Summary
तीन आयामी प्रवाह चैम्बर डिवाइस एक उपन्यास है
Abstract
खून से कोशिकाओं परिसंचारी के परिस्त्राव स्टेम सेल घर वापस आना और ट्यूमर मेटास्टेसिस सहित कई शारीरिक और pathophysiological प्रक्रियाओं में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है. तीन आयामी प्रवाह चैम्बर डिवाइस (इसके बाद 3 डी डिवाइस) शारीरिक कतरनी तनाव recreates और सेल परिस्त्राव झरना के प्रत्येक चरण मात्रा निर्धारित किया जा करने की अनुमति देता है कि इन विट्रो प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में एक उपन्यास है. 3 डी डिवाइस ब्याज की कोशिकाओं कतरनी तनाव के तहत प्रसारित जिसमें एक ऊपरी डिब्बे, और ब्याज की chemoattractants होते हैं कि स्थिर कुओं का एक कम डिब्बे के होते हैं. दो डिब्बों endothelial कोशिकाओं (ईसी) की एक monolayer साथ लेपित झरझरा सम्मिलित करता है से अलग होती है. ब्याज की microenvironmental कोशिकाओं के साथ एक वैकल्पिक दूसरा डालने के चुनाव आयोग परत के नीचे तुरंत रखा जा सकता है. एक गैस विनिमय इकाई इष्टतम सीओ 2 तनाव की देखरेख करने की अनुमति देता है और के दौरान कोशिकाओं या यौगिकों जोड़ने या वापस लेने के लिए एक पहुँच बिंदु प्रदान करता हैप्रयोग. परीक्षण कोशिकाओं के एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप द्वारा नियंत्रित वांछित कतरनी तनाव (प्रवाह की दर) पर ऊपरी डिब्बे में प्रसारित. प्रयोग के अंत में, घूम और चले गए कोशिकाओं को आगे विश्लेषण के लिए एकत्र होते हैं. 3 डी डिवाइस केमोकाइन ढ़ाल, कतरनी तनाव के लिए प्रतिरोध, क्लस्टर गठन, और सेल अस्तित्व के जवाब में कतरनी तनाव, स्थानांतरगमन के तहत चुनाव आयोग पर और आसंजन रोलिंग सेल की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, वैकल्पिक दूसरा डालने के चुनाव आयोग और microenvironmental कोशिकाओं के बीच crosstalk के प्रभाव की जांच की अनुमति देता है. 3 डी डिवाइस के translational अनुप्रयोगों दवा उम्मीदवारों का परीक्षण शामिल है कि लक्ष्य सेल प्रवास और नसों में इंजेक्शन के बाद कोशिकाओं के vivo व्यवहार में अनुमान लगाया है. इस प्रकार, उपन्यास 3 डी डिवाइस सेलुलर परिस्त्राव कि मध्यस्थता आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी और सस्ती उपकरण है.
Introduction
सेल परिस्त्राव घूम कोशिकाओं को खून से बाहर निकलें और शरीर में कई शारीरिक प्रतिक्रियाओं का एक महत्वपूर्ण घटक है जिसके द्वारा प्रक्रिया है. प्रक्रिया उदाहरण के लिए, के रूप में ऊतक उत्थान के लिए भी महत्वपूर्ण है, रक्त वाहिकाओं (या नसों में इंजेक्शन) में ऊतकों से जुटाए चिकित्सीय कोशिकाओं वाहिका संरचना के माध्यम से विस्थापित और चोट या अध: पतन की साइटों के प्रचलन से बाहर निकलें. परिस्त्राव भी सूजन, प्रतिरक्षा अस्वीकृति, autoimmunity, और ट्यूमर मेटास्टेसिस सहित कई बीमारियों के रोगजनन का एक महत्वपूर्ण घटक है.
परिस्त्राव शारीरिक प्रवाह की शर्तों के तहत endothelial कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं (ईसी) घूम की बातचीत शामिल है एक जटिल बहु कदम प्रक्रिया है. प्रक्रिया (एक) सेल रोलिंग, चुनाव आयोग की luminal सतह के लिए (ख) फर्म आसंजन, और आयोग के पार (ग) स्थानांतरगमन शामिल हैं. महत्वपूर्ण बात है, परिस्त्राव झरना के प्रत्येक चरण सी के एक सबसेट द्वारा नियंत्रित किया जाता हैपक्ष प्रकार विशिष्ट और प्रजाति विशेष के अणुओं. हालांकि, विशेष सेल सबसेट के परिस्त्राव कि विनियमित विस्तृत आणविक तंत्र अच्छी तरह से बड़े पैमाने पर होने के कारण खून में शर्तों recapitulating की तकनीकी कठिनाई को समझ नहीं रहे हैं. उपन्यास 3 डी डिवाइस इन तकनीकी चुनौतियों पर काबू पाने और सेल प्रवास के जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ में सुधार होगा कि प्रदर्शन किया जा प्रयोगों की अनुमति देने के लिए बनाया गया है यहां का वर्णन किया.
सेल प्रवास मध्यस्थता अणुओं है कि महत्वपूर्ण चिकित्सीय लक्ष्य कर रहे हैं. विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के प्रवास को नियंत्रित कि आणविक घटनाओं की एक विस्तृत समझ चिकित्सकीय पदोन्नति या परिस्त्राव के निषेध के लिए उपन्यास लक्ष्यों की पहचान करने में मदद करेंगे. उदाहरण के लिए, चोट या अध: पतन की साइटों की ओर चिकित्सकीय स्टेम कोशिकाओं के प्रवास (वयस्क नवजात या भी से भ्रूण के ऊतकों से निकाली गई है) को बढ़ाने के हस्तक्षेप कि ऊतक उत्थान में महान उपयोगिता की होगी.Pluripotent स्रोतों से प्राप्त कोशिकाओं सहित चिकित्सकीय स्टेम कोशिकाओं की इन विट्रो पीढ़ी में और पूर्व vivo चालाकी से वयस्क स्टेम सेल (विस्तार आनुवंशिक चालाकी, और विभिन्न एंजाइमों के साथ pretreated) 1 में में रुचि बढ़ रही है. इस प्रकार, वे उपचारात्मक उद्देश्यों के लिए उपयोग किया जाता है इससे पहले कि स्टेम कोशिकाओं की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए उपन्यास प्रौद्योगिकियों की आवश्यकता है. अन्य मानकों के अलावा, कोशिकाओं बहुफोकस विकारों के लिए उपचार स्टेम कोशिकाओं 2 की नसों में प्रशासन की आवश्यकता हो सकती है, क्योंकि कुशलतापूर्वक प्रचलन से बाहर निकलने में सक्षम होना चाहिए. दरअसल, स्टेम कोशिका जीव विज्ञान में वर्तमान चुनौतियों में से एक अत्यंत कम क्षमता पर काबू पाने के लिए है जो ऊतकों को नुकसान 3-6 की साइटों के लिए स्टेम सेल घर, स्टेम सेल प्रवास के बारे में हमारी समझ में इस अंतर को पता करने के लिए आवश्यकता पर प्रकाश डाला साथ. इसके विपरीत, रणनीतियों विशिष्ट घर वापस आना अणुओं को लक्षित करके ब्लॉक सेल प्रवास में के उपचार के लिए उपयोगी होगा किflammatory और autoimmune रोग के रूप में अच्छी तरह से मेटास्टेटिक कैंसर के रूप में. इस प्रकार, सेल प्रवास और परिस्त्राव दौरान घूम कोशिकाओं और चुनाव आयोग के बीच बातचीत में मध्यस्थता कि आणविक तंत्र को समझने translational चिकित्सा और दवा की खोज करने के साथ ही बुनियादी विज्ञान के लिए प्रासंगिक है.
