Summary
En qPCR assay blev udviklet til påvisning af Escherichia coli O157: H7 rettet mod en unik genetisk markør, Z3276. QPCR blev kombineret med propidium monoazide (PMA) behandling til påvisning levende celle. Denne protokol er blevet modificeret og tilpasset til en 96-brønds plade format for nem og ensartet håndtering af talrige prøver
Abstract
En unik åben læseramme (ORF) Z3276 blev identificeret som en specifik genetisk markør for E. coli O157: H7. En qPCR assay blev udviklet til påvisning af E. coli O157: H7 ved at målrette ORF Z3276. Med dette assay kan vi registrerer så lav som nogle få kopier af genom DNA fra E. coli O157: H7. Følsomheden og specificiteten af assayet blev bekræftet ved intensive valideringstests med et stort antal E. coli O157: H7 stammer (n = 369) og ikke-O157 stammer (n = 112). Desuden har vi propidium monoazide (PMA) procedure kombineret med den nyudviklede qPCR protokol til selektiv detektering af levende celler fra døde celler. Amplifikation af DNA fra PMA-behandlede døde celler blev næsten fuldstændig hæmmet i modsætning til stort set upåvirket amplifikation af DNA fra PMA-behandlede levende celler. Derudover er protokollen blevet modificeret og tilpasset til en 96-brønds plade format for en let og ensartet håndtering af et stort antal prøver. Tventes hans metode til at have en indvirkning på nøjagtige mikrobiologiske og epidemiologiske overvågning af fødevaresikkerhed og miljømæssig kilde.
Introduction
PCR er en almindelig metode til påvisning af E. coli O157: H7 fra fødevarer og miljøprøver. Identificere specifikke biomarkører for E. coli O157: H7 er en af de vigtigste faktorer for en vellykket detektion i PCR-analyser. Biomarkører, der almindeligvis anvendes i PCR-assays til påvisning af E. coli O157: H7 er bl.a. Shiga toksiner (STX 1 og STX 2) 1,2, uidA 3,4, EAEA 5,6, rfbE 7 og FLIC gener 8,9. Disse biomarkører kan give variabel effektivitet til identifikation, men de fleste af de biomarkører, ikke kan anvendes som en enestående biomarkør til påvisning af E. coli O157: H7. Denne utilstrækkelighed i differentiering magt target gener kræver mere specifik og stærkere biomarkør (er) til identifikation af E. coli O157: H7 10.
Talrige prober for gener eller hypotetiske åbne læserammer (ORF'er) i E. coliO157: H7 11 blev designet til qPCR assay baseret på spor fra DNA genotypebestemmelse microarrays fra vores laboratorium, og ved at søge i GenBank af National Center for Biotechnology Information. Sekvensen af Z3276 ORF, som er en fimbrial gen 11 blev udvalgt til qPCR assay. Efterfølgende blev en qPCR assay udviklet gennem talrige forsøg på PCR parametre, såsom koncentration af primere og prober samt annealing og forlængelse temperaturer (data ikke vist). Efter incitament inklusivitet og eksklusivitet test på referencestammer såsom E. coli O157: H7, ikke-O157 og Shigella stammer i qPCR blev ORF Z3276 identificeret som en specifik og stærk genetisk markør til identifikation af E. coli O157: H7. Så udvikler vi en ny qPCR metode at anvende denne unikke biomarkør for identifikation af E. coli O157: H7.
En anden udfordring i påvisning af E. coli O157: H7 i forurenet fometoder og miljø er nøjagtig bestemmelse af levende celler fra prøver. Det forlængede tilstedeværelse af DNA fra døde celler og manglende evne til at skelne levedygtighed i PCR-analyse kan give falsk-positive aflæsninger, hvilket resulterer i overvurdering af levende celletal i afsløring. Derfor er dette begrænser PCR forbrug i nøjagtig påvisning af fødevarebårne patogener 12. En ny tilgang til at skelne DNA af de døde celler er taget ved at kombinere propidium monoazide (PMA) behandling med PCR-metoden i de sidste par år 13-15. PMA er i stand til at gå ind af døde celler, og indskyde ind i DNA, når de udsættes for lys, men det kan ikke gå inde i levende celler til at reagere med DNA i levende celler. Således i PMA behandlet blandinger af levende og døde celler, DNA af døde celler kan ikke amplificeret i PCR 13. Vi kombineret PMA-behandling med den nyudviklede qPCR assay til selektivt at påvise levende E. coli O157: H7-celler. Derudover har vi gjort PMA-qPCR assay muligt for high throughput detektion.
