程中保持curarization水平（0.4毫升/ 1小时）。
2。信号处理
- 设置软件带通滤波器[0.1 6000]赫兹。
- 记录采样32 kHz的8个通道微电极矩阵的神经信号。
- 采集结束后，输出所记录的信号转换成适合于后处理的二进制格式。
- 由Wave_clus工具箱11，履行秒杀分拣过程。
3。制造及刺激装置的配置
- 挂载一个仙人掌茎（带钝尖）垂直于中档音箱胶柄的基础上向盖的表面。
- 程序微控制器提供电压脉冲到一个驱动电路，用于将扬声器。
- 编程的微控制器，提供的电流在每个第二两个成对脉冲（参见图1C）。
- 由L293D H桥基本无源元件（ 见图1A）的方式组装的扬声器和微控制器。
- 微控制器连接到12伏可充电电池。
4。刺激方案
- 胶水后肢足爪的背方面坚实的框架，露出掌面，避免关节扭力。
- 将刺激装置的前端到所需肢/爪的位置。
- 切换刺激装置上。
离线步骤：
5。评估穗的回应
- 对于每个记录的神经元，计算刺激的香农互信息（MI）的诱发扣球活动（CA刺激tegory要么是1，刺激，或0，无刺激）。
- 估计的条件响应概率P（R | S），其中s表示刺激类别和r表示内一个固定的时间窗口发射尖峰的个数。
- 通过使用洗牌过程中所述9纠正心肌梗死的估计。
6。评价LFP的回应
- 过滤所记录的信号的频率范围[0.1 100]赫兹为了获得LFP信号
- 计算LFPSNR，度量LFP反应性，如在参照图10进行说明。
7。模型估计
- 生成的形状的模型
其中x参数代表三种不同的LFP功能（×1的磷酸锂铁本身，< em>的×2及其衍生物以及x 3及其衍生物的希尔伯特相位） 和 F表示如下
的克系数是线性组合的权重，f是一个运算符，它取任一的绝对值，电源或各x i的原始值。 - 使用NSGAII算法通过使用以下三个对象来估计模型参数和操作：ⅰ）一个地方，试验对试验的基础上，测量拟合
，其中N 藻和N r个分别代表整体尖峰计数和响应向量的长度;ⅱ）基于平均响应全局拟合度量ad/50941/50941eq4.jpg“宽度=”205“/>其中N RESP代表的平均响应的长度; iii）较模型复杂度的度量（另见）10 
。
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。 8。组织学确认
- 牺牲老鼠。
- 在实验记录的结尾，把动物在深麻醉气体（异氟醚2％，4升/分钟）和静脉注射巴比妥酸盐过量（> 50毫克/千克，戊巴比妥）。
- 等待心脏骤停。
- 从立体定位仪卸载鼠
- 灌注。
- 将大鼠网格铺设了到盆收集血液和体液从灌注。
- 通过解剖从肋部插入分离胸骨，打开胸腔。
- 与溺爱镊子和倾覆Cr块胸骨剑突过程anially胸骨和叉开将排骨过心脏。
- 确定左心室和右心房，放置一个9轨距钝尖的针（连接到灌注套管）插入心室并与手术细剪刀打开右心房。
- 开始灌注后的4％的福尔马林溶液（250毫升）中的灌注冷的（4℃）肝素化的生理溶液（250毫升）。
- 通过用合适的钳子口颅顶从头骨中提取大脑，并放置在大脑中有10％的福尔马林溶液中。
- 一个星期后，用切片机（10微米厚）制备的组织学切片。
- 染色用甲酚紫溶液大脑冠状面和矢状切面。
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Representative Results
提示偏移功能
为了表征所提出刺激装置的动力学性质，一系列的实验设置。它由一个砷化镓红外发光二极管加上一个硅光电晶体管的一个具体装置是用来评估尖端位移，位移持续时间和可能的位移延迟。通过这种光断续器开关的手段，我们放在刺激尖上的发光二极管孔（高度= 1毫米）的边缘，无论是微控制器和光电晶体管输出的记录。配售过程提供了便利一microstepper装置为1毫米的最大分辨率。
设备的响应示于图2A中 。红线代表的光电晶体管的响应之后，微控制器响应表示尖端位移的确切开始。值得注意的是，一个系统的延迟，由于通勤ations出席并量化（ 图2B，平均= 583在100次试验微秒），导致大量的低于预期的时间精度（1毫秒）。最后，我们测量的是3.96毫秒，平均为如图2C所示的尖端位移的持续时间。
随机配对脉冲议定书捕捉LFP和斯派克关系
为了理解LFP和尖峰之间的关系，我们首先载，以产生一个刺激装置，其能够从两个信号唤起快速和可靠的响应。 图3A示出了刺激间间隔分布，以确保该装置引起的尖峰活动的调制。设备描述和功能是详细的协议部分。
在图3B和3C为代表神经元的LFP和尖峰反应显示，分别。通过测量相互通知振动性的尖峰和信噪比的LFP（ 图4A和4B），很明显，这两种编码的有关刺激产生的大量信息。
有趣的LFP和尖峰还提供了有关刺激史（ 图4C-E）信息。特别LFP反应时的实际刺激之前有一个先前的脉冲具有足够小的刺激间间隔（ 图4C和4D）被显着降低。历史上的刺激神经 元编码正与心肌梗死相关性虽然表现出相当低的值（ 图4E）。
