Summary
V3 arbeidsflyt er en vestlig blot prosedyre ved hjelp av flekkfrie geler. Den flekkfrie teknologien gjør det mulig for forskere å visualisere proteinseparasjonskvalitet, for å verifisere overføringseffektiviteten, og viktigst av alt, for å validere endringen i proteinet av interesse ved hjelp av total protein kvantifisering som en pålitelig lastekontroll.
Abstract
Den vestlige blotten er en veldig nyttig og allment vedtatt laboratorieteknikk, men utførelsen er utfordrende. Arbeidsflyten karakteriseres ofte som en "svart boks" fordi en eksperimentalist ikke vet om den har blitt utført med hell før det siste av flere trinn. Videre blir kvaliteten på vestlige blotdata noen ganger utfordret på grunn av mangel på effektive kvalitetskontrollverktøy på plass gjennom hele den vestlige blottingsprosessen. Her beskriver vi den vestlige arbeidsflyten V3, som bruker flekkfri teknologi for å løse de store bekymringene knyttet til den tradisjonelle vestlige blotprotokollen. Denne arbeidsflyten gjør det mulig for forskere: 1) å kjøre en gel på ca 20-30 min; 2) å visualisere prøve separasjon kvalitet innen 5 min etter gel løp; 3) å overføre proteiner i 3-10 min; 4) å verifisere overføringseffektivitet kvantitativt; og viktigst av alt 5) for å validere endringer i nivået av proteinet av interesse ved hjelp av total proteinbelastningskontroll. Denne nye tilnærmingen eliminerer behovet for stripping og bebreidelse av flekken for rengjøringsproteiner som β-aktin, β-tubulin, GAPDH, etc. V3-flekkfri arbeidsflyt gjør den vestlige flekkprosessen raskere, gjennomsiktig, mer kvantitativ og pålitelig.
Introduction
Western blot er en veldig nyttigteknikk 9, men det er to store utfordringer med vestlig blotting: lang og arbeidsintensiv prosess og kvalitet på data. En tradisjonell protokoll krever ca 2 dager. Det innebærer mange trinn, inkludert prøvepreparering, gelstøping, proteinelektroforese og overføring, membranblokkering etterfulgt av antistoffinkubasjon, avbildning og ganske ofte stripping, bebreidelse og til slutt dataanalyse. Gjennom hele denne prosessen er det ingen pålitelige og fleksible verktøy for prosesskontroll. Som sådan kan feil innføres på hvert trinn, og disse feilene har potensial til å generere dataartefakter; Derfor er lastekontroller avgjørende i vestlig blotting for å identifisere og korrigere for feilene. Lastekontrollen gjøres vanligvis ved å sjekke proteinnivået til et referanseprotein i hver prøve for å se om det er like presentert. Folk bruker ofte rengjøringsproteiner, for eksempel β-aktin, β-tubulin, GAPDH, som lastekontroll.
Kvaliteten på vestlige blotdata avhenger av pålitelig lastekontroll. Men det er to legitime bekymringer ved bruk av rengjøringsproteiner for lasting av kontroller: 1) antistoffbasert immunodeteksjon av rengjøringsproteinbåndene er ofte mettet, og derfor kan man ikke skille belastningsforskjellene mellom prøvene30; 2) rengjøring protein uttrykk nivå kan variere i prøvene under visse eksperimentelle forhold , for eksempel siRNA behandling, celledød, celle differensiering, etc.11,28,3,6,10,21. På grunn av disse bekymringene krever vitenskapelige tidsskrifter nå at "for kvantitative sammenligninger bør passende reagenser, kontroller og avbildningsmetoder med lineære signalområder brukes" (Nature retningslinje). På samme måte ber redaktører fra Journal of Clinical Investigation om mer pålitelige lastekontroller24. Av disse grunnene må et rengjøringsprotein valideres for å kunne brukes som lastekontroll. Først må man sørge for at den måles i det lineære dynamiske området til immunodeteksjonsmetoden14,29. For det andre må man sørge for at den uttrykkes konsekvent i alle prøver26,31,25,19,20.