सेल प्रवास के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध तरीकों का एक नंबर उपलब्ध नहीं है. हालांकि, इन तरीकों नया 3 डी उपकरण के साथ दूर किया जा सकता है कि कमियों है.
पशु मॉडल
ऐसे immunocompromised चूहों और आनुवंशिक रूप से चालाकी से चूहों के रूप में पशु मॉडल, vivo में मानव कोशिकाओं के प्रवास अध्ययन करने के लिए उपयोगी उपकरण किया गया है. हालांकि, इन मॉडलों के लिए एक महत्वपूर्ण दोष यह है कि मानव कोशिकाओं को कई कोशिका की सतह अणुओं में प्रजाति विशेष अनुक्रम मतभेद की वजह से भाग में, माउस चुनाव आयोग पर मौजूद आसंजन अणुओं के साथ खराब है कि बातचीत है. इस प्रकार, कृन्तकों के उपयोग का अध्ययन करने के लिएमानव कोशिका माइग्रेशन प्रमाण के अनुसार मानव अंग विशेष संवहनी बेड में घटनाओं को प्रतिबिंबित करने की संभावना नहीं है. इसके अलावा, vivo मॉडल में दवा उम्मीदवारों के उच्च throughput प्रदर्शन के लिए उपयुक्त नहीं हैं. घर वापस आना सेल अध्ययन करने के लिए उपयोग कर vivo मॉडल में पारंपरिक यह मुश्किल उपन्यास घर वापस आना अणुओं की पहचान करने और लक्षित करने के लिए कर रही है, परिस्त्राव झरना के विभिन्न चरणों के बीच भेदभाव नहीं करते. intravital माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण इस जरूरत को संबोधित करने के लिए विकसित किया गया था और जानकारीपूर्ण किया गया है, लेकिन, इस तकनीक बहुत समय और 7,8 श्रम प्रधान है.
स्टेटिक स्थानांतरगमन assays है:
Transwell या एक झरझरा झिल्ली और भर Boyden कक्ष assays के उपाय सेल प्रवास व्यापक रूप से प्रवास पढ़ाई में उपयोग किया जाता है. परख कोशिकाओं की केमोकाइन की मध्यस्थता प्रवास भी यह सेल गतिशीलता और सेल बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) बातचीत न केवल अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि लाभ है, लेकिनझरझरा झिल्ली पर हो एक चुनाव आयोग monolayer के पार. दुर्भाग्य से, स्थिर शर्तों के तहत phenotype और चुनाव आयोग के समारोह में शारीरिक प्रवाह 9,10 के तहत उन लोगों से काफी अलग है. इस प्रकार, Transwell assays में पाए जाते हैं कि chemotactic घटनाओं ईमानदारी कतरनी तनाव में पलायन कोशिकाओं और चुनाव आयोग के बीच बातचीत की नकल नहीं है. इसके अलावा, समग्र प्रक्रिया को चयनात्मकता की एक अतिरिक्त आयाम कहते हैं जो घर वापस आना झरना का "रोलिंग" कदम है, स्थिर Transwell assays में नहीं होती है. इस तकनीक चुनाव आयोग monolayer भर केमोकाइन की मध्यस्थता सेल प्रवास के मात्रात्मक मूल्यांकन की अनुमति है, जबकि इस प्रकार, यह vivo में रक्त प्रवाह mimics कि कतरनी तनाव प्रदान करने के लिए अपनी असमर्थता द्वारा सीमित है.
कतरनी तनाव में assays:
दीवार कतरनी तनाव ईसी समारोह 9,10 को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है. कतरनी बलों cascades संकेत की तेजी सक्रियण, transc प्रेरितription कारक है, और चुनाव आयोग 11,12 में अंतर जीन अभिव्यक्ति. यह जानकारी आसंजन assays के अगली पीढ़ी के विकास के लिए नेतृत्व - समानांतर लामिना का प्रवाह कक्षों और केशिकाओं - रोलिंग अध्ययन और कतरनी तनाव 7,13 की शर्तों के तहत चुनाव आयोग को कोशिकाओं के आसंजन के लिए. इन assays के लिए सीमित कारक वे केवल रोलिंग और आसंजन उपाय कर सकते हैं कि है, लेकिन बसना पर जाना होगा कि एक पक्षपाती सेल और चुनाव आयोग monolayer पर "गिरफ्तार" है और बसना नहीं चाहते हैं कि एक पक्षपाती सेल के बीच अंतर नहीं है. इसके अलावा, इन assays एक केमोकाइन ढाल की ओर कोशिकाओं के प्रवास उपाय नहीं कर सकते.
कई रिपोर्टों प्रवाह 14 की शर्तों के तहत गिलास स्लाइड पर हो एक चुनाव आयोग monolayer के नीचे क्रॉल करने के लिए पक्षपाती कोशिकाओं की क्षमता का वर्णन किया है. इस रेंगने तकनीक को सीमाओं में शामिल हैं: यह कोशिकाओं का केवल एक सीमित संख्या का विश्लेषण करती है, यह गैर मात्रात्मक है, यह मैट्रिक्स और सेल पर रेंगने सेल का विश्लेषण करती हैएल सतह नहीं है लेकिन एक chemotactic ढाल की ओर प्रवास, और यह transmigrated कोशिकाओं को अलग होने की अनुमति नहीं है. इस परख चुनाव आयोग monolayer के लिए कतरनी तनाव लागू करने का फायदा है इस प्रकार, हालांकि, यह एक केमोकाइन ढाल की ओर कोशिकाओं के प्रवास यों नहीं कर सकते हैं.
यहाँ वर्णित उपन्यास 3 डी तकनीक एक स्थिर केमोकाइन ढाल (कम डिब्बे) के साथ कतरनी बल (ऊपरी डिब्बे) के संयोजन के द्वारा इन कमियों के कई काबू पा और परिस्त्राव झरना (चित्रा 1) के प्रत्येक चरण की मात्रात्मक मूल्यांकन परमिट. इस उपकरण में भी चुनाव आयोग और microenvironment के बीच crosstalk घूम कोशिकाओं की परिस्त्राव समर्थन करने के लिए चुनाव आयोग की क्षमता को प्रभावित करती है कि कैसे की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. निम्नलिखित प्रोटोकॉल 3 डी प्रवाह चैम्बर डिवाइस का उपयोग करने के लिए कदम दर कदम पद्धति का वर्णन करता है.
Protocol
1. कोलेजन कोटिंग द्वारा सेल ग्रोथ के लिए ऊपरी और निचले सम्मिलित करता है तैयार
- प्रयोग के लिए आवश्यक सम्मिलित करता है की संख्या की गणना. एक अलग बाँझ पेट्री डिश (35 x 10 मिमी) में प्रत्येक डालने प्लेस और विकिरण (11 Gy) के द्वारा बाँझ.
- 50 माइक्रोग्राम / एमएल, डालने के प्रति 154 μl (सतह क्षेत्र 1.54 सेमी 2 डालें): झिल्ली कोटिंग के लिए कोलेजन समाधान तैयार है.
- डालने झिल्ली (पिपेट टिप सतह को छूने नहीं है) की सतह पर और फिर ध्यान पर एक बड़ी गिरावट के लिए फार्म विभाज्य के बाकी जोड़ने एक सर्कल में कोलेजन समाधान के कई बूँदें (ड्रॉप प्रति ~ 20 μl) रखें झिल्ली सतह. कोलेजन समाधान अर्धगोल रहता है और झिल्ली सतह से पलायन नहीं है कि सुनिश्चित करें.