Protocol
1.. Bakteriestammer og DNA Template Preparation
- Grow bakteriestammer E. coli O157: H7, ikke-O157 og andre patogene arter, såsom Salmonella og Shigella ved 37 ° C natten over under omrystning.
- Uddrag DNA fra bakterielle kulturer ved hjælp af passende sæt (se tabel af materialer) og følge producentens instruktioner.
- Måle optisk densitet (OD 260) for at bestemme DNA-koncentrationer ved anvendelse af et spektrofotometer.
2. Primer og Probe Design for qPCR Assay
- E. coli O157: H7 sekvenser fra GenBank accession nummer AE00517411. Design primere og probe anvendelse af passende software til primer og probe design for real-time PCR (se materialer tabel for detaljer).
Sekvenserne for primere og probe er som følger: Z3276-Frem (F) 5'-TATTCCGCGATGCTTGTTTTT-3 '
Z3276-Reverse (R) 5'-ATTATCTCACCAGCAAACTGGCGG-3 '
Z3276-Probe, FAM-CCGCAATCTTTCC-MGBNFQ - Opløs primeren pulveret med vand, hvilket resulterer i en koncentration på 10 uM som en primer arbejde løsning.
- Fortynd prober til 10 uM som probe arbejde løsninger. Mærkede prober varierer i styrke med partier. Derfor titreres hver batch af mærkede prober før brug for optimal qPCR ydeevne.
3. Indstilling af qPCR assaybetingelserne
- Forbered reaktionsblandingen, som består af 25,0 pi 2x real-time PCR masterblanding, 200 nM forward primer, 200 nM revers primer, og 100 nM probe.
- Tilsæt 5 ul prøve-DNA (100 pg), og en passende mængde vand for at nå et endeligt volumen på 50 ul.
- For nontemplate kontrol, anvende 5 ul vand til at erstatte DNA-prøve.
- Indstil qPCR betingelser som følger: 95 ° C i 10 min for aktivering af TaqMan, efterfulgt af 40 cykler af 95 ° C i 10 sek denaturering og 60 &# 176; C i 1 min for annealing / forlængelse.
4.. qPCR Følsomhed Test
- Foretag en seriel 10 ganges fortynding fra en kultur af midt-eksponentielle fase (OD600 = 0,5, omkring 1,5 x 10 8 CFU / ml ved udpladning).
- Der tilsættes 100 ml celle fortyndinger på en 96-brønds plade in triplo.
- Centrifugeres pladen ved 2500 xg i 10 min.
- Der tilsættes 50 ml af DNA-ekstraktion til hver brønd.
- Resuspender cellepellets med en multi-kanal pipette.
- Forsegle pladen med en film, koges pladen i et vandbad i 10 minutter og centrifugeres ved 2500 xg i 2 min.
5.. Forberedelse levende og døde celleblandinger til PMA-behandling
- Grow 10 ml E. coli O157: H7 ved 37 ° C til midt-eksponentielle fase og dele kulturen i to alikvoter.
- Kog en alikvot af celler i 10 minutter i et vandbad for døde celler, og lade den anden portion for levende celler.
- Kontroller, atre er levende celler fra varmedræbte alikvot ved udpladning af cellerne på LB-agarplader.
- 2 ml af de levende og varme-dræbte celler og justere koncentrationen til 8 x 10 6 CFU / ml med LB-medium. Opret fire sæt celle fortyndinger spænder fra 8 x 10 0 til 8 x 10. 6 CFU / ml.
- Brug de to første sæt celle fortyndinger for levende celler behandlet med PMA eller ubehandlet.
- Til tredje og fjerde sæt celle fortyndinger tilsættes 8 x 10 6 døde celler til hver celle fortynding (8 x 10 0 - 8 x 10 6) for at gøre levende og døde celleblandinger.
- Behandl det tredje sæt af fortynding med PMA og den fjerde sæt af fortynding til kontrol.
6.. Behandling af celler med PMA
- Opløs PMA i dimethylsulfoxid (eller vand) for at 10 mM stamopløsning og opbevares ved -20 ° C i mørke.
- Aliquot 400 pi af de levende celler, døde celler, og blandingen af levende og døde celler itre separate mikrorør.
- Tilsæt 2,0 ml 10 mM PMA til hver celle portion til en endelig koncentration på 50 uM.
- Inkuberes prøverne ved stuetemperatur i 5 minutter i mørke ved omrystning et par gange, 3 sek hver gang.