然后我们问LFP信号的哪些功能与尖峰响应更好的相关性。初步分析后，三LFP功能，平均穗响应强烈相关鉴定：普通的LFP，其衍生物和LFP衍生的相位（ 基于局部区域电位为穗预测的多目标策略 穗列车通常表现出对多种时间尺度显著相关性复杂的时空结构。因此，其神经元的反应方面通过的LFP被捕获？ 一个好的测试，以探测LFP-秒杀关系的理解就是问尖峰有多好，只是通过看LFP信号预测。因此，通过使用上面设置的LFP功能（参见图4F），其目的是建立一个预测模型，在任何时候，读取这些功能的价值，并产生约一穗的发生二进制预测。 相关的尖峰预测模型的拟合的一个关键问题是由一个适当的目标函数的选择所构成。最常见的选择是Pearson相关系数和相干函数5。 INTERES婷的替代品被秒杀指标6提供。虽然前两个措施都基于平均神经元的反应，因此不捕获秒杀列车的完整结构，后者是计算量大且并不实用的装修之用。基于多目标优化的替代解决方案的建议。这样做是为了尽量减少联合多个目标函数（以下称只是被称为目标）。这些目标必须在计算上高效的计算，并能够捕捉到的神经元响应的不同方面。 用帕累托最优的概念，我们就可以找到一组模型，为每一个这些目标之间的具体权衡优化。为了估计帕累托最优表面NSGAII算法用于12。我们确定了三个目标函数：基于距离的平均响应，本地的基础上试至审判的距离，一个全球性基础和惩罚了模型的复杂性的额外目标（见相对协议部分）。 通过我们的数据集拟合代表神经元得到的结果示于图5A和5B。图5A中报道的全球距离（PF）和模型和真实响应之间的局部距离（SM）。请注意，该距离为每个模型是最优的帕累托意义上，以便没有模型比其他任何一个在这两个距离好还是坏。同样的原则也适用于所有的三个距离共同考虑（ 图5B）。 由一组最优模型，而不是一个单一的一个的估计给定的一个主要优势在于，不同的型号，基于最优权衡指定的目标中，捕捉到真正的神经反应的不同方面。这显示在图6中 ，其中原始栅格诊断绵羊（ 图6A和图6D），并预测发生的（ 图6B，6C，6E，6F和）的报告，从两个有代表性的神经元：模型，最大限度地减少了局部距离捕获的神经元的反应（ 图6B和6E的最可靠的相位），而基于本地和全球之间的距离合理的权衡模型更好地反映神经元变性和自发放电在整个时间范围（0-50毫秒， 图6C和6F）。 
图1驱动电路 （A） 的示意图，其主要组分是一种L293D H桥。该微控制器的命令交付为p集D1和D2。 （二）钝尖的动作轻机械刺激。在方格纸上的网格大小为1毫米。 点击这里查看大图 。 
图2。提示位移功能 。光电晶体管（红色线）和微控制器（蓝线）的（A）的输出。绿色的垂直线被设置为0表示的尖端位移的发生。 （B）有效尖端位移延迟的概率分布，获得了100试验。 （C）平均在100次试验的尖端位移的持续时间的概率分布。/ ftp_upload/50941/50941fig2highres.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。 
图3：“空气”刺激（A）刺激间间隔分布。（B，C）不引起反应（参见范围1000〜1200试验两个图的顶部）。他们从0到比较真实的刺激试运行（在纵坐标轴）到1000，其中15间 - 延迟40从刺激开始（时间为0的横坐标）毫秒明确答复可以观察到。 （B）中的情节是指在磷酸锂铁反应，而在（C）的情节是指尖峰响应。在最右边的图中的y轴，有位置（“大脚趾”，“II”，＆＃34，三对大鼠后肢刺激的“，等等） 点击此处查看大图 。 
图4（A，B），互信息和LFP 的SNR为沿着不同的数字时间的函数（C）LFP标准化值后短（<100毫秒）和长期（> 300毫秒）刺激间间隔（IStimI） 。 （ 四）长期和短期IStimI后LFP反应的平均功率。每个点代表一个不同的记录。 （ 五）对心肌梗死长/短IStimI如约出现刺激（IMAX）为最大MI值的函数。每个点代表的广告istinct神经元。 （F）代表神经元的PSTH以及相关的LFP响应三个特点：平均原始信号，平均导数和微分相位点此查看大图 。 
图5为代表的神经元预测和真实反应之间（A，B）局部和全局的距离。（b）联合评估的三个距离。帕累托最优的解决方案是通过使用NSGAII算法估计。 点击这里查看大图 。
图6。真正的（A，D）和估计（B，C和E，F分别）为两个有代表性的神经元的反应，X，Y，Z分别代表原始LFP信号，其衍生物及其衍生的阶段。 点击这里查看大图像 。
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Discussion
这项工作首先提出了一种新的，简单的，低成本的装置，可帮助提供快速和空间点状的感官刺激。然后随机配对脉冲刺激方案和一套计算分析进行了验证。总体目标是建立在期间触觉刺激电生理记录LFP-秒杀关系的估计的框架。
该设备的协议和分析方法已共同促成的结果，即确定性方法能够描述和预测LFP到秒杀转变的第一个示范，一个神经过程仍然了解1很差。