- एक ढक्कन के साथ पेट्री डिश कवर और एक फ्लैट सतह पर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
- कोलेजन समाधान Aspirate और 160 μl पीबीएस के साथ कवर द्वारा एक बार झिल्ली धोने.
- ASPIRAते पीबीएस और ढक्कन की जगह. उसी दिन उपयोग कर रहा है, कमरे के तापमान पर एक सूखी जगह में पेट्री डिश जगह है. अन्यथा, 4 डिग्री सेल्सियस पर पकवान जगह और 7 दिनों के भीतर डालने का उपयोग करें.
2. अपर सम्मिलित करता है पर संस्कृति endothelial कोशिकाओं
- वांछित संस्कृति के माध्यम में चुनाव आयोग के निलंबन की तैयारी. सेल व्यवहार्यता> 98% है कि यह सुनिश्चित करें और तुरंत का उपयोग करें.
नोट: मानव नाल की शिरा चुनाव आयोग (HUVEC), 4 के लिए डालने के प्रति 160 μl में x 10 5 कोशिकाओं का इस्तेमाल किया जाता है.
- खंड 1 में तैयार कोलेजन लेपित आवेषण के साथ पेट्री डिश लो, बर्तन से सम्मिलित करता है दूर नहीं है. कोलेजन में लिपटे झिल्ली (पिपेट टिप स्पर्श सतह देना नहीं है) की सतह पर एक वृत्त में सेल निलंबन (ड्रॉप के अनुसार लगभग 20 μl) की कई छोटी बूंदों प्लेस और फिर ध्यान से फार्म करने के लिए सेल निलंबन के बाकी जोड़ें एक बड़ी गिरावट. सेल निलंबन हेमिस बनी हुई है कि यह सुनिश्चित करें pherical और झिल्ली सतह से पलायन नहीं है.
- ढक्कन बदलें और ध्यान से कोशिकाओं की झिल्ली को संलग्न करने के लिए अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर (मिलाते हुए बिना) एक 5% सीओ 2 सेल कल्चर इनक्यूबेटर और सेते में व्यंजन जगह है.
- धीरे डालने डिश के तल पर रहता है और पूरी तरह से मध्यम द्वारा कवर किया जाता है यह सुनिश्चित करना कि प्रत्येक पेट्री डिश के लिए संस्कृति के माध्यम से 5 मिलीलीटर जोड़ें. ढक्कन बदलें और ध्यान से इनक्यूबेटर में वापस बर्तन में डाल दिया. 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात संस्कृति कोशिकाओं.
- चुनाव आयोग परत युक्त डालने के नीचे रखा जाएगा जो स्थानीय microenvironment, का प्रतिनिधित्व कोशिकाओं के साथ दूसरा (वैकल्पिक) कम डालने को तैयार करने के लिए एक ही दृष्टिकोण का उपयोग करें.
नोट: निचले सम्मिलित करता प्रयोगों में शामिल कर रहे हैं, ऊपरी और निचले आवेषण पहली 3 डी डिवाइस (चित्रा 4 बी) में सम्मिलित करता है रखने से पहले एक दूसरे से जुड़े हैं.
ई "> 3. 3 डी फ्लो चैंबर डिवाइस इकट्ठा- , ऊपरी और निचले प्लेटें एक साथ भाड़ टयूबिंग का उपयोग गैस विनिमय इकाई के लिए प्लेटें कनेक्ट, एक साफ प्लास्टिक की थैली में इकट्ठे डिवाइस जगह है, और विकिरण से बैग और सामग्री (11 Gy) के बाँझ.
- 70% इथेनॉल के साथ एक बाँझ टिशू कल्चर हुड, स्प्रे में सेल कल्चर इनक्यूबेटर, जगह से एक ट्रे मुस्तैद निकालें, मिटा, और फिर एक बड़ी बाँझ नैपकिन के साथ ट्रे कवर.
- हुड में विकिरणित प्लास्टिक बैग, जगह बाँझ इनक्यूबेटर ट्रे पर बैग और जगह से डिवाइस को हटा दें. प्रदान की ट्यूबिंग साथ क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप करने के लिए डिवाइस से कनेक्ट करें. 0.2 मिलीग्राम / मिनट की एक अधिकतम गति के लिए कार्यक्रम पंप.
नोट: बिजली के सॉकेट के साथ पंप से कनेक्ट करने के लिए, इनक्यूबेटर की पीठ में छेद के माध्यम से बिजली की हड्डी बाहर निकालना. छेद वायुरोधी है विश्वास दिलाता हूं कि हड्डी के आसपास डाकू प्लग का प्रयोग करें.
4. प्रधानमंत्री 3D फ्लो चैंबर डिवाइस
- ट्यूबिंग (ट्यूबिंग का बाँझपन बनाए रखने के लिए छोटे बाँझ नैपकिन का उपयोग) से धातु सुई खींच कर दुकान से प्रवेश ट्यूबिंग डिस्कनेक्ट. एक "प्रवेश" और एक "दुकान" के रूप में ट्यूबिंग का डिस्कनेक्ट अंत के रूप में ट्यूबिंग से जुड़े धातु सुई का प्रयोग करें. मीडिया के साथ 15 मिलीलीटर ट्यूब में धातु सुई इनलेट प्लेस, खाली 15 मिलीलीटर ट्यूब में दुकान जगह है.
- प्रवाह 0.2 मिलीग्राम / मिनट पर वामावर्त और प्रवाह की दर निर्धारित है तो पंप पर मुड़ें. यह डिवाइस (चित्रा 2, बंद करो # 1) को जोड़ता पहले मध्यम तुरंत ट्यूबिंग के अंत तक पहुँच जाता है जब टयूबिंग में 15 मिलीलीटर इनलेट ट्यूब से मध्यम आकर्षित और पंप बंद करने के लिए नकारात्मक दबाव की अनुमति दें.
- खोल देना डिवाइस के ऊपरी और निचले प्लेटें. दवा के 1,550 μl - ध्यान से ऊपरी प्लेट और जगह 1,500 हटानेकम कुओं में (या तो मध्यम अकेले या प्रयोगात्मक chemokines प्लस) उम. कम प्लेट के ऊपर 2 मिमी - अच्छी तरह से लगभग 1 पहुंचता है कि एक गोलार्द्ध के लिए फार्म पर्याप्त मध्यम होता है सुनिश्चित करें.
- कोई बुलबुले आवेषण नीचे फंस रहे हैं, यकीन है कि पेट्री डिश से बाँझ संदंश का उपयोग कम थाली के कुओं के लिए तैयार डालने स्थानांतरण. थाली शुष्क रहता है यह सुनिश्चित करने के लिए कम से थाली की सतह पर दिखाई देता है कि किसी भी मध्यम Aspirate. कम थाली पर वापस ऊपरी प्लेट रखें और शिकंजा उपयोग कर प्लेट फिर से कनेक्ट.
- इसके तत्काल बाद क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप पर बारी और 3 डी डिवाइस के माध्यम से प्रवाह के लिए मध्यम अनुमति देते हैं. उपकरण की दुकान के अंत तरक्की और प्लेटों के बीच अंतरिक्ष के भीतर बुलबुले के गठन को रोकने के लिए इस स्थिति में कक्ष बनाए रखें.
- मध्यम गैस विनिमय इकाई को चैम्बर जोड़ने कक्ष और टयूबिंग भरने के लिए अनुमति देते हैं. मध्यम गैस ई तक पहुंचने से पहले तुरंत पंप बंद करोXchange इकाई (चित्रा 2, # 2 बंद करो). गैस विनिमय इकाई में मध्यम की जगह 3 मिलीग्राम, पंप पर बारी, और हवा के बुलबुले गैस विनिमय इकाई के माध्यम से बचने के लिए अनुमति देते हैं. आउटलेट टयूबिंग (चित्रा 2, बंद करो # 3) के अंत से पहले 3 सेमी - मध्यम 2 पहुंचता है जब मध्यम गैस विनिमय इकाई बाहर निकलने ट्यूबिंग भरने और पंप बंद करने के लिए अनुमति देने के लिए गैस विनिमय इकाई तरक्की.
