Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Долгосрочная Хронический

23.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51019

⸱

17 марта 2014 г.

 ,  ,  , 
1Infections and Cystic Fibrosis Unit, Division of Immunology, Transplantation and Infectious Diseases, San Raffaele Scientific Institute, 2Italian Cystic Fibrosis Research Foundation

В этой статье

Краткое содержание

Мы опишем метод агар-бусы установить постоянный долгосрочный хронический синегнойной палочки инфекции дыхательных путей в модели мыши.

Аннотация

Мышиная модель хронической инфекции дыхательных путей является ключевым активом в Муковисцидоз (МВ) исследования, хотя есть ряд проблем, касающихся самой модели. Ранние фазы воспаления и инфекции широко изучаются с помощью модели агар-бусы мыши синегнойной палочки, а только несколько сообщений были направлены на долгосрочной хронической инфекции в естественных условиях. Основная задача для долгосрочного хронической инфекции остается низкое содержание бактерий бремя по P. палочки и низкий процент инфицированных мышей недель после заражения, указывая, что бактериальные клетки постепенно очищается хозяина.

Эта статья представляет собой способ получения эффективного долгосрочного хронической инфекции у мышей. Этот метод основан на вложении P. палочки клинические штаммы в агар-бисером в пробирке, а затем введение в трахею у мышей C57Bl/6NCrl. Двустороннее инфекция легких связано с нескольEral измеримые читать-аутов в том числе потери веса, смертности, хронической инфекции и воспалительной реакции. П. клиническая штамм палочки RP73 было предпочтительнее, чем лабораторного штамма отсчета PAO1, так как это привело к сравнительно низкой смертности, более тяжелых поражений и высшего хронической инфекции. П. палочки колонизация может сохраняться в легких в течение трех месяцев. Мышиные патология легких напоминает больных МВ с распространенным хроническим легочным заболеванием.

Эта модель мышиной наиболее близко имитирует ход болезни человека и может быть использован как для исследований патогенеза и для оценки новых методов лечения.

Введение

Муковисцидоз (МВ) является генетическим заболеванием, вызывается мутациями в кистозный фиброз трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) гена. Этот ген кодирует для канала хлорида экспрессируется на мембране большинства эпителиальных клеток. Бронхоэктазы, слизь закупорка и паренхимы Разрушения, вызванные, главным образом, синегнойной палочки инфекций постепенно привести к тяжелым заболеванием легких и смертности в большинстве пациентов с МВ 1. Понимание патогенеза CF и дальнейшее развитие новых методов лечения полагаться на животной модели с характерными особенностями CF. Несколько мышей, генетически модифицированные для гена CFTR, были получены, но ограничения в способности этих видов резюмировать МВ-подобного заболевания легких и несколько других отклонений органов видели у пациентов с МВ были широко документированы 2.

Развитие инфекции является одним из основных проблем в CF животной модели. Литературные клрано предполагает, что хронические инфекции продолжительностью более одного месяца может быть достигнуто только, если мышам инокулировали бактерий, внедренных в иммобилизирующей агентом, таким как агар, агароза, альгинат или водорослей 3-5. Эти смирительные агенты обеспечивают микроаэробных / анаэробные условия, которые позволяют бактериям расти в виде микроколоний, аналогично росту в слизи у пациентов с МВ 6. Эта модель хронической инфекции приводит к персистенции бактерий в легких, вызывая воспаление дыхательных путей и повреждение 7. Однако, в зависимости от используемого метода, бактериального штамма и дозы инокулированных в легких, процент хронических инфицированных мышей и бактериальная нагрузка восстановлены в легких в различные моменты времени могут значительно отличаться. В частности, основной задачей для долгосрочного хронической инфекции остается низкое содержание бактерий бремя по P. палочки и низкий процент зараженных мышей недель после заражения, что свидетельствует тхат бактериальные клетки постепенно очищается хозяина. Выбрав P. палочки RP73 клиническая штамм из коллекции CF изолирует 8 мы успешно получили низкую смертность, более серьезные повреждения, и высокий процент хронической инфекции со стабильным бактериальной нагрузки до одного месяца у мышей C57Bl/6NCrl.