- Tilsæt 100 pi af prøverne på en 96-brønds plade.
- Forsegl pladen med en optisk film og sætte pladen på is.
- Pladen anbringes 20 cm fra en 650 W halogen lyskilde og udsættes i 2 min for lys.
- Centrifugeres pladen ved 2500 xg i 10 minutter, forsigtigt supernatanten og omhyggeligt dræne pladen på et stykke absorberende papir.
- Resuspender cellepellets i 50 pi DNA-ekstraktion løsning ved pipettering op og ned tyve gange med en multi-kanal Pipetman.
- Forsegle pladen med en film, koges i 10 minutter i et vandbad, og der centrifugeres ved 2500 xg i 2 min. Supernatanten i pladen er DNA fra celler behandlet med PMA og klar til qPCR.
- Udfør qPCR som beskreseng ovenfor under anvendelse af 5 pi af DNA.
Representative Results
Påvisning af E. coli O157: H7 ved qPCR hjælp ORF Z3276
En af de vigtigste faktorer i denne analyse er følsomhed og specificitet Z3276 sonde, der anvendes i qPCR. Det kan detektere så lav som nogle få kopier af genom DNA fra E. coli O157: H7, som vist i figur 1A. Af de 120 ikke-O157 stammer undersøges, herunder seks store non-O157 Stec stammer, O104: H4-stammer, Salmonella og Shigella-stammer, blev ingen krydsreaktivitet fundet, som vist i tabel 1.
Kombinationen af PMA-behandling med qPCR
Inkubering E. coli O157: H7-celler med PMA (50 mM) i 5 minutter i mørke og udsættelse for lys i 2 min blev udvalgt til PMA behandlingsbetingelser. Derudover modificerede vi PMA-behandling procedure. Sammenlignet med forskellige gennemsigtige mikrorør anvendes i tværbindingstrin blev en 96-brønds plade sig at være mere effektivt atnå den optimale tværbindende virkning og mere bekvem end at håndtere et stort antal prøveglas under lyseksponering processen.
Amplifikation af DNA fra PMA-behandlede levende og døde celler i qPCR
Virkningerne af PMA-medieret inhibering af amplifikation af DNA'et fra døde celler på denne qPCR assay er vist i figur 1 ved hjælp af DNA afledt fra to serielle 10-fold levende eller døde celle fortyndinger. Resultaterne viser, at de kurver, der genereres fra de levende celler behandlet med PMA (rød kurve) og uden PMA (blå kurve) synes lineære og næsten identisk med hinanden. Små forskelle CT værdi blev vist mellem de levende celler behandlet med PMA og uden PMA (figur 1A), hvilket antyder, at PMA-behandling havde ringe virkning på amplifikation af DNA i levende celler i qPCR. Men en 15 - CT værdi forskel (32,000 gange) blev vist mellem de døde celler behandlet med PMA og uden PMA, demonstrating at PMA-behandling effektivt undertrykt DNA-forstærkning fra de døde celler (Figur 1B).
Påvisning af levende celler fra levende og døde celleblandinger i qPCR
To sæt af levende celle fortyndinger (8 x 10 0 - 8 x 10 6 CFU) blev behandlet med PMA eller uden PMA at detektere levende celler fra levende / døde celleblandinger. QPCR resultater (figur 2a) viste en parallel omvendt progressiv tendens i CT-værdier i relation til antallet af behandlede levende celler (lilla søjler) til de ubehandlede prøver (blå søjler). De behandlede levende celler gav en noget højere CT-værdier end de ubehandlede levende celler. En lignende invers progressiv tendens i CT-værdier blev observeret med det reelle antal levende celler i levende / døde celleblandinger behandlet med PMA (grønne søjler) samt i figur 2B. Desuden giver denne nedadgående tendens i CT-værdier varobserveret med antallet af levende celler i blandingerne på trods af tilstedeværelsen af 106 døde celler. Disse resultater viste, at CT-værdier for live / dead celleblandinger repræsenterede DNA'et fra de levende celler alene, mens DNA-amplifikation fra de døde celler effektivt blev undertrykt ved PMA-behandling. Men CT-værdier af levende / døde celleblandinger behandlet med PMA blev svinget og undlod at afspejlede levende celletal i blandinger i figur 2B (gule søjler).