- छोटे बाँझ नैपकिन का उपयोग कर दुकान को प्रवेश धातु सुई कनेक्ट. वे गैस विनिमय यूनिट तक पहुँच एक बार मध्यम गैस विनिमय इकाई की ओर विपरीत दिशा में बहती है (दक्षिणावर्त) और किसी भी हवाई बुलबुले को हटा रहे हैं सुनिश्चित इसलिए पंप Reprogram. कोई हवाई बुलबुले प्रणाली में रहते हैं कि जाँच करें.
- मध्यम वामावर्त प्रवाह इतना पंप Reprogram. गैस विनिमय इकाई के लिए परीक्षण सेल निलंबन के 100 μl जोड़ें. गैस विनिमय इकाई का ढक्कन बंद, इनक्यूबेटर में काम कर प्रणाली के साथ वापस ट्रे जगह है, और परीक्षण कोशिकाओं circulat करने की अनुमतिवांछित समय के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 डी डिवाइस में ई.
नोट: 70% इथेनॉल के साथ पंप की बिजली कॉर्ड साफ और इनक्यूबेटर के अंदर जगह है.
5. टेस्ट बर्खास्त और परख के लिए नमूने ले लीजिए
- इनक्यूबेटर और हुड में जगह से काम कर प्रणाली के साथ ट्रे निकालें. पंप बंद करो, इनलेट और आउटलेट काटना, और खाली बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूबों में समाप्त होता है जगह.
- अगर उचित उपयोग, जब तक बर्फ पर जगह सेल निलंबन, पंप को चालू करें और सिस्टम से सेल निलंबन इकट्ठा.
- शिकंजा हटाने और ऊपरी प्लेट से उठाने से चैम्बर साफ करें. कम थाली से सम्मिलित करता निकालें और पेट्री डिश को हस्तांतरण.
नोट: सम्मिलित करता है और कल्पना (क्रिस्टल बैंगनी DH 2 हे में 0.05%) बगल में कोशिकाओं की गिनती के दाग या आगे के लिए चुनाव आयोग को इकट्ठा करने trypsinized किया जा सकता हैपरीक्षण.
- मध्यम और कम कुओं से कोशिकाओं ट्यूबों में और 210 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र निकालें. सतह पर तैरनेवाला निकालें धोने और वांछित के रूप में कोशिकाओं resuspend, और विशिष्ट प्रयोगात्मक लक्ष्यों (आगे नीचे) पर चर्चा के अनुसार कोशिकाओं की प्रक्रिया.
Representative Results
murine अस्थि मज्जा व्युत्पन्न चुनाव आयोग लाइन एसटीआर -12 5 माइक्रोन pores के साथ सम्मिलित करता है पर हो गया था. चुनाव आयोग वृद्धि की दर एक खुर्दबीन के तहत नजर रखी थी और ईसी 100% मिला हुआ थे, जब आवेषण 3 डी डिवाइस के निचले कम्पार्टमेंट में कुओं में स्थानांतरित कर दिया गया. तुरंत सम्मिलित करता है रखने से पहले, कम डिब्बे के कुओं अकेले संस्कृति मध्यम (नकारात्मक नियंत्रण) के साथ या stromal सेल व्युत्पन्न कारक -1 (, 5 एनजी / एमएल और 50 एनजी / एमएल एसडीएफ -1) के साथ पूरक मध्यम से भर गया. इसके बाद, 3 डी डिवाइस इकट्ठा किया गया था और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में चैम्बर मध्यम से भर गया था. डिवाइस के ऊपरी डिब्बे में परिचालित होने की कोशिकाओं परीक्षण हौसले murine अस्थि मज्जा की कोशिकाओं (चैम्बर प्रति 3.5 x 10 6 कोशिकाओं) काटा गया. 0.8 dyn के / 2 सेमी का एक परिभाषित कतरनी तनाव 0.2 मिलीग्राम / मिनट पर क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप की गति सेटिंग के द्वारा लागू किया गया था. पूरे काम कर प्रणाली फिर 37 डिग्री सेल्सियस और CE में 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखा गया थाLLS 4 घंटे के लिए चुनाव आयोग monolayer के साथ प्रसारित करने और बातचीत करने की अनुमति दी गई. उस समय के अंत में, घूम कोशिकाओं कक्ष disassembled किया गया था, एकत्र किए गए थे, और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में सम्मिलित करता है हटा दिया गया. transmigrated कोशिकाओं ताजा माध्यम में resuspended धोया कम कुओं, से काटा, और कॉलोनी के गठन सेल (सीएफसी) परख (चित्रा 3) के लिए hematopoietic वृद्धि कारकों के साथ पूरक methylcellulose संस्कृतियों के लिए स्थानांतरित कर दिया गया. जैसी कि उम्मीद थी, हम सीएफसी का एक काफी अधिक संख्या में कुओं अकेले 5 एनजी / एमएल एसडीएफ -1 या मध्यम युक्त करने के लिए की तुलना में 50 एनजी / एमएल एसडीएफ -1 युक्त कुओं को चुनाव आयोग monolayer के पार चले गए पाया.
हम पहले वर्णित के रूप में, सेल प्रवास अध्ययन करने के लिए उपलब्ध इन विट्रो तकनीक में वर्तमान में से कोई भी पलायन कोशिकाओं की परिस्त्राव समर्थन करने के लिए चुनाव आयोग की क्षमता पर स्थानीय microenvironment के प्रभाव का परीक्षण करने में सक्षम हैं. इस 3 डी डिवाइस के साथ प्राप्त किया जा सकता है वर्णन करने के लिए, हमचुनाव आयोग की एक परत और अस्थि मज्जा stromal कोशिकाओं की एक परत के पार hematopoietic कोशिकाओं परिसंचारी की जांच परिस्त्राव. इस के लिए, stromal कोशिकाओं की एक परत युक्त एक दूसरा (कम) डालने के निचले प्लेट (चित्रा 4) में चुनाव आयोग monolayer युक्त ऊपरी डालने के लिए juxtaposed था. ऊपर वर्णित है और transmigrated कोशिकाओं कुओं से काटा और गिना रहे थे के रूप में प्रयोग तब किया गया था. परिणाम चुनाव आयोग monolayer के नीचे stromal कोशिकाओं की एक अतिरिक्त परत की प्रविष्टि काफी एसडीएफ -1 की ओर hematopoietic कोशिकाओं (चित्रा 4) के पलायन में वृद्धि हुई है कि प्रदर्शन किया. यह निष्कर्ष स्थानीय microenvironment के ऊतकों को कोशिकाओं परिसंचारी की भर्ती के लिए योगदान देता है कि धारणा के अनुरूप है.
चित्रा 2. 3 डी डिवाइस सिस्टम का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. ड्राइंग प्रणाली को इकट्ठा करने के लिए आवश्यक तीन बंद हो जाता है पता चलता है. संस्कृति के माध्यम से क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के द्वारा बनाई गई नकारात्मक दबाव से प्रवेश से तैयार की है. मध्यम के प्रवाह को सम्मिलित डिवाइस में रखा जा करने की अनुमति के लिए बंद करो # 1 से बंद है. कक्ष के बंद हो जाने के बाद, पंप swit हैफिर पर ched और चैम्बर तुरंत सम्मिलित करता है पर विकसित कोशिकाओं के सुखाने को रोकने के लिए मध्यम से भर जाता है. बंद करो # 2 गैस विनिमय इकाई में रखा जाना करने के लिए माध्यम की अनुमति देता है. # 3 रोकें प्रवाह इनलेट और आउटलेट के कनेक्शन के लिए बंद कर दिया जा सकता है. प्रवाह पंप पर एक स्विच का उपयोग करके गैस विनिमय इकाई के माध्यम से हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए एक दक्षिणावर्त या वामावर्त दिशा में निर्देशित किया जा सकता है.