En alternativ løsning på en pålitelig lastekontroll er å bruke total proteinmåling fra blotten. Noen forskere har farget blotter med totale proteinflekker, for eksempel Coomassie, Flamingo Pink, Sypro Ruby, Amido Black, Ponceau S og flekkfri teknologi, for å måle det totale proteinsignalet i hvert kjørefelt som lastekontroll16,20,13,27,1,4,12. Den totale proteinbelastningskontrollen unngår fallgruvene forbundet med rengjøringsproteiner. For det første er det en sann refleksjon av mengden protein lastet for hver prøve. For det andre viser den totale proteinflekken utmerket lineært dynamisk område i det vanlige lasteområdet for vestlig blotanalyse (10-50 μg protein av en kompleks cellelysat) og skiller nøyaktig lasteforskjellen mellom prøvene12.
Flekkfri teknologi er en ny total proteinfargingsmetode der en unik forbindelse blandes i akrylamidgeloppløsning og jevnt fordelt i den støpte gelen. Etter at elektroforesen er fullført, blir gelen utsatt for UV-lys i minst 1 min slik at flekkforbindelsen reagerer med tryptofanrester i proteinet. Proteinene blir spennende under UV-lys for å gi et sterkt fluorescerende signal som kan visualiseres og kvantifiseres i en flekkfri aktivert imager som ChemiDoc MP-systemet. Den flekkfrie forbindelsen selv absorberer imidlertid ikke UV-lys, noe som resulterer i lav bakgrunn av gelbildet. Modifikasjonen av tryptofan rester er irreversibel og proteiner kan visualiseres ikke bare i gelen, men også på blotte når som helst etter proteinoverføring.
Den flekkfrie teknologien brukes i V3 Western Workflow (figur 1) for å håndtere de store klagene om den tradisjonelle arbeidsflyten, spesielt bekymringene for å bruke rengjøringsproteiner som lastekontroller. Ved hjelp av denne arbeidsflyten kan man: 1) kjøre en gel på ca 20-30 min, 2) sjekke prøveintegritet og proteinseparasjonskvalitet på 5 minutter etter gelløp; 3) overføre proteiner i 3-10 min; 4) sjekk overføringseffektiviteten kvantitativt; og 5) viktigst, validere endringer i nivået av protein av interesse ved hjelp av total protein lasting kontroll.
Protocol
1. Protein prøve prep
(En typisk prosedyre for å trekke ut proteiner fra cellekultur er beskrevet)
- Plasser HeLa-cellekulturretten i is og vask cellene med iskald Tris-bufret saltvann (TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl).
- Aspirer TBS, tilsett deretter 1 ml per 100 mm parabolens iskalde RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoksykolat, 0,1% SDS) supplert med fosfatase og proteasehemmere.
- Skrap adherentceller av parabolen ved hjelp av en kald plastcelleskraper; forsiktig overføre cellefjæringen til et forhåndskjølt mikrosenterrør.
- Oppretthold konstant agitasjon i 30 min ved 4 °C på en rotator.
- Spinn ved 16 000 x g i 20 minutter i en prekolert sentrifuge på 4 °C.
- Fjern forsiktig røret fra sentrifugen og legg det på is. Overfør supernatanten til et friskt rør som holdes på is, og kast pelletsen.
- Fjern et lite volum (10-20 μl) lysat for å utføre en proteinanalyse. Bestem proteinkonsentrasjonen for hver prøve ved hjelp av RC DC-analysesettet.
- Om nødvendig, aliquot proteinprøvene for langtidslagring ved -20 °C. Gjenta fryse- og tinesykluser forårsaker proteinforringelse og bør unngås.
- Ta ca 20 μg av hver prøve, legg til et likt volum av 2x Laemmli prøvebuffer (4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 20% glyserol, 0,004% bromophenol blå, 125 mM Tris-HCl, pH 6.8).
- Varm opp hver cellelyse i prøvebuffer ved 95 °C i 5 minutter.
- Sentrifuge på 16.000 x g i en mikrocentrifuge i 1 min.
2. Gel elektroforese med flekkfrie geler (~ 30 min)
- Ta et kriterium TGX Enhver KD flekkfri prefabrikert gel (en midi format gel), fjern kammen og båndet fra bunnen av kassetten.