Figur 1. Levende og døde celler behandlet med PMA eller uden PMA i qPCR assay. (A) en serie af 10-fold fortyndet levende E. coli O157: H7 celle fortyndinger (8 x 10 0 - 8 x 10 6 CFU) blev behandlet med PMA eller uden PMA.De CT-værdier repræsenterer de gennemsnitlige CT værdierne af triplikater i qPCR assay. (B) Sammenligning af DNA-amplifikation af levende celler og døde celler behandlet med PMA og uden PMA i q sammenligning qPCR assay. ΔRn refererer til fluorescensintensitet forandring. Klik her for at se større billede.
Figur 2. Differentiering af levende celler fra levende / døde celleblandinger ved PMA-qPCR Fire sæt af 10-folds fortyndinger af cellekulturer (8 x 10 0 - 8 x 10 6 CFU). Blev foretaget som vist. (A) Første sæt celle fortynding blev behandlet med PMA mens den anden celle fortynding var eller ubehandlet før DNA-ekstraktion.(B) 8 x 10 6 døde celler blev blandet med det tredje og fjerde sæt af celle fortyndinger til at gøre to sæt levende / døde celleblandinger som angivet. Et sæt af de celleblandinger blev behandlet med PMA og det andet sæt blev behandlet uden PMA før DNA-ekstraktion. Hver søjle repræsenterer de gennemsnitlige Ct-værdier for et tredobbelt eksperiment ± SD.
| Organisme | Serotype | Antal testede stammer |
| E. coli | 2006 spinat O157: H7 udbrud isolater | 186 |
| 2006 Taco Bell O157: H7 | 58 | |
| 2006 Taco John O157: H7 | 11 | |
| DMB strain samlinger fra andre O157: H7 udbrud | 112 | |
| O104: H4 | 3 | |
| O26 | 18 | |
| O103 | 13 | |
| O111 | 24 | |
| O121 | 2 | |
| O45 | 5. | |
| O145 | 9 | |
| O113 | 2 | |
| O91 | 1 | |
| O55 | 9 | |
| Andet | 19 | |
| Salmonella | Typhi | 1 |
| Newport | 2 | |
| Shigella dysenteriae | 6 | 2 |
| Shigella sonnei | Ukendt | 2 |
| Shigella flexneri | 4. | 1 |
| Shigella boydii | 1 | 1 |
| Samlet | 481 | |
Tstand 1. stammer, der anvendes til validering i real-time PCR-analyse til identifikation af E. coli O157: H7.
Discussion
En primære formål med studiet indebærer brug af en ORF Z3276, en unik E. coli O157: H7, som eneste biomarkør for qPCR assay. På nuværende tidspunkt er de fleste qPCR målrettet virulens gener, såsom stx1, stx2 og EAEA 1,2,5,6 eller fælles fænotypiske gener, såsom uidA 3,4, rfbE og FLIC gener 8,9. Lejlighedsvis, en art eller stamme kan ikke endeligt identificeret ved virulens gen (er), såsom stx 1og stx 2 gener, idet disse gener er til stede i forskellige arter eller stammer 16 såvel. Brug rfbE og FLIC for målgener, er der behov for begge gener skal anvendes til fuldstændig identifikation 17. Brug ORF Z3276 som biomarkør, har dette qPCR analyse vist sig at være følsom og specifik analyse (tabel 1). Denne analyse har været udsat for strenge inklusivitet og eksklusivitet tests, herunder O157: H7 stammer (n = 367), over 100 ikke-O157 stammer og andre patogene arter, såsom Salmonella og Shigella. Alle O157: H7 stammer undersøgte var positivt opdaget, og ingen krydsreaktivitet blev fundet af de ikke-O157 stammer (tabel 1), hvilket indikerer, at ORF Z3276 er en unik og stærk biomarkør til detektion af E. coli O157: H7.