一个关键点是由可编程微控制器电路板，其中规定强度和尖端游览由防尘帽拉的长度适当的设置来表示。一个合适的解决方案，可提供可靠的高频率刺激和比较大的DISPLA水泥已经在结果部分进行了描述。相比传统的压电致动器装置提供了两个主要的优点：它逃脱了机械共振的典型问题，它允许比较大的尖位移。
在S1皮质神经元是众所周知的表达大感受野和 快速的反应，触觉刺激8。快，像冲动的刺激是最适合招收两个浅表和深部皮肤感受器（ 如默克尔或环层小体）2，并适时改变刺激参数（强度，持续时间，斜坡衍生物）人可以优先聘用这些不同的受体类之一。随机配对脉冲协议旨在减少神经元振荡的预测夹带刺激，通常在周期性刺激发生发生。另一方面成对的脉冲之间的可变间隔允许我们提取一个明确依赖形成E对刺激的历史。对于结构的估计和我们的预测模型，我们依赖于一个著名的多目标优化算法，称为非支配排序遗传算法II或NSGAII 12的参数。在拟合预测模型的尖峰出现的一个主要问题依赖于真正的秒杀列车的复杂的时空结构。测量预测和真正的秒杀列车之间的距离已经被证明是一个昂贵的计算任务6。使用NSGAII，一个多目标优化算法，允许打破该问题为多个，计算效率高的距离。
为了评估我们需要量化误差通过预测和真正的秒杀列车之间的距离表示预测模型的善良。两个主要标准来评价模型的预测进行了考虑。拟合过程返回的一组模型，而不是一个单一的1。有趣的是每个模型我n个组似乎捕捉到原来的脉冲序列的不同方面。
总之，开发框架的基础上，共同优化的刺激装置，协议和分析，可以用来获得进一步深入了解了LFP-秒杀关系，以改善目前的战略进行编程效率的脑机接口和神经义肢。
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Disclosures
作者宣称没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
SN和AGZ是由PON 01-01297 VIRTUALAB资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microstepper | AB Transvertex (Stockholm, Sweden) | The microstepper used to pull down the electrode matrix | |
| 32-channel Cheetah System | Neuralynx (MT, USA) | The electrophysiological recording system | |
| L293D h-bridge | RS Components (Cinisello Balsamo, Italy) | The bridge used to connect the microcontroller to the speaker | |
| H21A3 Optical Interrupter Switch | Fairchild Semiconductor Corporation (San Jose, California) | The phototransistor used to estabilish the tip displacement | |
| Arduino Uno | Arduino (Duemilanove, Italy) | The microcontroller used to deliver current pulse to the speaker | |
| Microelectrode Matrices GB1 | FHC | ||
| Isoflurane | Rhodia Organique Fine Ltd. | The anesthetic used to prepare animals | |
| Stereotaxic apparatus | Narishighe (Tokyo, Japan) | ||
| Sprague-Dawley male rats | Charles River (Calco, LC, Italy) | ||
| Gallamine thriethiodide | Sigma-Aldrich | The compound used to curarize the animals | |
| Cresyl violet | Sigma-Aldrich | ||
| Topical antiseptics (Betadine 10%) | Meda Pharma (Milanm Italy) | ||
| Heparine | Sigma-Aldrich | ||
| Formaldehyde | Carlo Erba Reagents (Pomigliano Milanese, Milan, Italy) |
References
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