Summary
Мы опишем метод агар-бусы установить постоянный долгосрочный хронический синегнойной палочки инфекции дыхательных путей в модели мыши.
Abstract
Мышиная модель хронической инфекции дыхательных путей является ключевым активом в Муковисцидоз (МВ) исследования, хотя есть ряд проблем, касающихся самой модели. Ранние фазы воспаления и инфекции широко изучаются с помощью модели агар-бусы мыши синегнойной палочки, а только несколько сообщений были направлены на долгосрочной хронической инфекции в естественных условиях. Основная задача для долгосрочного хронической инфекции остается низкое содержание бактерий бремя по P. палочки и низкий процент инфицированных мышей недель после заражения, указывая, что бактериальные клетки постепенно очищается хозяина.
Эта статья представляет собой способ получения эффективного долгосрочного хронической инфекции у мышей. Этот метод основан на вложении P. палочки клинические штаммы в агар-бисером в пробирке, а затем введение в трахею у мышей C57Bl/6NCrl. Двустороннее инфекция легких связано с нескольEral измеримые читать-аутов в том числе потери веса, смертности, хронической инфекции и воспалительной реакции. П. клиническая штамм палочки RP73 было предпочтительнее, чем лабораторного штамма отсчета PAO1, так как это привело к сравнительно низкой смертности, более тяжелых поражений и высшего хронической инфекции. П. палочки колонизация может сохраняться в легких в течение трех месяцев. Мышиные патология легких напоминает больных МВ с распространенным хроническим легочным заболеванием.
Эта модель мышиной наиболее близко имитирует ход болезни человека и может быть использован как для исследований патогенеза и для оценки новых методов лечения.
Introduction
Муковисцидоз (МВ) является генетическим заболеванием, вызывается мутациями в кистозный фиброз трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) гена. Этот ген кодирует для канала хлорида экспрессируется на мембране большинства эпителиальных клеток. Бронхоэктазы, слизь закупорка и паренхимы Разрушения, вызванные, главным образом, синегнойной палочки инфекций постепенно привести к тяжелым заболеванием легких и смертности в большинстве пациентов с МВ 1. Понимание патогенеза CF и дальнейшее развитие новых методов лечения полагаться на животной модели с характерными особенностями CF. Несколько мышей, генетически модифицированные для гена CFTR, были получены, но ограничения в способности этих видов резюмировать МВ-подобного заболевания легких и несколько других отклонений органов видели у пациентов с МВ были широко документированы 2.
Развитие инфекции является одним из основных проблем в CF животной модели. Литературные клрано предполагает, что хронические инфекции продолжительностью более одного месяца может быть достигнуто только, если мышам инокулировали бактерий, внедренных в иммобилизирующей агентом, таким как агар, агароза, альгинат или водорослей 3-5. Эти смирительные агенты обеспечивают микроаэробных / анаэробные условия, которые позволяют бактериям расти в виде микроколоний, аналогично росту в слизи у пациентов с МВ 6. Эта модель хронической инфекции приводит к персистенции бактерий в легких, вызывая воспаление дыхательных путей и повреждение 7. Однако, в зависимости от используемого метода, бактериального штамма и дозы инокулированных в легких, процент хронических инфицированных мышей и бактериальная нагрузка восстановлены в легких в различные моменты времени могут значительно отличаться. В частности, основной задачей для долгосрочного хронической инфекции остается низкое содержание бактерий бремя по P. палочки и низкий процент зараженных мышей недель после заражения, что свидетельствует тхат бактериальные клетки постепенно очищается хозяина. Выбрав P. палочки RP73 клиническая штамм из коллекции CF изолирует 8 мы успешно получили низкую смертность, более серьезные повреждения, и высокий процент хронической инфекции со стабильным бактериальной нагрузки до одного месяца у мышей C57Bl/6NCrl.
Эта статья детализирует методологию внедрения P. палочки в чашках с бисером; мы заразили мышей на введение в трахею, измеряется бактериальной нагрузки и цитокины в легких, собранные БАЛ и выполняется гистологическое исследование. В целом, этот протокол будет помочь исследователям в решении принципиально важных вопросов о патогенезе 8,9 и тестирования новых методов лечения против P. палочки хроническая инфекция 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Бактерии для хронической инфекции (Три и за два дня до Mouse вызов)
- Выберите соответствующий P. штамм палочки для тестирования.