चित्रा 3. 3 डी डिवाइस शारीरिक कतरनी तनाव की शर्तों के तहत hematopoietic progenitors के एसडीएफ -1 की मध्यस्थता स्थानांतरगमन का समर्थन करता है. एक: तीन उपकरणों (कम डिब्बे में प्रत्येक युक्त 3 कुओं) को इकट्ठा किया और समानांतर में चलाए जा रहे थे. अकेले मध्यम या 5 या 50 एनजी / एमएल एसडीएफ -1 युक्त मध्यम कम डिब्बे कुओं को जोड़ा गया है. Murine बोपूर्वोत्तर मज्जा कोशिकाओं 4 घंटे के लिए उपकरणों में प्रसारित करने की अनुमति दी गई. इसके बाद, प्रत्येक डिवाइस disassembled किया गया था और एसडीएफ -1 (पीला) की ओर transmigrated था कि कोशिकाओं, कम कुओं से एकत्र गिना, और hematopoietic वृद्धि कारक (GF) के साथ पूरक methylcellulose में सुसंस्कृत थे. चौदह दिन बाद, कालोनियों खुर्दबीन के नीचे रन बनाए थे बी:. कम डिब्बों से बरामद progenitors की संख्या (कॉलोनी कोशिकाओं के गठन, सीएफसी) ± मतलब हालत प्रति तीन कुओं में से एसडी के रूप में दिखाया गया है. * पी <0.05.
4 चित्रा. hematopoietic कोशिकाओं और endothelial कोशिकाओं के बीच बातचीत पर microenvironment के प्रभाव. एक: चित्रण सुसंस्कृत सेंट के साथ एक दूसरे झरझरा झिल्ली की स्थिति से पता चलता हैचुनाव आयोग के साथ ऊपरी झिल्ली के नीचे romal fibroblasts (एस एफ). . अन्य संक्षिप्त रूपों के रूप में चित्रा 1 ए बी के लिए वर्णित हैं:. सुसंस्कृत एस एफ ऊपरी झिल्ली के नीचे डाला गया था के साथ अतिरिक्त झिल्ली (कम डालने) सी: तीन उपकरणों (प्रत्येक युक्त 3 कुओं) समानांतर में चलाए जा रहे थे. अकेले मध्यम या 50 एनजी / एमएल एसडीएफ -1 में एसडीएफ -1 युक्त मध्यम कम डिब्बे कुओं को जोड़ा गया है. नकारात्मक नियंत्रण कक्षों अनुसूचित जाति, एसडीएफ -1, या दोनों को छोड़ दिया जाए. अस्थि मज्जा की कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए प्रसारित करने की अनुमति दी गई इसके बाद, प्रत्येक डिवाइस disassembled किया गया था और transmigrated कोशिकाओं कम डिब्बे कुओं से एकत्र और गिना रहे थे. बरामद transmigrated कोशिकाओं की संख्या हालत प्रति तीन कुओं में से ± मतलब एसडी के रूप में दिखाया गया है. * पी <0.05.
Discussion
3 डी डिवाइस स्टेम कोशिका जीव विज्ञान, संवहनी जीव विज्ञान, रुधिर विज्ञान, कैंसर, autoimmunity, और सूजन सहित विभिन्न क्षेत्रों में अनुसंधान के लिए एक उपयोगी प्रौद्योगिकी हो सकता है. 3 डी डिवाइस शोधकर्ताओं ने स्टेम सेल परिस्त्राव झरना के हर कदम को विनियमित आणविक तंत्र की जांच करने के लिए hematopoietic, mesenchymal, तंत्रिका, और अन्य स्टेम कोशिकाओं के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो जाएगा. सेल प्रवास के अध्ययन के शोधकर्ताओं ने यह भी टी और बी लिम्फोसाइटों, monocytes, neutrophils, इयोस्नोफिल्स, एन.के. कोशिकाओं, और अन्य प्रवासी कोशिकाओं के भिन्न प्रवासी तंत्र की जांच करने के लिए इस उपकरण का उपयोग कर सकते हैं. संवहनी जीव विज्ञान में, डिवाइस सेल भर्ती समर्थन करने के लिए और इन विट्रो में रक्त मस्तिष्क बाधा नकल करने के लिए चुनाव आयोग की क्षमता पर स्थानीय microenvironment के प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयोगी हो जाएगा. रोग के रोगजनन पर ध्यान केंद्रित शोधकर्ताओं के लिए, डिवाइस प्रकार मैं मधुमेह, मील के दौरान अग्न्याशय में साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं के प्रवास अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैअस्थमा रोगियों, neutrophils के प्रवास, monocytes, और विकारों की एक किस्म, चिकित्सा साइटों घाव कोशिकाओं की भर्ती, neovasculature साथ साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं के संपर्क में सूजन की साइटों में लिम्फोसाइटों के फेफड़ों में इयोस्नोफिल्स के gration, और भर्ती ट्यूमर में साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं की.
उपन्यास 3 डी डिवाइस भी translational विज्ञान के लिए और preclinical दवा के विकास और जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण हो जाएगा. उदाहरण के लिए, डिवाइस, नसों में प्रशासन के लिए चिकित्सकीय कक्ष निलंबन की तैयारी अनुकूलन करने के लिए सामान्य ऊतकों की तुलना में घायल ऊतकों को चिकित्सीय कोशिकाओं की भर्ती का परीक्षण करने के लिए, और विशिष्ट अंग या इस में ऊतक endothelium और microenvironment के भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रक्रिया. नशीली दवाओं के विकास के लिए, डिवाइस लक्ष्य है कि ट्यूमर कोशिकाओं को दवा उम्मीदवारों परीक्षण और परिस्त्राव झरना के हर कदम ब्लॉक, एक दवा देने के रूप में पलायन कोशिकाओं का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैट्यूमर साइटों के लिए वाई वाहन, मानव अंग विशेष अन्तःचूचुक या स्थानीय ऊतक विशेष microenvironment के समारोह को विनियमित, और घर वापस आना झरना के विभिन्न चरणों का है कि विनियमित दवाओं के संयोजन का परीक्षण करने के लिए है कि दवाओं का परीक्षण करने के लिए. अंत में, एक उच्च throughput प्रणाली में परिवर्तित कर दिया है, जब डिवाइस लक्ष्य अणुओं सेल तस्करी mediating कि छोटे अणुओं, पेप्टाइड, और एंटीबॉडी स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
तकनीकी जानकारी और टिप्स
प्रवाह के नीचे रोलिंग और आसंजन परिस्त्राव झरना में महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं और इन विवो में सेल प्रवास की दक्षता के लिए काफी योगदान करते हैं. विशेष रूप से, इन चरणों इन विट्रो में स्थिर assays के लिए योगदान नहीं है. हालांकि, स्थिर स्थानांतरगमन assays के कम संबंध में बातचीत (रोलिंग) और फर्म आसंजन समर्थन करने के लिए चुनाव आयोग की क्षमता सहित सेल अस्तित्व और समारोह, पर कतरनी तनाव के प्रभाव का परीक्षण प्रयोगों में नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोगी होते हैं.