- Plasser kassetten i Criterion-cellen og fyll det integrerte øvre bufferkammeret med 60 ml løpebuffer (25 mM Tris, 190 mM glycin, 0,1 % SDS, pH 8,3). Skyll brønnene med løpebuffer.
- Fyll hver halvdel av den nedre buffertanken med 400 ml løpebuffer til den markerte påfyllingslinjen.
- Last proteinprøvene og passende proteinmarkører.
- Sett lokket på tanken, juster de fargekodede bananpluggene med tilsvarende kontakter på lokket.
- Kjør gelen i ~30 min ved 200 V eller 20 min ved 300 V.
3. Flekkfri gelavbildning Ved hjelp av Chemidoc MP-systemet for å sjekke proteinseparasjonskvaliteten (~ 5 min)
- Fjern gelkassetten fra cellen. Bruk gelkassettåpningsverktøyet i Criterion Cell-lokket til å åpne kassetten og løsne gelen.
- Påfør et par milliliter vann i midten av UV-prøvebrettet til ChemiDoc MP-imageren. Løft gelen forsiktig fra kassetten og legg den på brettet.
- Start Image Lab-programvaren og ta opp det flekkfrie gelbildet (Figur 1A) med følgende innstillinger:
Bruksområde: flekkfri gel
Gel aktiveringstid: 1 min
Bildeområde: kriteriumgel
Bildeeksponeringstid: automatisk optimalisert for de mest intense båndene - Fjern gelen fra prøvebrettet og fortsett umiddelbart for å overføre trinn.
4. Proteinoverføring med Trans-Blot Turbo System (~ 10 min)
- Åpne en Trans-Blot Turbo Midi PVDF transfer pack; plasser bunnstabelen (som inkluderer membranen) på bunnen av overføringskassettet.
- Plasser gelen på toppen av membranen, plasser toppstabelen på gelen og rull ut bobler.
- Sett lokket på kassettbasen og vri hjulet for å låse det.
- Sett kassetten inn i blotterrommet.
- Start overføringen ved å velge et forhåndsinnstilt Turbo-program og velge Criterion gel size (midi), og trykk deretter RUN. Et typisk løp tar bare 7 minutter.
- Når overføringen er over, demonter blotting sandwich og legg både blolot og gel i en beholder med deionisert vann.
5. Flekkfri gel- og blotavbildning Ved hjelp av Chemidoc MP-systemet for å sjekke proteinoverføringseffektivitet og -kvalitet (~ 5 min)
- Plasser gelen etter overføringen på prøveskuffen til ChemiDoc MP-imageren.
- Start Image Lab-programvaren og ta det flekkfrie bildet av gelen etter overføringen (Figur 1B) med følgende innstillinger:
Bruksområde: flekkfri gel
Gel aktiveringstid: ingen
Bildeområde: kriteriumgel
Bildeeksponeringstid: samme som eksponeringstiden for førtransfergelbildet - Fjern gelen fra prøveskuffen, og bilde deretter flekken (figur 1C) med følgende innstillinger. Hold flekken våt med noen dråper vann eller TBST ved avbildning.
Bruksområde: flekkfri blott
Bildeområde: kriteriumgel
Bildeeksponeringstid: automatisk optimalisert for de mest intense båndene - Fjern blottingsmembranen fra prøvebrettet og legg den i en beholder med TBST (0,1% Tween 20 i TBS).
6. Antistoff inkubasjon
- Blokker ved å plassere blokken i en løsning av 3% bovint serumalbumin (BSA) i TBST ved romtemperatur i 1 time.
- Inkuber blotten over natten ved 4 °C i oppløsningen som inneholder primært musantistoff hevet mot det første målproteinet og kaninens primære antistoff hevet mot det andre målproteinet.
- Hell ut løsningen som inneholder det primære antistoffet. Deretter vasker du blotten ved å agitere i 20 ml TBST i 5 minutter. Gjenta 4x for totalt 5 vasker.