- Инокуляции петлю P. палочки из -80 ° C маточной культуры в Триптиказно соевый агар (TSA) пластины и инкубировать при 37 ° С в течение ночи.
- Выбрать одну колонию и инокуляции в 5 мл Trypticase Soy Broth (БСЭ) в 15 мл оснастки закрытой пробирке и инкубировали при 37 ° С в течение ночи на качалке в инкубаторе при 200 оборотах в минуту.
2. Встраивание Бактерии в агар бисер для хронической инфекции (за день до инфекции)
- Возьмем небольшую аликвоту ночной культуры бактерий, разбавленных 1:50 в фосфатном буферном растворе (PBS) и измеряют оптическую плотность (OD) при 600 нм.
- Развести ночной бактериальной культуры путем добавления 2 OD в новом оснастки ограничен пробирку, содержащую 20 мл свежей TSB.
- Инкубировать при 37 ° С в течение примерно 3 -4 ч войти фазы в инкубаторном шейкере при 200 оборотах в минуту, до тех пор пока в общей сложности 10-15 OD пока не будет достигнута.
- В то же время подготовить АСП, изготовленный из БСЭ с 1,5% агара, автоклав и уравновешивают при 50 ° С на водяной бане. Равновесие 150 мл preautoclaved тяжелых нефтепродуктов в коническую колбу при 50 ° С на водяной бане.
- После того, как П. палочки достигает лог-фазы, собирают бактериальные клетки центрифугированием при 2700 х г в течение 15 мин при 4 ° С и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют осадок бактерий в 1 мл стерильной PBS и вихря тщательно, чтобы полностью ресуспендируют осадок.
- Смешайте 1 мл бактериальной суспензии с 9 мл жидкого АСП, предварительно уравновешенной при 50 ° С
- Добавьте 10 мл TSA-P. палочки смесь тяжелого минерального масла (предварительно нагретого при 50 ° С) и немедленно перемешивают в течение 6 мин при комнатной температуре. Перемешивание должно создавать видимое вихрь в масле.
- Смесь охлаждают до 4 ° С, перемешивают при минимальной зрEED в течение 35 мин (рис. 1).
- Поместите смесь агар-бисер-масла в льду в течение еще 20 мин.
- Передача агар-бусинки в 50 мл пробирки Фалкон и центрифуге при 2700 х г в течение 15 мин при 4 ° С.
- Точно удалить минеральное масло и промывают стерильной PBS шесть раз, как описано в стадии 2,11. После трех промывок, шарики могут быть осаждают под действием силы тяжести, а не с помощью центрифуги. После последней промывки ресуспендирования агар-бусины в 20-30 мл PBS.
- Возьмем аликвоты бусин (приблизительно 0,5 мл) и асептически гомогенизации.
- Возьмите 100 мкл гомогенизированных бисером и развести в 900 мкл стерильной PBS. Серийно разбавить 1:10 до 10 -6.
- Пластина серийное разведение на TSA пластин, в том числе неразведенном образце до 10 -6 и инкубировать пластин при 37 ° С.
- Измерить диаметр шарика использованием инвертированного оптического микроскопа в нескольких областях. Диаметр шарика должно быть между 100-200 мкм (
- Храните шарики в течение ночи при 4 ° С.
Рисунок 1. Обзор агара подготовки бусы и мыши инфекции. П. палочки клетки ресуспендировали в 1 мл PBS и добавляли к 9 мл жидкой TSA (50 ° C). Эта смесь добавляют к 150 мл тяжелый минерального масла при 50 ° С в колбу и перемешивают на высокой скорости в течение 6 мин при комнатной температуре. Когда Колбу охлаждают до 4 ° С с медленным перемешиванием в течение 35 мин, агар затвердевает создания бусы, и бактерий, присутствующих в смеси встроены в агаровых шариков. Деталь агаровой шарик, содержащей бактериальные клетки показано (A). После удаления масла с нескольких стирок с использованием стерильной PBS, подвеска агар-бусины готова еили прививка в легких мышей интратрахеальный инъекции (В). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
3. Мыши Вызов с агар-шарики
Заявление по этике: Этот протокол и эксперименты следовать указаниям из ухода за животными и комитета по этике Сан-Раффаэле научно-исследовательского института.