Эта статья детализирует методологию внедрения P. палочки в чашках с бисером; мы заразили мышей на введение в трахею, измеряется бактериальной нагрузки и цитокины в легких, собранные БАЛ и выполняется гистологическое исследование. В целом, этот протокол будет помочь исследователям в решении принципиально важных вопросов о патогенезе 8,9 и тестирования новых методов лечения против P. палочки хроническая инфекция 10,11.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка Бактерии для хронической инфекции (Три и за два дня до Mouse вызов)

  1. Выберите соответствующий P. штамм палочки для тестирования.
  2. Инокуляции петлю P. палочки из -80 ° C маточной культуры в Триптиказно соевый агар (TSA) пластины и инкубировать при 37 ° С в течение ночи.
  3. Выбрать одну колонию и инокуляции в 5 мл Trypticase Soy Broth (БСЭ) в 15 мл оснастки закрытой пробирке и инкубировали при 37 ° С в течение ночи на качалке в инкубаторе при 200 оборотах в минуту.

2. Встраивание Бактерии в агар бисер для хронической инфекции (за день до инфекции)

  1. Возьмем небольшую аликвоту ночной культуры бактерий, разбавленных 1:50 в фосфатном буферном растворе (PBS) и измеряют оптическую плотность (OD) при 600 нм.
  2. Развести ночной бактериальной культуры путем добавления 2 OD в новом оснастки ограничен пробирку, содержащую 20 мл свежей TSB.
  3. Инкубировать при 37 ° С в течение примерно 3 -4 ч войти фазы в инкубаторном шейкере при 200 оборотах в минуту, до тех пор пока в общей сложности 10-15 OD пока не будет достигнута.
  4. В то же время подготовить АСП, изготовленный из БСЭ с 1,5% агара, автоклав и уравновешивают при 50 ° С на водяной бане. Равновесие 150 мл preautoclaved тяжелых нефтепродуктов в коническую колбу при 50 ° С на водяной бане.
  5. После того, как П. палочки достигает лог-фазы, собирают бактериальные клетки центрифугированием при 2700 х г в течение 15 мин при 4 ° С и отбросить супернатант.
  6. Ресуспендируют осадок бактерий в 1 мл стерильной PBS и вихря тщательно, чтобы полностью ресуспендируют осадок.
  7. Смешайте 1 мл бактериальной суспензии с 9 мл жидкого АСП, предварительно уравновешенной при 50 ° С
  8. Добавьте 10 мл TSA-P. палочки смесь тяжелого минерального масла (предварительно нагретого при 50 ° С) и немедленно перемешивают в течение 6 мин при комнатной температуре. Перемешивание должно создавать видимое вихрь в масле.
  9. Смесь охлаждают до 4 ° С, перемешивают при минимальной зрEED в течение 35 мин (рис. 1).
  10. Поместите смесь агар-бисер-масла в льду в течение еще 20 мин.
  11. Передача агар-бусинки в 50 мл пробирки Фалкон и центрифуге при 2700 х г в течение 15 мин при 4 ° С.
  12. Точно удалить минеральное масло и промывают стерильной PBS шесть раз, как описано в стадии 2,11. После трех промывок, шарики могут быть осаждают под действием силы тяжести, а не с помощью центрифуги. После последней промывки ресуспендирования агар-бусины в 20-30 мл PBS.
  13. Возьмем аликвоты бусин (приблизительно 0,5 мл) и асептически гомогенизации.
  14. Возьмите 100 мкл гомогенизированных бисером и развести в 900 мкл стерильной PBS. Серийно разбавить 1:10 до 10 -6.
  15. Пластина серийное разведение на TSA пластин, в том числе неразведенном образце до 10 -6 и инкубировать пластин при 37 ° С.
  16. Измерить диаметр шарика использованием инвертированного оптического микроскопа в нескольких областях. Диаметр шарика должно быть между 100-200 мкм ( Рисунок 1).
  17. Храните шарики в течение ночи при 4 ° С.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Обзор агара подготовки бусы и мыши инфекции. П. палочки клетки ресуспендировали в 1 мл PBS и добавляли к 9 мл жидкой TSA (50 ° C). Эта смесь добавляют к 150 мл тяжелый минерального масла при 50 ° С в колбу и перемешивают на высокой скорости в течение 6 мин при комнатной температуре. Когда Колбу охлаждают до 4 ° С с медленным перемешиванием в течение 35 мин, агар затвердевает создания бусы, и бактерий, присутствующих в смеси встроены в агаровых шариков. Деталь агаровой шарик, содержащей бактериальные клетки показано (A). После удаления масла с нескольких стирок с использованием стерильной PBS, подвеска агар-бусины готова еили прививка в легких мышей интратрахеальный инъекции (В). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

3. Мыши Вызов с агар-шарики

Заявление по этике: Этот протокол и эксперименты следовать указаниям из ухода за животными и комитета по этике Сан-Раффаэле научно-исследовательского института.