- Inkuber i 1 time ved romtemperatur i den sekundære antistoffløsningen som inneholder et Dylight 650 konjugert goat-antimus-antistoff og et Dylight 549 konjugert goat-anti-kanin antistoff.
- Hell ut løsningen som inneholder det primære antistoffet. Deretter vasker du blotten ved å agitere i 20 ml TBST i 5 minutter. Gjenta 4x for totalt 5 vasker.
7. Bildebehandling og dataanalyse etter Image Lab Software - Total protein normalisering (~ 5 min)
- Skaff deg et multipleksende fluorescerende bilde av flekken (figur 1E) ved å åpne en ny flerkanalsprotokoll, konfigurere tre fluorescerende kanaler og kjøre protokollen.
Kanal 1:
Bruksområde: blot Dylight 650
Bildeområde: kriteriumgel
Bildeeksponeringstid: automatisk optimalisert for de mest intense båndene
Kanal 2:
Bruksområde: blot Dylight 549
Bildeområde: kriteriumgel
Bildeeksponeringstid: automatisk optimalisert for de mest intense båndene
Kanal 3:
Bruksområde: flekkfri blott
Bildebehandlingsområde: kriteriumgel Bildeeksponeringstid: automatisk optimalisert for de mest intense båndene - Klikk Normalisering-ikonet i analyseverktøyboksen, og klikk Ja for å oppdage baner og felt.
- Velg og bruk "Lanes and Bands tools" for å gjøre justeringer i banene og båndene om nødvendig.
- Velg flekkfritt bilde som normaliseringskanal.
- Velg MW-analyseverktøy og tilordne standardbanene for MW ved å merke av i boksene under dem.
- Hvis du vil vise de normaliserte volumene, klikker du analysetabellen på verktøylinjen. Alle beregninger vil bli utført automatisk av programvaren, inkludert normaliseringsfaktoren og normaliserte volumer. Målproteinbåndintensitetsverdiene er nå justert for variasjon i proteinbelastningen. Dette vil tillate nøyaktige sammenligninger av målproteiner blant prøvene.
Representative Results
1. Vurdering av prøveintegritet, proteinseparasjonskvalitet og overføringseffektivitet med flekkfrie gelbilder.
Proteinekstrakt fra HeLa-celler ble separert ved 300 V i 20 minutter på et 18-brønns kriterium AnyKD TGX flekkfri gel. Proteinprøvene ble lastet 3x ved fire forskjellige mengder (Lanes 1-3, 40 μg; Baner 4-6, 30 μg; Baner 7-9, 20 μg; Baner 10-12, 10 μg). Gelen ble aktivert under UV-lys i 1 min. Figur 2A viser gelbildet som er oppnådd rett etter proteinseparasjonen. Proteinprøveintegritet(f.eks. nedbrytning) og separasjonskvalitet(f.eks. proteinutfelling) kan vurderes visuelt med dette gelbildet. Proteiner ble deretter overført i 7 min til en nitrocellulosemembran ved hjelp av Trans-Blot Turbo. Figur 2B viser det flekkfrie bildet av gelen etter overføringen. Begge bildene ble anskaffet med samme eksponeringstid (6,8 sek). Bane 3 og 12 ble valgt for å måle overføringseffektiviteten. Ved hjelp av volumverktøyet i Image Lab-programvaren ble det tegnet en rektangulær boks (blå) for å dekke bane 3 og 12 på begge gelbildene. Beregningen basert på volumverdiene fra disse boksene indikerte at overføringseffektiviteten til begge banene var 80% (Figur 2C). I dette eksperimentet ble AnyKD TGX gel valgt for å studere små til mellomstore målproteiner, og det ble ikke optimalisert for overføring av store proteiner. Optimalisering av overføringseffektiviteten vil kreve bruk av gel med lavere prosent(f.eks. 4-20%) og/eller en justering av overføringstiden for å lette overføringen av store proteiner. 2. Flekkfri total proteinbelastningskontroll er et pålitelig alternativ til rengjøringslastekontroll i vestlig blotting for å kvantifisere en liten endring i interessenivået.