- Подсчитайте количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на пластинах TSA, чтобы определить количество КОЕ / мл в суспензии агар-бисером. Развести агар-бусы стерильной PBS до 2-4 х 10 7 КОЕ / мл до достижения оптимального затравтку 1-2 х 10 6 в 50 мкл.
- Обезболить C57Bl/6NCr (20-22 г, 6-8 недель) самцов мышей с кетамином (50 мг / мл) и ксилазина (5 мг / мл) в 0,9% NaCl вводили в объеме 0,002 мл / г веса тела по внутрибрюшинное введение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезия считается ADEQхать, когда животное остается все еще спокойно, не отвечает на внешние раздражители, и имеет постоянную сердечных сокращений и дыхания. - Наведите в положении лежа на спине. Лечить пальто мыши с 70% этанола.
- Защиту трахеи с помощью вертикального разреза кожи и интубировать трахею со стерильным, гибкий 22 G 0,9 мм х 25 мм IV катетер, сохраняя внимание, чтобы удалить stylette при движении вниз в трахею. Вставьте катетер не слишком глубоко в трахею. Стоп, не достигнув киль (бифуркации).
- Сразу взять объем 50 мкл агар шарик суспензии 1 мл шприц и присоединить его к катетеру. Аккуратно надавите на поршень шприца, позволяя шарики, чтобы имплантировать в легких. Закрыть разрез с помощью шовного клипы.
- Поместите животное на грелку, пока полностью проснулся.
4. Мыши Оценка
- Соблюдайте мышей ежедневно в течение клинических признаков, включая качество пальто, позы,передвигаться, и статус гидратации. Монитор ежедневный вес тела. Мыши, которые теряют ≥ 20% массы тела должны быть умерщвлены.
- Следуйте пункт 5 для сбора БАЛ (БАЛ) и очки 6 или 7 для сбора легких и анализа общей КОЕ, гистологического анализа, воспалительной реакции с точки зрения общего и дифференцированного подсчета клеток в БАЛ, анализа цитокинов и миелопероксидаза (МРО).
5. БАЛ Сбор и анализ
- Усыпить мышей по CO 2 ингаляции.
- Наведите в положении лежа на спине. Лечить пальто мыши с 70% этанола.
- Expose трахеи и грудной клетки по вертикальным разрезом кожи. Expose легкие за счет сокращения диафрагмы.
- Вставьте шовный нить под трахеи с помощью пинцета и интубация трахеи стерильным, гибкой 22 г 0,9 мм х 25 мм IV катетера. Потяните два конца шва нитью связать окtheter в трахею и узел нить вокруг трахеи.
- Возьмите объем 1 мл RPMI 1640 с использованием 1 мл шприц и присоединить его к катетеру. Надавите на поршень шприца, чтобы вымыть в легкие и немедленно восстановить жидкость, хранить его в 15 мл трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если цитокины должны быть проанализированы, добавить ингибиторы протеазы в RPMI 1640. - Повторите этот шаг три раза в общей сложности 3 мл RPMI. Отныне хранить БАЛ на льду. Перейдите к шагу 6 для сбора и анализа легких.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратите внимание, что не все жидкости будут извлечены (2.8 максимальная мл). - Для количественного определения бактерий, присутствующих в жидкости BAL, образец Небольшую аликвоту (300 мкл), серийно разбавленных 1:10 в стерильном PBS, пластину на TSA пластин и инкубировать при 37 ° С в течение ночи.
- Всего тотального количества клеток с использованием инвертированного света оптического микроскопа разбавление аликвоту БАЛ 1:02 с TUERK раствора в подсчета клеток камере Бюркера.
- Центрифуга гemaining БАЛ при 330 мкг в течение 8 мин при 4 ° С. Возьмите супернатант для ELISA анализа цитокинов, хранить его при температуре -80 ° С. Выполните шаги 5.10-5.13 для дифференциального подсчета клеток на Cytospin.
- Если осадок красного цвета, лизировать эритроциты ресуспендирования осадка в 250-300 мкл буфера для лизиса эритроцитов разводили 1:10 в сверхчистой дистиллированной воды в течение 3 мин. Нейтрализовать с 2 мл PBS и центрифугировать при 330 х г в течение 8 мин при 4 ° С.
- Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в RPMI 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). Используйте объем, который обеспечит 1 х 10 6 клеток / мл, на основе общего числа клеток.
- Наведите микроскопа и фильтры в соответствующие слоты в Cytospin с картонных фильтров, стоящих центр Cytospin. Внесите 150 мкл каждого образца в соответствующие лунки Cytospin и центрифуги в cytocentrifuge при 300 мкг в течение 5 мин.
- Пятно слайды по Романовскому окрашивания с использованием коммерческого набора, в соответствии с маинструкции nufacturer и, как описано выше 12. Выполните шаги 5.14-5.17 для МПО анализа деятельности.
- Центрифуга оставшийся объем БАЛ при 380 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют таблетку в 250 мкл гексадецилтриметиламмония хлорида 0,5% в сверхчистой дистиллированной воды, чтобы лизировать клетки. Подвеска может быть заморожены при температуре -20 ° С в течение нескольких дней перед выполнением анализа.
- Центрифуга при 16000 х г в течение 30 мин при 4 ° С и супернатант используют для выполнения анализа MPO в 96-луночных планшетах, добавление образца в двух экземплярах друг необходимы хорошо и, если также соответствующие разведени образца.
- Добавить в каждого образца в лунки добавляли равный объем 3,3 ', 5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) в качестве субстрата для пероксидазы. Разрешить реакция пройдет в темноте в течение не менее 5 минут и до нет дальнейшее развитие в цвете.
- Остановить реакцию добавлением 2 H 2 SO 4 вй измерить ОП при 450 нм. Значение ОП будет прямо пропорциональна активности пероксидазы.
6. Измерение бактериальной нагрузки в легких и цитокинов анализа
- Сразу после сбора БАЛ, акцизные легкие от мыши, промойте их в стерильной PBS, отдельные лепестки, положить их в с круглым дном трубки с 2 мл стерильной PBS и хранить на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если цитокины должны быть проанализированы, добавить ингибиторы протеазы в PBS в пробирки. - В асептических условиях гомогенизации легкие, взять небольшой аликвоту (300 мкл) из гомогената, серийно разбавленных 1:10 в PBS, пластину на TSA пластин и инкубировать при 37 ° С в течение ночи. Пожалуйста, обратите внимание, что общая дыхательных путей бактериальной нагрузки будет сумма КОЕ найденных в БАЛ и легких.
- Центрифуга оставшееся гомогената при 16000 х г в течение 30 мин при 4 ° С. Возьмите супернатант для ELISA анализа цитокинов, и хранить при температуре -80 ° С.
7. Гистологическое исследование
<ол>Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Когда протокол будет сделано правильно, П. палочки агар-бусины будет измерять между 100-200 мкм и может наблюдаться с перевернутой оптического микроскопа с помощью пипетки небольшой объем суспензии агар-бисером на слайде. Одиночные бактериальные клетки видны в агаровых шариков, как подробно показано на рисунке 1.
Выбор P. палочки штамма используется в подготовке агар-бисером имеет решающее значение. Рисунок 2 и в таблице 1 показывают данные, полученные после заражения мышей с P. палочки PAO1 референс-лаборатория штамм сравнению с RP73 клинического изолята. Смертность, наблюдается в течение первых 3 дней после заражения, низок для обоих штаммов, но выше для PAO1 (рис. 2А и 2В). Значительные различия в плане процента хронической инфекции в выживших мышей можно наблюдать между PAO1 и RP73 зараженных мышей. Whilе на 3 дня после заражения, все мыши были еще заражены как P. штаммы палочки, после этого момента времени некоторые мыши очищается бактерии и другие разработали стабильную хроническую инфекцию. От 7 дней годов процент хронически инфицированных мышей оставались стабильными до 28 дней для обеих штаммов. PAO1 приводит к хронической инфекции в процентах от мышей, которые варьировались от 20-27.8% (рис. 2а), в то время как для RP73 процент был 75-87.1% (2В), указывая, что P. клиническая штамм палочки был более эффективным в создании хроническую инфекцию по сравнению с лабораторным штаммом PAO1. Количество бактерий в 3-х дней после заражения были выше PAO1 (5 х 10 7 КОЕ / легких) (фиг. 2С и таблица 1) по сравнению с RP73 (1,3 × 10 6 КОЕ / легких) (рис. 2D), а затем от 7 дней года, когда была создана хроническая инфекция, бактериальная нагрузка стабилизируется на период с 10 <SUP> 4 и 10 5 КОЕ / легких для обоих штаммов. После того, как хроническая инфекция устанавливается, число КОЕ / легких существенно не меняется в течение одного месяца. Кроме того, бактериальная нагрузка в дыхательных путях одинакова среди мышей, зараженных различными штаммами бактерий 9,13.