3 डी डिवाइस में प्रयोगों के लिए माध्यम के चुनाव महत्वपूर्ण है. मीडिया विशेष रूप से लंबी ऊष्मायन समय के दौरान, घूम कोशिकाओं के अस्तित्व को प्रभावित कर सकते हैं कि विभिन्न वृद्धि कारक होते हैं. इसके अलावा, 2 सीए की सांद्रता + और 2 मिलीग्राम +, शारीरिक प्रवाह की शर्तों के तहत चिपकने वाली बातचीत को प्रभावित कर सकता है जो वाणिज्यिक संस्कृति मीडिया में काफी भिन्नता है. 3 डी डिवाइस के साथ प्रयोगों की योजना बनाते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए कि अन्य तकनीकी जानकारी नीचे चर्चा कर रहे हैं.
चुनाव आयोग monolayer के चयन
चुनाव आयोग की कोशिका की सतह हस्ताक्षर प्रयोगात्मक डिजाइन में ध्यान में रखा जाना चाहिए जो प्रजातियों और मूल और सेल संस्कृति शर्तों के ऊतक, सहित विभिन्न मापदंडों से प्रभावित है. कुछ आमतौर पर इस्तेमाल किया चुनाव आयोग फेफड़ों व्युत्पन्न माइक्रोवैस्कुलर चुनाव आयोग (LDMVEC), हड्डी चुनाव आयोग (BMDEC), मस्तिष्क व्युत्पन्न चुनाव आयोग (BDEC) मज्जा व्युत्पन्न, और HUVEC शामिल हैं.चुनाव आयोग के गुणों को भी अपने मूल के साथ बदलती हैं. उदाहरण के लिए, रोलिंग और आसंजन के लिए जिम्मेदार हैं जो BMDEC अनिवार्यता से व्यक्त selectins और Vcam -1,, BDEC, LDMVEC, और HUVEC सामान्य परिस्थितियों में इन अणुओं व्यक्त नहीं करते जबकि. इसलिए, BDEC, LDMVEC, और HUVEC साथ लेपित आवेषण TNF α (10 एनजी / एमएल, 4 घंटा) या सूजन की नकल और घर वापस आना अणुओं की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए अन्य कारकों के साथ pretreated किया जा सकता है.
स्थानीय microenvironment के साथ crosstalk परीक्षण
स्थानीय microenvironment के चुनाव आयोग के कार्यों को नियंत्रित करता है और सेल परिस्त्राव में भाग लेता है कैसे समझ में रुचि बढ़ रही है. हमारे परिणाम चुनाव आयोग monolayer के नीचे stromal कोशिकाओं की एक monolayer की प्रविष्टि काफी कोशिकाओं परिसंचारी के परिस्त्राव बढ़ जाती है कि प्रदर्शित करता है. यह निष्कर्ष चुनाव आयोग और स्ट्रोमा बीच crosstalk घूम कोशिकाओं की परिस्त्राव समर्थन करने के लिए चुनाव आयोग की क्षमता को बढ़ाता है, यह दर्शाता है कि. Moreoदेखें, विभिन्न microenvironments (जैसे mesenchymal स्टेम सेल, फेफड़ों fibroblasts, ट्यूमर कोशिकाओं, astrocytes) से कोशिकाओं की प्रविष्टि विशिष्ट संवहनी बेड की नकल करने में मदद कर सकता है. विशेष रूप से, मस्तिष्क व्युत्पन्न चुनाव आयोग और astrocytes का एक संयोजन रक्त मस्तिष्क बाधा नकल करने के लिए एक उपयोगी तरीका हो सकता है. इसी तरह, रोगियों, या इन विट्रो में चालाकी से सामान्य कोशिकाओं से प्राप्त कोशिकाओं, एक विशिष्ट रोगग्रस्त microenvironment नकल मदद कर सकता है.
हमारे अध्ययन में, हम 50% संगम की वृद्धि हुई stromal कोशिकाओं के साथ कम आवेषण इस्तेमाल किया. सम्मिलित करता है पर microenvironmental कोशिकाओं के अधिकतम घनत्व अध्ययन के लक्ष्यों पर निर्भर करेगा हालांकि, यह आसानी से और चालाकी से नियंत्रित किया जा सकता है.
एक कतरनी तनाव दर का चयन
इस वॉन Andrian एट अल द्वारा प्रदर्शन किया गया है क्योंकि 0.8 dyn के / 2 सेमी की कतरनी तनाव यहां इस्तेमाल किया गया था. अस्थि मज्जा microvasculatur में कतरनी तनाव होनाhematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं प्रचलन से बाहर निकलें और सामान्य शारीरिक स्थितियों 15 के तहत ऊतकों में प्रवेश जहां ई,. इसके विपरीत, कतरनी तनाव के उच्च स्तर सेल परिस्त्राव सीमित है जहां बड़े जहाजों में मनाया जाता है. इसलिए, उच्च कतरनी तनाव दरों में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के परिस्त्राव जांच प्रयोगों के लिए अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
कतरनी तनाव में कोशिकाओं के अस्तित्व सेल प्रकार और पूर्व vivo सेल उपचार (गोंचारोवा एट अल., अप्रकाशित टिप्पणियों) सहित कई कारकों पर निर्भर करता है, और इस प्रकार ध्यान से परीक्षण के दौरान मूल्यांकन किया जाना चाहिए. कतरनी तनाव का स्तर भिन्न (कतरनी तनाव प्रतिरोध) के लिए सेल संवेदनशीलता 0.8 dyn के सेमी / 2 से 6 dyn के / 2 सेमी से संवर्द्धित कतरनी तनाव दर को बढ़ाने के लिए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप प्रोग्रामिंग द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. इन परीक्षणों के दौरान, कोशिकाओं के रूप में उपयोग कर कोशिका मृत्यु की निगरानी के लिए गैस विनिमय चैम्बर से समय समय पर एकत्र किया जा सकता हैऐसे trypan नीले अपवर्जन, annexin वी और पीआई धुंधला, और apoptosis मार्कर अभिव्यक्ति के रूप में कहते हैं.
प्रयोगों पैरेन्काइमा से व्युत्पन्न पूर्व vivo इंजीनियर कोशिकाओं या कोशिकाओं के कतरनी तनाव प्रतिरोध परीक्षण करने के लिए तैयार कर रहे हैं, तो यह इस तरह रक्त जनित कोशिकाओं के रूप में अतिरिक्त सकारात्मक नियंत्रण, प्रयोगों में शामिल हैं जो सिफारिश की है.
डालने ताकना आकार और ईसीएम कोटिंग का चयन
इंसर्ट के कई ताकना आकार (3, 5, और 8 माइक्रोन) के साथ उपलब्ध हैं. ताकना आकार के चुनाव घूम परीक्षण कोशिकाओं के आकार और गुणों पर निर्भर करेगा, जो भी स्थिर Transwell assays के लिए मामला है. एक बड़ा छेद के आकार (8 माइक्रोन) के साथ सम्मिलित करता है इस तरह के उपकला मूल के ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में बड़े कोशिकाओं की परिस्त्राव परीक्षण करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं. Leukocytes या hematopoietic स्टेम कोशिकाओं को और अधिक सामान्यतः 5 माइक्रोन ताकना आवेषण के साथ परीक्षण कर रहे हैं, और 3 सुक्ष्ममापी ताकना सम्मिलित करता है सबसे अच्छा है की परिस्त्राव परीक्षण के लिए आरक्षित हैंmaller कोशिकाओं. हालांकि, अकेले परीक्षण सेल आकार केवल महत्वपूर्ण कारक नहीं है और हम कई ताकना आकार के साथ सम्मिलित करता है परीक्षण की सलाह देते हैं.