MCM-7 er en DNA-lisensreplikeringsfaktor hvis nivå reduseres med 20-50% i Lymfoblastoid cellelinjer (LCL) etter bestråling behandling. I dette eksperimentet ble lysater (30 μg hver) av fire kontroll- og bestrålingsbehandlede Lymfoblastoid cellelinjekulturer (LCL) separert på en 12-brønns Kriterium AnyKD TGX flekkfri gel. Gelen ble aktivert i 1 min under UV-lys og overført av Trans-Blot Turbo til en PVDF-membran for immunoblotting. Rengjøringsproteinet GAPDH (grønn) ble undersøkt med et kaninantistoff (Cell Signaling Technology, USA, 1:2,500) og en Dylight 549 konjugert Geit-anti-kanin antistoff (Rockland, USA, 1:20,000). Proteinet av interesse MCM-7 (rød) ble undersøkt ved hjelp av et museantistoff (Abcam, USA, 1:1,000) og en Dylight 649 konjugert Goat-antimus antistoff (Rockland, 1:10,000).
Figur 3A viser et multipleks fluorescerende bilde av totale proteiner (blå), MCM-7 (rød) og GAPDH (grønn) påvist i fire kontroll- og bestrålingbehandlede LCL-prøver. Figur 3B er et flekkfritt bilde av samme flekk som viser de totale proteinmønstrene i hver prøve (30 μg). Bildelabprogramvare valgte prøvebanene (blå bokser) for å måle MCM-7, GAPDH og totalt proteinvolum i hvert kjørefelt. MCM-7-nivåene ble normalisert enten mot den flekkfrie totale proteinmålingen eller mot GAPDH. De normaliserte MCM-7 proteinnivåene ble statistisk analysert og gjennomsnittlig MCM-7 proteinbåndvolum og standardavvik (n = 4) presenteres i diagrammet (Figur 3C). Begge normaliseringsmetodene viste en liten nedgang (ca. 25%) i MCM-7 proteinnivåer etter bestrålingsbehandling. Dataene med den totale proteinnormaliseringen viste et mindre standardavvik enn det med GAPDH som lastekontroll.
Figur 1. V3 vestlig arbeidsflyt. V3-arbeidsflyten vises i venstre kolonne i fire trinn. De viktigste instrumentene og reagensene som brukes i arbeidsflyten vises på hvert trinn. Den estimerte tiden for hvert trinn er også inkludert. Den høyre kolonnen viser at minst fire bilder kan genereres i V3-arbeidsflyten. Bruken av hver datadel er beskrevet. De flekkfrie bildene av pretransfergelen, etteroverføringsgelen og flekken (A, B, C) kan ikke genereres lett med tradisjonelle vestlige blottingsteknikker; Disse bildene og dataene gir viktig informasjon og sjekkpunkter langs prosedyren for å forbedre forskerens kontroll og reproduserbarhet av vestlig blot arbeidsflyt. Målproteinsignalene kan fanges opp enten på et chemiluminescent blot image (D) hvis et HRP-konjugert sekundært antistoff ble brukt i deteksjon eller på et fluorescerende blotbilde (E) hvis multipleksing fluorescerende vestlig blotting ble utført for å oppdage mer enn ett målprotein samtidig på samme blot.
Klikk her for å vise større bilde.
Figur 2. Flekkfrie bilder av pretransfer og geler etter overføring i den vestlige V3-arbeidsflyten for å vurdere prøveintegritet, separasjonskvalitet og overføringseffektivitet. (A) Forhåndstransfer gel flekkfritt bilde. (B) Etter overføring gel flekkfritt bilde. (C) Måling av proteinoverføringseffektivitet.
Klikk her for å vise større bilde.
Figur 3. Sammenligning av flekkfri total proteinmåling med GAPDH-immunodeteksjon som lastekontroller for å normalisere interessenivået. (A) Fluorescerende vestlig blot bilde. (B) Flekkfritt blottbilde. (C) Normaliserte MCM-7 proteinnivåer.
Klikk her for å vise større bilde.