Другие читать-аутов, в том числе принимающей воспалительной реакции и гистопатологии, могут быть измерены на различных временных точках от проблемы. Рисунок 3 показывает воспалительную реакцию в плане набора лейкоцитов в мыши БАЛ 7 дней от заражения P. клиническая штамм палочки RP73 встроен в агар-бус. RP73-инфицированных мышей по сравнению с неинфицированных мышей. Дифференциальный подсчет клеток включены нейтрофилы, макрофаги и лимфоциты. Общее количество клеток значительно выше в RP73-инфицированных мышей по сравнению с неинфицированных мышей. Нейтрофилы, в частности, почти полностью отсутствует в БАЛ не-инфицированных мышей, были наиболее Represented сотовой введите RP73-инфицированных мышей, что указывает на значительный резонанс по врожденной иммунной системы к хронической инфекции.
Гистопатологическое анализ легких мышей, хронически инфицированных P. палочки RP73, показывает, что инфекция плюри фокусным. Цифры 4C и 4F показывают одну долю, которая является более сложным, чем других долей, нечувствительных или минимальное участие (рис. 4В и 4Е). Бусины можно наблюдать в просвет бронхов и микроколонии бактериальных клеток видны в шариках (фиг. 4C и 4F). Легких гистопатология в областях, связанных с инфекцией показали воспалительные поражения в бронхах и в легочной паренхимы. Бронхов были заполнены массивной нейтрофилов воспаления окружающих шарики, в то время как паренхимы была проникли макрофагов, лимфоцитов и некоторых нейтрофилов. Гистологиянеинфицированных мышей использовали в качестве контроля; как паренхима и бронхов были очевидны из воспалительных клеток (4A и 4D).
Рисунок 2. Время курс P. палочки хроническая инфекция с эталонного штамма PAO1 и RP73 клинической штамма. C57BL/6NCrl (20-22 г) самцов мышей были инфицированы интратрахеальную инъекции с 1 до 5 × 10 6 КОЕ P. палочки штамма PAO1 (А и С) или RP73 (Б и Г), встроенные в агар-бус. Для каждой временной точке, гистограммы представляют собой процент смертности, вызванной бактериемией (красный) и выживаемости (серый) или процент животных, которые очищенную инфекцию (белый) и тех, кто может создать хроническую инфекцию (зеленый) (А и В). Выжившие мышей умерщвляли в указанных временных точках, и легкие собирали, гомогенизируют, и культивировали на АСП пластин для определения бактериальной нагрузки. Кривые роста PAO1 и RP73 штаммов в мышиных легких показаны (С и D). Точки представляют отдельных измерений и горизонтальные линии представляют средние значения. Статистическая значимость по критерию Фишера указывается: * р <0,05, ** р <0,01, *** р <0,001. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Таблица 1. Время курс P. палочкихроническая инфекция с эталонного штамма PAO1 и RP73 клинической штамма. Процент смертности и из хронической инфекции PAO1 и RP73 инфицированных мышей и числа КОЕ в легких (медиана) показаны. Значения выбираются из 2-4 различных экспериментов. Н, нет. объединенных мышей анализировали для каждого условия. Статистическая значимость по критерию Фишера указывается: * р <0,05, ** р <0,01, *** р <0,001. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 3. Оценка воспаления в БАЛ после 7 дней хронической инфекции с RP73 клинической напряжения. (А) На графике видно, содержание общеголейкоциты, нейтрофилы и моноциты / макрофаги восстановлены в БАЛ RP73 хронически инфицированных мышей после 7 дней от проблемы по сравнению с неинфицированных мышей (контроль). Представлены средние значения и SEM. (В) В поле ниже стрелки указывают нейтрофилов и макрофагов, как видно в месте на слайде после Cytospin. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 4. Гематоксилином и эозином окрашивания на гистологических срезах легких после 7 дней хронической инфекции с RP73 клинической штамма. Панель показывает гематоксилином и эозином окрашивания срезов легких неинфицированных мышей (A и D) и мышей CHALLENGред с агар-гранулы, содержащие RP73 (B, C, E, F). Инфекция плюри фокусным и обычно включает один или несколько долей легких (C и F), а остальные не затрагиваются или косвенно участвуют (В и Е). Стрелки указывают агар бисер на хранение в просвет бронхов (б). Линии (A, B, C) 250 мкм;. Линии (D, E, F) 100 мкм Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги в P. подготовка палочки-шарики и вызов мыши представлены ниже.