हमारे प्रारंभिक अध्ययन में, हम सम्मिलित करता है पर चुनाव आयोग के विकास का समर्थन करने के लिए और> 4 घंटे के लिए कतरनी तनाव का सामना करने की क्षमता के लिए विभिन्न ईसीएम का परीक्षण किया. ईसीएम Matrigel, पाली डी lysine, फ़ाइब्रोनेक्टिन, laminin, टाइप शामिल परीक्षण मैं कोलेजन, hydrogel, मेटा केरातिन मैं, द्वितीय, तृतीय, चतुर्थ, और Extracel. चुनाव आयोग के विकास के लिए सबसे अच्छा परिणाम Extracel, फ़ाइब्रोनेक्टिन, और कोलेजन के साथ प्राप्त किया गया. हालांकि, हमारे हाथ में, 0.8 ग्राम / 2 सेमी में Extracel काफी झिल्ली भर में परीक्षा कक्षों की स्थानांतरगमन कम कर दिया. इसलिए हम अब सम्मिलित करता है की कोटिंग के लिए फ़ाइब्रोनेक्टिन (5 ग्राम / 2 सेमी) या कोलेजन (5 ग्राम / 2 सेमी) का उपयोग करें. हालांकि, ईसीएम का इष्टतम पसंद शायद चुनाव आयोग के प्रकार और परीक्षण कोशिकाओं के शरीर बदलने वाला (आत्मा) गुण दोनों से प्रभावित हो जाएगा. एक प्रारंभिक प्रयोग integri परीक्षण करने के लिए किया जाना चाहिएचुनाव आयोग monolayer के ty के चयनित ईसीएम पर हो. उदाहरण के लिए, संस्कृति के माध्यम से भरा पेट्री डिश में चुनाव आयोग monolayers के साथ जगह पूर्व लेपित सम्मिलित करता है, कतरनी तनाव कम (सेटिंग) बनाने के लिए एक प्रकार के बरतन में व्यंजन जगह है, और 37 पर सेते डिग्री सेल्सियस और 5% से 12 घंटे के लिए सीओ 2. कतरनी तनाव से संपर्क के बाद चुनाव आयोग की अखंडता क्रिस्टल बैंगनी धुंधला का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है.
इष्टतम परीक्षण सेल सांद्रता का चयन
प्रचलन से बाहर निकलने के लिए परीक्षण कोशिकाओं की क्षमता को प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए विशिष्ट कई विशेषताओं पर निर्भर करता है. सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणाम उत्पन्न करने के लिए, घूम सेल घनत्व कोशिकाओं के लिए पर्याप्त संख्या में सकारात्मक नियंत्रण कुओं में विस्थापित कि यह सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. इसलिए, हम सिस्टम में लोड कोशिकाओं की संख्या और के बीच संबंधों को समझने की सेल घनत्व की एक श्रेणी (जैसे 10 3 / मिलीलीटर से 10 7 / एमएल) के साथ प्रारंभिक परीक्षणों प्रदर्शन की सिफारिशस्थानांतरगमन से गुजरना है कि कोशिकाओं की संख्या.
इसके अलावा, इष्टतम घूम एकाग्रता विभिन्न स्रोतों से प्राप्त एक ही सेल प्रकार के लिए भिन्न हो सकती है. उदाहरण के लिए, CD34 + कोशिकाओं hematopoietic स्टेम कोशिकाओं और प्रतिबद्ध वंश विशेष पूर्वज दोनों युक्त एक विषम सेल आबादी हैं. वे अस्थि मज्जा से प्राप्त किया जा सकता है, परिधीय रक्त जुटाए, और गर्भनाल रक्त. इन तीन स्रोतों से प्राप्त CD34 + कोशिकाओं अलग घर वापस आना और engrafting क्षमताओं 16-18 के अधिकारी है, इसलिए 3 डी डिवाइस में इन कोशिकाओं का परीक्षण करने के लिए की स्थिति एक पूर्ण पैमाने पर अध्ययन से पहले अनुकूलित किया जाना चाहिए.
इष्टतम सेल संचलन समय का चयन
इष्टतम परिसंचरण समय प्रत्येक कोशिका प्रकार के अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए. संचलन के लिए आवश्यक न्यूनतम समय स्थिर प्रवास assays के परिणाम से extrapolated किया जा सकता है, लेकिन इस Exten किया जा सकता हैकोशिकाओं कतरनी तनाव के अधीन हैं जब ded. 4 और 96 घंटे के बीच संचलन बार परीक्षण पायलट अध्ययन की सिफारिश की है.
गैस विनिमय इकाई
गैस विनिमय इकाई का मुख्य उद्देश्य मानक टिशू कल्चर इन्क्यूबेटरों में सेटिंग्स के लिए इसी तरह की 3 डी डिवाइस के माध्यम से घूम मध्यम, में सीओ 2 का इष्टतम एकाग्रता बनाए रखने के लिए है. गैस विनिमय इकाई भी परीक्षण कोशिकाओं और यौगिकों जोड़ने के लिए और परीक्षण के दौरान जांच और नमूने इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
परीक्षण सेल नंबर का मूल्यांकन
घूम कोशिकाओं गैस विनिमय इकाई के माध्यम से प्रयोग के दौरान अलग समय पर जांचा जा सकता है. प्रयोग के अंत में, प्रचलन में शेष कोशिकाओं दुकान से एकत्र किया जा सकता है. 3 डी डिवाइस के प्रयोग के अंत में disassembled किया जाता है, transmigrated कोशिकाओं कम कुओं से काटा और च एकत्र किया जा सकता हैया आगे के विश्लेषण. इनपुट कोशिकाओं unlabeled रहे हैं, transmigrated कोशिकाओं trypan नीले और माइक्रोस्कोप प्रगणित रहते / मृत कोशिकाओं के साथ दाग जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, इनपुट कोशिकाओं 3 डी डिवाइस में लोड करने से पहले जीना सेल इमेजिंग के लिए उपलब्ध कई "सेल ट्रैकर" रंगों में से एक के साथ लेबल किया जा सकता है, इस मामले में, काटा कोशिकाओं प्रतिदीप्ति के quantitation के लिए lysed जाना चाहिए transmigrated.