  1. Подсчитайте количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на пластинах TSA, чтобы определить количество КОЕ / мл в суспензии агар-бисером. Развести агар-бусы стерильной PBS до 2-4 х 10 7 КОЕ / мл до достижения оптимального затравтку 1-2 х 10 6 в 50 мкл.
  2. Обезболить C57Bl/6NCr (20-22 г, 6-8 недель) самцов мышей с кетамином (50 мг / мл) и ксилазина (5 мг / мл) в 0,9% NaCl вводили в объеме 0,002 мл / г веса тела по внутрибрюшинное введение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезия считается ADEQхать, когда животное остается все еще спокойно, не отвечает на внешние раздражители, и имеет постоянную сердечных сокращений и дыхания.
  3. Наведите в положении лежа на спине. Лечить пальто мыши с 70% этанола.
  4. Защиту трахеи с помощью вертикального разреза кожи и интубировать трахею со стерильным, гибкий 22 G 0,9 мм х 25 мм IV катетер, сохраняя внимание, чтобы удалить stylette при движении вниз в трахею. Вставьте катетер не слишком глубоко в трахею. Стоп, не достигнув киль (бифуркации).
  5. Сразу взять объем 50 мкл агар шарик суспензии 1 мл шприц и присоединить его к катетеру. Аккуратно надавите на поршень шприца, позволяя шарики, чтобы имплантировать в легких. Закрыть разрез с помощью шовного клипы.
  6. Поместите животное на грелку, пока полностью проснулся.

4. Мыши Оценка

  1. Соблюдайте мышей ежедневно в течение клинических признаков, включая качество пальто, позы,передвигаться, и статус гидратации. Монитор ежедневный вес тела. Мыши, которые теряют ≥ 20% массы тела должны быть умерщвлены.
  2. Следуйте пункт 5 для сбора БАЛ (БАЛ) и очки 6 или 7 для сбора легких и анализа общей КОЕ, гистологического анализа, воспалительной реакции с точки зрения общего и дифференцированного подсчета клеток в БАЛ, анализа цитокинов и миелопероксидаза (МРО).

5. БАЛ Сбор и анализ

  1. Усыпить мышей по CO 2 ингаляции.
  2. Наведите в положении лежа на спине. Лечить пальто мыши с 70% этанола.
  3. Expose трахеи и грудной клетки по вертикальным разрезом кожи. Expose легкие за счет сокращения диафрагмы.
  4. Вставьте шовный нить под трахеи с помощью пинцета и интубация трахеи стерильным, гибкой 22 г 0,9 мм х 25 мм IV катетера. Потяните два конца шва нитью связать окtheter в трахею и узел нить вокруг трахеи.
  5. Возьмите объем 1 мл RPMI 1640 с использованием 1 мл шприц и присоединить его к катетеру. Надавите на поршень шприца, чтобы вымыть в легкие и немедленно восстановить жидкость, хранить его в 15 мл трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если цитокины должны быть проанализированы, добавить ингибиторы протеазы в RPMI 1640.
  6. Повторите этот шаг три раза в общей сложности 3 мл RPMI. Отныне хранить БАЛ на льду. Перейдите к шагу 6 для сбора и анализа легких.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратите внимание, что не все жидкости будут извлечены (2.8 максимальная мл).
  7. Для количественного определения бактерий, присутствующих в жидкости BAL, образец Небольшую аликвоту (300 мкл), серийно разбавленных 1:10 в стерильном PBS, пластину на TSA пластин и инкубировать при 37 ° С в течение ночи.
  8. Всего тотального количества клеток с использованием инвертированного света оптического микроскопа разбавление аликвоту БАЛ 1:02 с TUERK раствора в подсчета клеток камере Бюркера.
  9. Центрифуга гemaining БАЛ при 330 мкг в течение 8 мин при 4 ° С. Возьмите супернатант для ELISA анализа цитокинов, хранить его при температуре -80 ° С. Выполните шаги 5.10-5.13 для дифференциального подсчета клеток на Cytospin.
  10. Если осадок красного цвета, лизировать эритроциты ресуспендирования осадка в 250-300 мкл буфера для лизиса эритроцитов разводили 1:10 в сверхчистой дистиллированной воды в течение 3 мин. Нейтрализовать с 2 мл PBS и центрифугировать при 330 х г в течение 8 мин при 4 ° С.
  11. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в RPMI 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). Используйте объем, который обеспечит 1 х 10 6 клеток / мл, на основе общего числа клеток.
  12. Наведите микроскопа и фильтры в соответствующие слоты в Cytospin с картонных фильтров, стоящих центр Cytospin. Внесите 150 мкл каждого образца в соответствующие лунки Cytospin и центрифуги в cytocentrifuge при 300 мкг в течение 5 мин.
  13. Пятно слайды по Романовскому окрашивания с использованием коммерческого набора, в соответствии с маинструкции nufacturer и, как описано выше 12. Выполните шаги 5.14-5.17 для МПО анализа деятельности.
  14. Центрифуга оставшийся объем БАЛ при 380 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют таблетку в 250 мкл гексадецилтриметиламмония хлорида 0,5% в сверхчистой дистиллированной воды, чтобы лизировать клетки. Подвеска может быть заморожены при температуре -20 ° С в течение нескольких дней перед выполнением анализа.
  15. Центрифуга при 16000 х г в течение 30 мин при 4 ° С и супернатант используют для выполнения анализа MPO в 96-луночных планшетах, добавление образца в двух экземплярах друг необходимы хорошо и, если также соответствующие разведени образца.
  16. Добавить в каждого образца в лунки добавляли равный объем 3,3 ', 5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) в качестве субстрата для пероксидазы. Разрешить реакция пройдет в темноте в течение не менее 5 минут и до нет дальнейшее развитие в цвете.
  17. Остановить реакцию добавлением 2 H 2 SO 4 вй измерить ОП при 450 нм. Значение ОП будет прямо пропорциональна активности пероксидазы.