Палочки штамма П. используется для мышей вызов имеет решающее значение. Смертность, хроническая инфекция или зазор может значительно отличаться в зависимости от бактериального штамма, используемого для вызов. П. клиническая штамм палочки RP73 было предпочтительнее, чем лабораторного штамма отсчета PAO1, так как это привело к сравнительно низкой смертности, более тяжелых поражений и высшего хронической инфекции. Тестирование на наркотики в доклинических исследований должны быть выполнены с P. штаммы палочки, выбранные для их высокой эффективности в установлении долгосрочного хроническую инфекцию. Это сводит к минимуму количество мышей, которые согласуются с требованиями научного обоснования и статистического анализа 10,11.
Индивидуальный П. палочки агар-шарик препараты различаются по размеру и в КОЕ / мл.Диаметр verage 150 мкм с 2 х 10 7 КОЕ / мл считается оптимальным. Размер шарика зависит от скорости перемешивания во время фазы охлаждения (шаг 2.9). Бусы перемешивают при максимальной скорости небольшие и сферической (<50 мкм) в то время как те, перемешивают очень медленно большие и аморфного (> 1 мм). Кроме того, когда конечное разведение для вызова готов, шарики с низкой бактериальной нагрузки может быть липким а с высокой бактериальной нагрузкой может быть чрезмерно разбавленный. Прививка мышей с липких шариков связано с высоким уровнем смертности из-за удушья мышей вскоре после заражения, в то время как чрезмерно разбавленных гранулы могут привести к отсутствию хронической инфекции. Оптимальный объем интратрахеального инъекции составляет 50 мкл но более высокие объемы до 100 мкл может быть внесено. Различия в смертности или хронической инфекции мышей наблюдаются редко когда прививку доза колеблется между 5 х 10 5 и 5 х 10 6 КОЕ / мышь.
Appropriatе среда для роста бактерий должно использоваться для формирования агар шариков. В этом случае, P. палочки было заложено в АСП; другие документы сообщил, что, Burkholderia cenocepacia был включен в питательном бульоне агар 14,15. Бусы Агар должны обеспечить microanaerobic среды с необходимыми питательными веществами, доступных для размножения бактерий из отдельных клеток, чтобы микроколоний 9.
Дыхательная усилия различается в зависимости от анестетика и дозы, используемой, и влияет на смертность после операции. Кетамин в дозе 0,1 мг / г веса тела andxylazine в дозе 0,01 мг / г массы тела являются оптимальный выбор. Дыхание нормально, когда мышей интубировали катетера и заметно мельче, когда мыши инокулировались P. палочки агар-бусы. В идеале, введение P. палочки агар-шарики должны быть выполнены медленно при оптимальном объеме 50 мкл. Более высокие объемы до 100 мкл может привести к более высокой смертностии большие трудности в мышей восстановления. Все мыши адекватно заражен, когда оспаривается интратрахеального хирургии.
П. палочки RP73 агар шарик-индуцированной хронической пневмонии указывает, что в этой модели инфекции плюри фокусным и обычно включает один или несколько долей легких без ущерба для всего легкого. Следовательно, оценка бактериальной нагрузки и воспалительной реакции должна осуществляться на общую легких. Анализ избирательных долей не действительные результаты. Неинфицированных группа мышей следует добавить в качестве контроля и по сравнению с зараженных мышей, чтобы обнаружить любые потенциальные аномалии в наборе клеток в БАЛ или в гистологии легких из-за загрязнений или ошибку в процедуре. Эта модель была создана в BSL-2 лаборатории со всеми персонал лаборатории должен быть обучен подходящие навыки для наблюдения мыши. Мышей наблюдали два раза в день в течение следующих параметров: пилоэрекция, отношение, Передвижения, дыхание, любопытство, заложенность секреции, холить, и обезвоживание. Мыши, которые потеряли ≥ 20% массы тела и показали доказательства тяжелой клинической картиной заболевания, такие как потрепанного пальто, бездействия, потеря аппетита, плохой передвижения или болезненной позе, умерщвляли до окончания эксперимента. Мыши, зараженные P. палочки RP73 агар-бусы показали более низкие признаки дискомфорта в течение трех дней с инфекцией по сравнению с PAO1-инфицированных мышей. После этот момент времени некоторые мыши очищается бактерии и другие разработали стабильную хроническую инфекцию, продолжительностью до 28 дней.