Discussion
V3 flekkfri protokoll beskrevet ovenfor er for multipleksing fluorescerende vestlig blotting. Det kan også påføres i vestlig blotting ved hjelp av chemiluminescent deteksjon. I multipleks fluorescerende vestlig blot protokoll, de flekkfrie blot bilder er anskaffet på to tidspunkter: 1) rett etter proteinoverføring; 2) ved multipleks fluorescerende bildebehandling trinn etter antistoff inkubasjon. Det første flekkfrie bildet brukes til å beregne overføringseffektivitet, og det andre flekkfrie bildet brukes som lastekontroll. Når chemiluminescent-metoden påføres, er det ikke mulig å ta et multipleksbilde for flekkfrie og målproteinsignaler, fordi chemiluminescent-signalet også vil dukke opp i den flekkfrie kanalen. I dette tilfellet anbefaler vi å bruke det flekkfrie bildet tatt rett etter proteinoverføringstrinnet for lastingskontroll og normaliseringsanalyse.
Den vestlige V3-arbeidsflyten gir følgende unike fordeler sammenlignet med den tradisjonelle vestlige blot-arbeidsflyten som bruker rengjøringsproteiner som lastekontroller:
For det første gir V3-arbeidsflyten en praktisk, praktisk og mer pålitelig lastekontroll for å validere endringene i nivået av proteinet av interesse. V3-protokollen bruker en total proteinbelastningskontroll for å normalisere nivået av proteinet av interesse målt i hver prøve. Det unngår to fallgruver ved bruk av rengjøringsproteiner som lastkontroller: mettet immunodeteksjon og inkonsekvente rengjøringsproteinuttrykksnivåer blant prøvene under visse eksperimentelle forhold. Stripping og bebreidelse av trinn med antistoffer rettet mot rengjøring er ikke lenger nødvendig. Ved hjelp av flekkfri teknologi er det ikke nødvendig å flekke og flekke en flekk med flekker som Coomassie eller Sypro Ruby for total proteinmåling. Det tar bare noen få sekunder å skaffe seg et blotbilde og omtrent 5 min for å gjøre total proteinnormalisering ved hjelp av Image Lab-programvare.
For det andre tillater V3-arbeidsflyten forskere å ta bedre kontroll over den vestlige prosedyren fordi den gjør prosedyren mer gjennomsiktig og introduserer flere sjekkpunkter for kvalitetskontroll. Ved hjelp av flekkfri teknologi kan forskere visualisere proteinprøvene sine på både gelen og blotten. Forskere kan vurdere proteinprøveintegritet (degradert eller ikke), separasjonskvalitet (utfelt eller ikke), overføringseffektivitet og overføringskvalitet (til og med overføring eller ikke). Disse sjekkpunktene hjelper undersøkelser med å avslutte eksperimentet når de ser store feil i prosessen og unngår å kaste bort tid på dårlige prøver og flekker. Denne teknologien hjelper også forskere med å vurdere om det er en betydelig mengde proteintap etter membranstriping og om blott er egnet for å bebreide et annet mål 4.
Her er noen tips for å sikre god erfaring og kvalitetsdata ved hjelp av V3 western arbeidsflyt.
- Bilde gelen umiddelbart etter gelløp. Ikke bløtlegg gelen i noen buffer før den første avbildningen i prosedyren, da den kan vaske bort flekkforbindelsen.
- Bruk det samme bildeområdet til å hente alle bildene i protokollen. Dette vil tillate programvaren å legge over bilder for dataanalyse, for eksempel total protein normalisering.
- Hold eksponeringstiden konsistent når du ser på pretransferen og gelene etter overføringen. Dette vil tillate programvaren å kvantitativt måle overføringseffektiviteten.
- Hold membranen våt med noen dråper vann eller TBST når du kjøper blotbildet. Dette vil unngå mulige skitne bakgrunnsproblemer for målproteindeteksjon.
- Bruk lavfluorescerende PVDF-membran for multippelgivende fluorescerende vestlig blotting.
Det er viktig å merke seg at det flekkfrie molekylet etter UV-aktivering er irreversibelt bundet til tryptofan rester. Denne irreversible modifikasjonen kan potensielt påvirke antigengjenkjenning ved bruk av monoklonale antistoffer hvis epitopen inneholder tryptofan. Polyklonale antistoffer er usannsynlig å bli påvirket fordi de gjenkjenner flere epitoper på antigenet. Ubundne flekkfrie molekyler vaskes lett av gelen og membranen og vil derfor ikke forstyrre antistoff-antigeninteraksjoner.