Det andet formål med undersøgelsen er at selektivt detektere levende celler fra døde celler ved PMA-behandling før DNA-ekstraktion. PMA kan trænge ind i de døde celler med kompromitteret membran og bindes til DNA, og derved hæmmer DNA-amplifikation af døde celler i PCR 13. Vi har modificeret procedure PMA-behandling og tilpasset den til en 96-brønds plade format for proceduren. Den rette intensitet lyseksponering er vigtigt at opnå den optimale tværbinding virkning. Tidligere har mikrorør blevet anvendt i dette trin 13-15. Det er imidlertid vanskeligt at håndtere separate mikrorør i lyset exponeringen skridt, og disse rør ikke er helt gennemsigtigt til at opnå den bedste cross-smag. Ved hjælp af en 96-brønds plade, vi forbedret effektiviteten af PMA-behandling. Disse ændringer kan påvirke analysen på flere måder: de gør det lettere at opnå en grundig og ensartet tværbinding virkninger, navnlig med talrige prøver de behandlede prøver kan flyttes fra én plade til en anden for at gøre det muligt for påvisning af et stort antal af prøver og de giver denne PMA-qPCR assay med automatisering potentiale for hele processen. Begrænsningen af dette PMA-qPCR assay er, at PMA-behandling øger PCR-assay omkostninger noget og let nedsat følsomhed af PCR-assay.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker det amerikanske Department of Homeland Security til at give en del af finansieringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB 7900HT Fast Real-time PCR system | ABI | ||
| 2x Universal master mix | ABI | 4304437 | |
| PrepMan Ultra | ABI | 4318930 | |
| Primer Express | ABI | ||
| Probes | ABI | Top of Form | |
| PMA | Biodium | 40013 | |
| Puregen cell and tissue kit | Qiagene | ||
| DU530 spectrophotometer | Beckman | ||
| Spectrophotometer | NanoDrop Technology | ND-1000 | |
| 650 W Halogen light source | Britek | H8061S | |
| Otptical Adhesive film | ABI | 4311971 | |
| Optical 96-well reaction plate | ABI | 4316813 |
References
- Barletta, F., et al. Validation of five-colony pool analysis using multiplex real-time PCR for detection of diarrheagenic Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 47, 1915-1917 (2009).
- Gannon, V. P., King, R. K., Kim, J. Y., Thomas, E. J. Rapid and sensitive method for detection of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 3809-3815 (1992).
- Cebula, T. A., Payne, W. L., Feng, P. Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their Shiga-like toxin type by mismatch amplification mutation assay-multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 33, 248-250 (1995).
- Li, Y., Mustapha, A. Simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella in apple cider and produce by a multiplex PCR. J. Food. Prot. 67, 27-33 (2004).
- Schmidt, H., et al. Differentiation in virulence patterns of Escherichia coli possessing eae genes. Med. Microbiol. Immunol. 183, 23-31 (1994).
- Fratamico, P. M., Sackitey, S. K., Wiedmann, M., Deng, M. Y. Detection of Escherichia coli O157:H7 by multiple PCR. J. Clin. Microbiol. 33, 2188-2191 (1995).
- Desmarchelier, P. M., Bilge, S. S., Fegan, N., Mills, L., Vary, J. C., Tarr, P. I. A PCR specific for Escherichia coli O157 based on the rfb locus encoding O157 lipopolysaccharide. J. Clin. Microbiol. 36, 1801-1804 (1998).
- Fields, P. I., Blom, K., Hughes, H. J., Helsel, L. O., Feng, P., Swaminathan, B. Molecular characterization of the gene encoding H antigen in Escherichia coli and development of a PCR-restriction fragment length polymorphism test for identification of E. coli O157:H7 and O157:NM. J. Clin. Microbiol. 35, 1066-1070 (1997).
- Fricker, M., Messelhäußer, U., Bushch, U., Scherer, S., Ehling-Schulz, M. Diagnostic real-time PCR assays for detection of emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food-borne outbreaks. Appl. Environ. Microbiol. 73, 1892-1898 (2007).
- Li, B., Chen, J. Q. Real-time PCR methodology for selective detection of viable Escherichia coli O157:H7 cells by targeting Z3276 as a genetic marker. Appl Environ. Microbiol. 78, 5297-5304 (2012).
- Perna, N. T., et al. Genome sequence of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Nature. 409, 529-533 (2001).
- Wang, S., Levin, R. E. Discrimination of viable Vibrio vulnificus cells from dead cells in real-time PCR. J. Microbiol. Methods. 64, 1-8 (2006).
- Nocker, A., Cheung, C. Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. J. Microbiol. Methods. 67, 310-320 (2006).
- Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5111-5117 (2007).
- Cawthorn, D. M., Witthuhn, R. C. Selective PCR detection of viable Enterobacter sakazakii cells utilizing propidium monoazide or ethidium bromide monoazide. J. Appl. Microbiol. 105, 1178-1185 (2008).
- Chassagne, L., Pradel, N., Robin, F., Livrelli, V., Bonnet, R., Delmas, J. Detection of stx1, stx2, and eae genes of enterohemorrhagic Escherichia coli using SYBR Green in a real-time polymerase chain reaction. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 64, 98-101 (2009).
- Liu, Y., Gilchrist, A., Zhang, J., Li, X. F. Detection of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 bacteria in drinking water and river water. Appl. Environ. Microbiol. 74, 1502-1507 (2008).