Мы показали, что модель хронической инфекции мы предлагаем в этой статье способен индуцировать стабильную P. палочки хроническая инфекция у мышей. Этот метод был оптимизирован для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе патогена вирулентности и иммунную защиту 8,9,16 или для тестирования на наркотики антибактериальных и противовоспалительных молекул 10,11. Тон доклинические проверка этих соединений в соответствующих моделях животных имеет важное значение для будущих терапевтических мероприятий при легочных инфекций у пациентов с МВ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Исследования в лаборатории Bragonzi была финансируется итальянской Муковисцидоз Фонда (CFaCore) и ЕС-F7-2009-223670. Часть этой работы была проведена в перегонный куб, передовые лаборатории микроскопии и мышь гистопатология была выполнена в блоке патологической анатомии (Сан-Раффаэле Научно институт).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211823 | |
| Difco Agar, granulated | Becton Dickinson | 214510 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | |
| S-(+)-Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | K1884 | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich | X1251 | |
| 1 ml Syringe 25 G 5/8 in 0.5 mm x 16 mm | PIC | 3071250300350 | |
| Catheter 22 G 0.9 mm x 25 mm | Becton Dickinson | 381223 | |
| Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Scissors, Iris, 11 cm, straight | World Precision Instruments | 501758 | |
| Suture clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Suture thread | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| Fast-Read 102 Burker disposable chamber | Biosigma | 390497 | |
| Tuerk solution | Fluka | 93770 | |
| RBC lysis buffer | Biolegend | 420301 | |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | |
| EZ cytofunnel | Thermo Scientific | A78710021 | |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo Scientific | J3800AMNZ | |
| Diff-Quik Romanowsky staining set | Medion Diagnostics | 130832 | |
| Hexadecyltrimethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | 52366-10G | |
| 96-well EIA/RIA plate | Costar | 3590 | |
| 3,3’,5,5’- Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | T8665-1L | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| 10% Neutral buffered formalin | Bio-Optica | 05-01005Q | |
| Harris hematoxylin non Papanicolau | Bio-Optica | 05-M06004 | |
| Eosin plus alcoholic solution | Bio-Optica | 05-M11007 | |
| Equipment | |||
| Shaking incubator | Amerex Instruments | Steady Shake 757 | |
| Water bath | Grant | SUB14 | |
| Homogenizer | Ystral | ||
| Precision balance | KERN | 440-47N | |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Low Cost Heating Pad | 2biol | LCHP | |
| Homogenization probe | Ystral | 2366925(small) | |
| Inverted optical microscope | Zeiss | Axioplan2 | |
| Camera (microscope) | Zeiss | Axiocam MRc5 | |
| Rotary microtome | Leica | RM2255 | |
References
- Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).
- Bragonzi, A. Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens. IJMM. 300, 584-593 (2010).
- Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G. Jr, Bass, J. A. A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa. Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).
- Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia. Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).
- Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres. APMIS. 98, 203-211 (1990).
- Bragonzi, A., et al. Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model. J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).
- van Heeckeren, A. M. Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection. Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM. 180, 138-145 (2009).
- Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A. Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection. Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press. Filloux, S., Ramos, J. L. , (2014).
- Moalli, F., et al. The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa. J. Immunol. 186, 5425-5534 Forthcoming.
- Paroni, M. Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment. J. Infect. Dis. In press, Forthcoming.
- Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators. Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence. AJRCCM. In press, (2009).
- Pirone, L., et al. Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains. Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).
- Bragonzi, A., et al. Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response. PLoS One. 7, Forthcoming.
- Bianconi, I., et al. Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection. PLoS Pathog.. 7, (2011).