Til slutt gjør den vestlige arbeidsflyten V3 den vestlige blotprosessen raskere, mer gjennomsiktig, kvantitativ og mer pålitelig. Forskere kan nå enkelt bruke total proteinbelastningskontroll i et vestlig bloteksperiment for å gjøre dataene mer pålitelige. Den flekkfrie arbeidsflyten V3 er vedtatt av en rekke laboratorier, og deres publikasjoner har vist at tidsskrifter godtar flekkfrie data som lastekontroll i vestligblott 22,17,7,8,5,23,18,15.
Disclosures
Forfatterne Anton Posch, Jonathan Kohn, Kenneth Oh, Matt Hammond og Ning Liu er ansatte i Bio-Rad Laboratories, Inc.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Wolf-Dieter Stalz, Dr. Arnaud Remy, Dr. Anton Posch, Dr. Patricia Piatti, Tom Davies, Kris Simonyi og Jeff Durban for deres kritiske gjennomgang og redigering av dette manuskriptet. Forfatterne takker også Allison Schwartz for teknisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel | Bio-Rad | 567-8093 | Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment |
| Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs | Bio-Rad | 170-4157 | Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size |
| Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Bio-Rad | 170-5061 | |
| EQUIPMENT | |||
| Criterion Cell | Bio-Rad | 165-6100 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer Starter System | Bio-Rad | 170-4155 | |
| ChemiDoc MP System | Bio-Rad | 170-8280 | |
References
- Aldridge, G. M., Podrebarac, D. M., Greenough, W. T., Weiler, I. J. The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting. J. Neurosci. Methods. 172 (2), 250-254 (2008).
- Bauer, D. E., Haroutunian, V., McCullumsmith, R. E., Meador-Woodruff, J. H. Expression of four housekeeping proteins in elderly patients with schizophrenia. J. Neural. Transm. 116 (4), 487-491 (2009).
- Castaño, Z., Kypta, R. M. Housekeeping Proteins: Limitations as References During Neuronal Differentiation. Open Neurosci. J. 2, 36-40 (2008).
- Colella, A. D., Chegenii, N., Tea, M. N., Gibbins, I. L., Williams, K. A., Chataway, T. K. Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology. Anal. Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).
- Cully, T. R., Edwards, J. N., Friedrich, O., Stephenson, D. G., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. Changes in plasma membrane Ca-ATPase and stromal interacting molecule 1 expression levels for Ca2+ signaling in dystrophic mdx mouse muscle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 303 (5), (2012).
- Dittmer, A., Dittmer, J. Beta-actin is not a reliable loading control in Western blot analysis. Electrophoresis. 27 (14), 2844-2845 (2006).
- Dutka, T. L., Lamboley, C. R., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. Effects of carnosine on contractile apparatus Ca2+ sensitivity and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in human skeletal muscle fibers. J. Appl. Physiol. 112 (5), 728-736 (2012).
- Elliott, S., Busse, L., Swift, S., McCaffery, I., Rossi, J., Kassner, P., Begley, C. G. Lack of expression and function of erythropoietin receptors in the kidney. Nephrol. Dial. Transplant. 27 (7), 2733-2745 (2012).
- Eslami, A., Lujan, J., Western, Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Ferguson, R. E., Carroll, H. P., Harris, A., Maher, E. R., Selby, P. J., Banks, R. E. Housekeeping proteins: a preliminary study illustrating some limitations as useful references in protein expression studies. Proteomics. 5 (2), 566-571 (2005).
- Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells. J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 76-79 (2010).
- Gürtler, A., Kunz, A., Gomolka, M., Hornhardt, S., Friedl, A. A., McDonald, K., Kohn, J. E., Posch, A. Stain-Free Technology as Normalization Tool in Western Blot Analysis. Anal. Biochem. 433 (2), 105-111 (2013).