इष्टतम नमूना आकार का चयन
सांख्यिकीय विश्लेषण की अनुमति देने के लिए, एक नमूने का आकार एक दो तरफा टी परीक्षण का उपयोग कर 0.05 का एक महत्व स्तर पर परीक्षण किया गया जब दो गुटों के बीच का मतलब प्रतिशत परिवर्तन में काल्पनिक अंतर का पता लगाने के लिए लगभग 80% शक्ति प्रदान करेगा कि चयनित किया जाना चाहिए. अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के साथ अपने अनुभव के आधार पर, हम 3 डी डिवाइस प्रयोगों के लिए प्रयोगात्मक हालत प्रति तीन कुओं का उपयोग करें. हालांकि, इष्टतम नमूना आकार प्रयोग करने के लक्ष्य के साथ अलग अलग होंगे और ई निर्धारित किया जाना चाहिएmpirically. एकाधिक प्रतिगमन सांख्यिकीय परीक्षण, दो तरफा टी परीक्षण, और विचरण के विश्लेषण के परिणामों के सांख्यिकीय प्रासंगिकता को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Chemokines के चयन
सभी स्थानांतरगमन assays के लिए के रूप में, chemoattractant का विकल्प परीक्षण कोशिकाओं के गुणों को और अध्ययन के लक्ष्य से तय किया जाएगा. एसडीएफ -1 hematopoietic कोशिकाओं के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित chemoattractant है. हमारे हाथ में, 50 एनजी / एमएल एसडीएफ -1 की एकाग्रता अस्थि मज्जा व्युत्पन्न hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की परिस्त्राव को प्रोत्साहित करने के लिए इष्टतम था. हम भी mesenchymal स्टेम सेल 19 के लिए chemoattractants रूप C3a और bFGF के उपयोग. हालांकि, हम एक पूर्ण पैमाने पर अध्ययन से पहले इष्टतम एकाग्रता रेंज की पहचान करने के लिए chemokines के प्रत्येक केमोकाइन और पार titrating संयोजन titrating की सलाह देते हैं. कुछ प्रकार की कोशिकाओं के लिए, chemotactic कारकों के संयोजन फायदेमंद हो सकता है. विशिष्ट कोशिकाओं परीक्षण के लिए chemokines चोर, अज्ञात या उपलब्ध नहीं हैं तोउत्तेजित लिम्फोसाइटों, fibroblasts, और अन्य कोशिकाओं से ditioned मीडिया chemoattractants के एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
Readout के मापदंडों का चयन
3 डी डिवाइस की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन किया जा सकता है कि स्थानांतरगमन प्रयोगों के प्रकार का विस्तार होगा, और प्रयोगों की सफलता readout के मापदंडों के विचारशील विचार और डिजाइन पर निर्भर करेगा. एक नियम के रूप में, कोशिकाओं ऊपरी (प्रचलन) डिब्बे से एकत्र की है और कम (स्थिर) कम्पार्टमेंट सेल गिनती के रूप में एक ही समय में व्यवहार्यता के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए. कुछ कक्षों microvasculature में मनाया शारीरिक कतरनी तनाव को कम सहनशीलता होती है. इस मामले में मृत कोशिकाओं की संख्या ऊपरी डिब्बे में वृद्धि की जाएगी. चुनाव आयोग के स्तर पर (या फंस) को गिरफ्तार कर लिया पक्षपाती कोशिकाओं की संख्या परीक्षण कोशिकाओं द्वारा विशेष रूप से व्यक्त मार्करों के immunocytochemistry के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. CD31 और vWF के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जा सकता हैचुनाव आयोग का पता लगाने के लिए और परीक्षण की कोशिकाओं और चुनाव आयोग के बीच भेदभाव की अनुमति है. इसके अलावा, चुनाव आयोग monolayer की अखंडता को प्रत्येक परीक्षा के अंत में निगरानी की जानी चाहिए.
एकत्र कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन विश्लेषण के प्रकार 'जांचकर्ताओं प्रयोगात्मक लक्ष्यों पर निर्भर करेगा, लेकिन प्रोटीन और qPCR, FACS विश्लेषण द्वारा सतह अणु अभिव्यक्ति, FACS और पश्चिमी सोख्ता द्वारा संकेत दे रास्ते के सक्रियण, और पहलू से जीन अभिव्यक्ति में विश्लेषण परिवर्तन शामिल हो सकते हैं एलिसा द्वारा स्राव. हम transmigrated अस्थि मज्जा की कोशिकाओं hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (चित्रा 3) की गणना करने में सुसंस्कृत जिसमें हमारे अपने काम से सबूत के रूप में कार्यात्मक परीक्षण का एक विशाल सरणी, इन विट्रो में एकत्र कोशिकाओं पर संभव हो रहे हैं. एकत्र नमूने भी विवो assays में की एक किस्म में परीक्षण किया जा सकता है.
Vivo में परीक्षण कोशिकाओं के व्यवहार की भविष्यवाणी करने में मदद कर सकते हैं कि एक महत्वपूर्ण पैरामीटर जाते हैकतरनी तनाव की विभिन्न दरों के तहत समुच्चय के रूप में करने के लिए कुछ कोशिकाओं के ency है. उदाहरण के लिए, 3 डी डिवाइस में कुल गठन से गुजरना है कि चिकित्सकीय कोशिकाओं नसों में प्रशासन के बाद फार्म clumps और इन विवो (गोंचारोवा एट अल., अप्रकाशित टिप्पणियों) में तीव्र संवहनी रुकावट पैदा करने के लिए एक बड़ा प्रवृत्ति हो सकता है. कुल गठन 3 डी डिवाइस के प्रयोग के पूरा होने के दौरान या बाद में कोशिकाओं परीक्षण नमूना द्वारा माइक्रोस्कोप से नजर रखी जा सकता है.
Disclosures
झरना जीव विज्ञान इंक "प्रवाह की स्थिति और उसके उपयोग के लिए विधियों के तहत इन विट्रो सेल प्रवास में मूल्यांकन के लिए उपकरण" पेटेंट नहीं अमेरिका 7927867 बी 2 के लिए विशेष अधिकारों के पास. SKK 3 डी प्रवाह चैम्बर उपकरण प्रौद्योगिकी के एक आविष्कारक और झरना जीव विज्ञान इंक के सह संस्थापक वैज्ञानिक और शेयरधारक है
Acknowledgments
हम सीबीएस वैज्ञानिक कंपनी इंक (से चक स्कॉट और विक्टर McKnight धन्यवाद www.cbsscientific.com इंजीनियरिंग सहायता और 3 डी चैम्बर, गैस विनिमय इकाई, और आवेषण के निर्माण के लिए). इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (अनुदान R21DK067084 और R43CA141782 को SKK) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| PVC tubing (bore 1.42, wall 0.8) | Watson-Marlow Limitid | 981.0142.000 | |
| 3D Chamber | C.B.S.Scientific | FC-1000 | |
| Gas exchange unit | C.B.S.Scientific | FCR-1000 | |
| Inserts | C.B.S.Scientific | FCI-1005U | |
| Collagen Bovine,Type I | BD Biosciences | 354231 | |
| Hydrochloric Acid 0.1M | VWR | BDH3200-1 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| HUVEC | Lonza | CC- 2517 | |
| EGM Bullet Kit (cc - 3121 & cc - 4133) | Lonza | CC - 3124 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin | Lonza | CC-5012 | |
| HEPES | Lonza | CC-5024 | |
| SDF-1 | R7D System | 460-SD | |
| Extracel Trial 2.5 Kit | Glycosam Byosystems | GS211 | |
| Fibronectin, human , nature | BD Biosciences | 356008 | |
| Poly-D-lysine | Millipore | A-003-E | |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ScienCell | 1000 | |
| Endotelial Cell Medium (ECM) for brain cells | ScienCell | 1001 | |
| Trypan Blue | StemCells Tecnologies | 7050 | |
| TNF-alfa, 10 μg | Invitrogen | PHC3015 | |
| VCAM-1, mouse anti-human, CD106-FITC | Southern Bioteck | 9519-02 | |
| Propidium Iodide Staining Solutuion | BD Pharmingen | # 556463 | |
| Frozen Human Cord Blood CD34+ cells | StemCell | CB007F | |
| Frozen Human Cord Blood CD34+ cells | Zenbio | SER - CD34-F | |
| MethoCult GF M3434 | StemCells Tecnologies | GFM3434 | |
| Mouse Methylcellulose complete media | R&D | HSC007 | |
| Anti-Von Willibrand Factor antibody | abcam | C# ab11713 | |
| Petry dish (35 x 10 mm) | VWR | CA25373-041 | |
| 15 ml tubes | VWR Fisher | 21008 - 918 | |
| Tissue culture flasks 75cm2 | VWR | BD353136 | |
| Cristal violet | Sigma | C-3886-25G | |
| Dissecting forceps, curved | VWR | 82027-384 | |
| 1,000 μl Pipette tips | VWR | 83007-380 | |
| 1 - 200 μl Pipette tips | VWR | 37001-530 | |
| Equipment | |||
| Peristaltic pump | Watson-Marlow Limitid | 403U/VM3 | |
References
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