6. Измерение бактериальной нагрузки в легких и цитокинов анализа

  1. Сразу после сбора БАЛ, акцизные легкие от мыши, промойте их в стерильной PBS, отдельные лепестки, положить их в с круглым дном трубки с 2 мл стерильной PBS и хранить на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если цитокины должны быть проанализированы, добавить ингибиторы протеазы в PBS в пробирки.
  2. В асептических условиях гомогенизации легкие, взять небольшой аликвоту (300 мкл) из гомогената, серийно разбавленных 1:10 в PBS, пластину на TSA пластин и инкубировать при 37 ° С в течение ночи. Пожалуйста, обратите внимание, что общая дыхательных путей бактериальной нагрузки будет сумма КОЕ найденных в БАЛ и легких.
  3. Центрифуга оставшееся гомогената при 16000 х г в течение 30 мин при 4 ° С. Возьмите супернатант для ELISA анализа цитокинов, и хранить при температуре -80 ° С.

7. Гистологическое исследование

<ол>
  • Выполнение гистологический анализ только на легкие, в которых не была собрана БАЛ, чтобы сохранить аспект легких и свойства.
  • Усыпить мышь, CO 2 ингаляции.
  • Защиту грудной клетки по вертикальным разрезом кожи, подвергать легкие за счет сокращения диафрагмы.
  • Акцизные легкие, промойте их в ФБР, отделить лепестки, поместите их в пробирку, содержащую 5-10 мл 10% формалин в нейтральном буфере (4% формальдегида) и хранить при температуре 4 ° С в защищенном от света.
  • Вставить легкие в парафин, с использованием стандартных процедур.
  • Отрежьте 5 мкм толстые секции с помощью микротома.
  • Пятно слайды с гематоксилином и эозином и охватывают слайды с покровным, в соответствии со стандартными процедурами.
  • Изучите слайды с использованием инвертированного светлое микроскопа и получать изображения, подключив микроскоп с камерой.

    • Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    Когда протокол будет сделано правильно, П. палочки агар-бусины будет измерять между 100-200 мкм и может наблюдаться с перевернутой оптического микроскопа с помощью пипетки небольшой объем суспензии агар-бисером на слайде. Одиночные бактериальные клетки видны в агаровых шариков, как подробно показано на рисунке 1.

    Выбор P. палочки штамма используется в подготовке агар-бисером имеет решающее значение. Рисунок 2 и в таблице 1 ...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    Критические шаги в P. подготовка палочки-шарики и вызов мыши представлены ниже.