- Hagiwara, M., Kobayashi, K., Tadokoro, T., Yamamoto, Y. Application of SYPRO Ruby- and Flamingo-stained polyacrylamide gels to Western blot analysis. Anal. Biochem. 397 (2), 262-264 (2010).
- Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S. E., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. J. Immunol. Methods. 345 (1-2), 40-48 (2009).
- Jensen, R. B., Ozes, A., Kim, T., Estep, A. Kowalczykowski SC BRCA2 is epistatic to the RAD51 paralogs in response to DNA damage. DNA Repair. , (2013).
- Lanoix, D., St-Pierre, J., Lacasse, A. A., Viau, M., Lafond, J., Vaillancourt, C. Stability of reference proteins in human placenta: general protein stains are the benchmark. Placenta. 33 (3), 151-156 (2012).
- Larkins, N. T., Murphy, R. M., Lamb, G. D. Influences of temperature, oxidative stress, and phosphorylation on binding of heat shock proteins in skeletal muscle fibers. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 3 (6), (2012).
- Laurie, K. J., Dave, A., Straga, T., Souzeau, E., Chataway, T., Sykes, M. J., Casey, T., Teo, T., Pater, J., Craig, J. E., Sharma, S., Burdon, K. P. Identification of a Novel Oligomerization Disrupting Mutation in CRYΑA Associated with Congenital Cataract in a South Australian. , (2012).
- Li, X., Bai, H., Wang, X., Li, L., Cao, Y., Wei, J., Liu, Y., Liu, L., Gong, X., Wu, L., Liu, S., Liu, G. Identification and validation of rice reference proteins for western blotting. J. Exp. Bot. 62 (14), 4763-4772 (2011).
- Liu, N. K., Xu, X. M. Beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. J. Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).
- Lowe, D. A., Degens, H., Chen, K. D., Alway, S. E. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase varies with age in glycolytic muscles of rats. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55 (3), 160-164 (2000).
- Mollica, J. P., Dutka, T. L., Merry, T. L., Lamboley, C. R., McConell, G. K., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. S-glutathionylation of troponin I (fast) increases contractile apparatus Ca2+ sensitivity in fast-twitch muscle fibres of rats and humans. J. Physiol. 590, 1443-1463 (2012).
- Murphy, R. M., Dutka, T. L., Horvath, D., Bell, J. R., Delbridge, L. M., Lamb, G. D. Ca2+-dependent Proteolysis of Junctophilin 1 and Junctophilin 2 in Skeletal and Cardiac. 591, 719-729 (2012).
- Neill, U. S. All Data are not created Equal. J. Clin. Invest. 119, 224 (2009).
- Pérez-Pérez, R., López, J. A., García-Santos, E., Camafeita, E., Gómez-Serrano, M., Ortega-Delgado, F. J., Ricart, W., Fernández-Real, J. M., Peral, B. Uncovering suitable reference proteins for expression studies in human adipose tissue with relevance to obesity. PLoS One. 7 (1), (2012).
- Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding Pitfalls of Internal Controls: Validation of Reference Genes for Analysis by qRT-PCR and Western Blot throughout Rat Retinal Development. PLoS One. 7 (8), (2012).
- Romero-Calvo, I., Ocón, B., Martínez-Moya, P., Suárez, M. D., Zarzuelo, A., Martínez-Augustin, O., de Medina, F. S. Reversible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots. Anal. Biochem. 401 (2), 318-320 (2010).
- Said, H. M., Polat, B., Hagemann, C., Anacker, J., Flentje, M., Vordermark, D. Absence of GAPDH regulation in tumor-cells of different origin under hypoxic conditions in-vitro. BMC Res. Notes. 13 (2), 8 (2009).
- Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative western blots. Exp. Anim. 60 (2), 193-196 (2011).
- Welinder, C., Ekblad, L. Coomassie staining as loading control in Western blot analysis. J. Proteome Res. 10 (3), 1416-1419 (2011).
- You, J., Hodge, C., Wen, L., McAvoy, J. W., Madigan, M. C., Sutton, G. Using soybean trypsin inhibitor as an external loading control for Western blot analysis of tear proteins: application to corneal disease. Exp. Eye Res. 99, 55-62 (2012).