    Палочки штамма П. используется для мышей вызов имеет решающее значение. Смертность, хроническая инфекция или зазор может значительно отличаться в зависимости от бактериального штамма, используемого для вызов. П. клиническая штамм палочки RP73 было предпочтительнее, чем лабораторного штамма отсчета PAO1, так как это привело к сравнительно низкой смертности, бол...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

    Благодарности

    Исследования в лаборатории Bragonzi была финансируется итальянской Муковисцидоз Фонда (CFaCore) и ЕС-F7-2009-223670. Часть этой работы была проведена в перегонный куб, передовые лаборатории микроскопии и мышь гистопатология была выполнена в блоке патологической анатомии (Сан-Раффаэле Научно институт).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    Bacto Tryptic Соевый бульонBecton Dickinson211823
    Difco Agar, гранулированныйBecton Dickinson214510
    Тяжелое минеральное маслоSigma-Aldrich330760-1L
    S-(+)-Кетамина гидрохлоридSigma-AldrichK1884
    Ксилазина гидрохлоридSigma-AldrichX1251
    Шприц 1 мл 25 г 5/8 дюймов; 0,5 мм x 16 ммPIC3071250300350
    катетер 22 G 0,9 мм x 25 ммBecton Dickinson381223
    Graefe Щипцы - 0,5 мм Изогнутые наконечникиFine Science Tools11152-10
    Ножницы, радужная оболочка, 11 см, прямыеWorld Precision Instruments501758
    шовные зажимыFine Science Tools12040-01
    Шовный материал ниткиFine Science Tools18020-40
    RPMI 1640LonzaBE12-167F
    Полный коктейль ингибиторов протеазыRoche11836145001
    Fast-Read 102 Burker одноразовая камераBiosigma390497
    раствор Tuerk Fluka93770
    RBC лизис буферBiolegend420301
    Фетальная бычья сывороткаLonzaDE14-801F
    EZ цитоворонкаThermo ScientificA78710021
    предметные стекла для микроскопа Superfrost ultra plusThermo ScientificJ3800AMNZ
    Diff-Quik Романовский набор для окрашиванияMedion Diagnostics130832
    гексадецилтриметиламмония хлоридSigma-Aldrich52366-10G
    96-луночная пластина EIA/RIACostar3590
    3,3',5,5'- ТетраметилбензидинSigma-AldrichT8665-1L
    Серная кислотаSigma-Aldrich320501-1L
    10% Нейтральный буферизованный формалинBio-Optica05-01005Q
    Harris гематоксилин non PapanicolauBio-Optica05-M06004
    Эозин плюс спиртовой растворBio-Optica05-M11007
    Equipmentshakeking
    инкубаторAmerex InstrumentsSteady Shake 757
    Водяная баняGrantSUB14
    ГомогенизаторYstral
    Precision balanceKERN440-47N
    ЦитоцентрифугаThermo ScientificA78300003
    Недорогая грелка2biolLCHP
    Гомогенизационный зондYstral2366925(маленький)
    Инвертированный оптический микроскопZeissAxioplan2
    Камера (микроскоп)ZeissAxiocam MRc5
    Rotary микротомLeicaRM2255

    Ссылки

    1. Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).
    2. Bragonzi, A. Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens. IJMM. 300, 584-593 (2010).
    3. Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G. Jr, Bass, J. A. A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa. Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).
    4. Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia. Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).
    5. Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres. APMIS. 98, 203-211 (1990).
    6. Bragonzi, A., et al. Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model. J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).
    7. van Heeckeren, A. M. Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection. Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).
    8. Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM. 180, 138-145 (2009).
    9. Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A. Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection. Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press. Filloux, S., Ramos, J. L. , (2014).
    10. Moalli, F., et al. The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa. J. Immunol. 186, 5425-5534 Forthcoming.
    11. Paroni, M. Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment. J. Infect. Dis. In press, Forthcoming.
    12. Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators. Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).
    13. Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence. AJRCCM. In press, (2009).
    14. Pirone, L., et al. Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains. Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).
    15. Bragonzi, A., et al. Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response. PLoS One. 7, Forthcoming.
    16. Bianconi, I., et al. Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection. PLoS Pathog.. 7, (2011).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Больше статей

    Хроническая инфекциямышиная модельагаровые гранулыинтратрахеальное введениебронхоальвеолярный лаважпатология легкихбактериальная нагрузкавоспалительный ответмуковисцидоз
    Долгосрочная Хронический
    Связаться с нами
    Порекомендовать библиотеке

    Конфиденциальность

    Условия использования

    Политики

    © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.