Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Beeldvorming InlC Afscheiding to Cellular Infectie Onderzoek door de bacteriële pathogenen Published: September 19, 2013 doi: 10.3791/51043
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 4, 5, 5, 1,2,3, 1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich, 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

ERRATUM NOTICE

Summary

Listeria monocytogenes is een Gram-positieve bacteriële pathogenen vaak gebruikt als een belangrijk model voor de studie van intracellulaire parasieten. Beeldvorming laat L. monocytogenes infectie fasen in het kader van kleine interfererende RNA schermen maakt de globale studie van cellulaire mechanismen vereist voor bacteriële infectie van target gastheercellen.

Abstract

Bacteriële intracellulaire pathogenen kan worden opgevat als moleculaire technieken om cellulaire signaaltransductie cascades vanwege hun vermogen om prachtig te manipuleren en te ondermijnen cel functies die nodig zijn voor de infectie van gastheer doelwitweefsels ontleden. Onder deze bacteriële pathogenen, Listeria monocytogenes is een Gram-positieve micro-organisme, dat is gebruikt als een paradigma voor intracellulaire parasitisme in de karakterisering van cellulaire immuunrespons, en die instrumentele rol heeft gespeeld bij de ontdekking van de moleculaire pathways cytoskelet en membraantransport dynamiek beheersen van. In dit artikel beschrijven we een robuuste microscopische test voor de detectie van cellulaire infectie late stadia van L. monocytogenes basis van de fluorescente labeling van InlC, een uitgescheiden bacteriële eiwit dat accumuleert in het cytoplasma van geïnfecteerde cellen, deze assay kan worden gekoppeld met geautomatiseerde high-throughput kleine interfererende RNA schermen om characterize cellulaire signaalwegen betrokken bij het up-of down-regulatie van infectie.

Introduction

De Gram positieve bacterie Listeria monocytogenes is een voedsel overgedragen pathogeen dat gastheercellen valt, verstoort de internalisatie vacuole en repliceert in het cytoplasma van gastheercellen 1. L. monocytogenes gemak van manipulatie in het laboratorium context (snelle groei, een lage toxiciteit voor gezonde personen) in verband met het voortbestaan ​​van bacteriële virulentie eigenschappen waargenomen in cellulaire en diermodellen (hemolytische activiteit, leukocytose) toegestaan ​​het eerste gebruik in de jaren 1960 als een belangrijk model voor de studie van intracellulaire parasitisme en voor de oprichting van de theoretische grondslagen van cellulaire immuniteit tegen infectie 2. In de late jaren 1980 en begin jaren 1990, de ontleding van de intracellulaire bacteriële cyclus 3 en de moleculaire karakterisatie van de belangrijkste bacteriële virulentiefactoren 4-7 voorkeur het gebruik van L. monocytogenes als een belangrijke moleculaire tool voor de manipulatie en study gastheercel functies. De aanwezigheid van avirulent (L. innocua) en virulente (L. monocytogenes) soorten in het geslacht Listeria de weg vrijgemaakt voor comparative genomic studies 8 die, samen met de recente oprichting van de volledige L. monocytogenes Transcriptome 9, ons begrip van de evolutie van L. zijn toegenomen monocytogenes als een menselijk pathogeen en als een modelsysteem voor infectie studies 10.

L. monocytogenes induceert de internalisatie in gastheercellen na interactie van de bacteriële oppervlakte-eiwitten sture en InlB met hun gastheercel receptoren E-cadherine en Met respectievelijk 11-12. Eerste-kandidaat gebaseerde studies leidden tot de identificatie van de α / β-actine catenins verbinding als een belangrijk onderdeel van de inla-invasie route 13 en de fosfoinositide 3-kinase (PI3-K) als een kritische effector van InlB- afhankelijke invasie Cascade 14-15. Proteomics en functionele assays op basis daarna kon de identificatie van nieuwe cytoskelet elementen 16 en lipide second messengers 17 vereist gastheercel invasie. Transcriptionele studies 18 en massa-spectrometrie gebaseerde kwantitatieve proteomics 19 hebben onlangs een nieuw licht werpen met betrekking tot de activering van gastheer signaleringscascades en de onderdrukking van de immuunrespons tijdens L. monocytogenes infectie. Systeembiologie aanpak gebaseerd op de inactivatie van grote sets van genen (kinomes, complete genomen) door kleine interfererende RNA (siRNA) silencing hebben onlangs nieuwe wegen geopend voor de analyse van de wereldwijde gastheer signaleringscascades in het kader van specifieke cellulaire functies, met inbegrip van fagocytose en pathogeen internalisatie 20. Genoom-brede siRNA schermen zijn eerder uitgevoerd om cellulaire cascades die nodig zijn voor infectie van L. onderzoeken monocytogenes in fagocytaire Drosophila 21-22, maar dit type analyse is niet uitgevoerd in niet-fagocytische cellen, die kritisch doelstellingen voor infectie in vivo vertegenwoordigen.

We hebben een protocol geoptimaliseerd voor de microscopische detectie van late stadia van de infectie door L. monocytogenes die geschikt is voor hoge-doorvoer siRNA studies van bacteriële binnenkomst epitheelcellen. Onze test maakt gebruik van een zeer invasieve L. monocytogenes-stam die een puntmutatie in PRFA, de belangrijkste transcriptionele regulator van L. presenteert monocytogenes virulentiefactoren 6: deze mutatie (genaamd PRFA *) maakt PRFA constitutief actief 23 en leidt tot een verhoogde expressie van de invasie eiwitten ing en InlB derhalve de voorkeur bacteriële binnenkomst in zich moeilijk geïnfecteerde niet-fagocytische cellen. De uitlezing voor infectie is gebaseerd op de detectie van de cytosolische accumulatie van de uitgescheiden bacteriële eiwitten InlC: Dit molecuuleen pleiotroop effector die bij voorkeur wordt uitgedrukt door intracytoplasmatische L. monocytogenes 9 en die participeert niet alleen in de bacteriële cel-cel verspreiding 24 maar ook moduleert gastheer immuunreacties 25. De fluorescente labeling van InlC secretie door intracellulaire bacteriën kan niet alleen duidelijk onderscheid geïnfecteerde van niet-geïnfecteerde cellen, maar vertegenwoordigt een eindpunt uitlezing die gebruikt kan worden om vervolgens ontleden infectie bij de verschillende stappen: ingang, vacuolaire ontsnappen, cytosolische bacteriële proliferatie en cel-naar-cel verspreiding. Deze microscopie protocol kan worden gekoppeld met siRNA schermen derhalve cellulaire routes betrokken bij de infectie van gastheercellen door L. bestuderen monocytogenes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van Cellulaire en bacterieculturen, Transfection Gereedschap en Primaire antilichamen

  1. Bereid een frisse agar plaat te isoleren individuele L. monocytogenes kolonies van een bacteriële glycerol voorraad (50% glycerol/50% verzadigd bacteriële vloeibare overnachtkweek) bewaard bij -80 ° C.
    1. Met een aluminium rek (bij -80 ° C gehouden) een bacteriële bevroren glycerolvoorraad, strook bacteriën op Brain Heart Infusion (BHI) agar plaat vervoeren.
    2. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 48 uur (of tot individuele bacteriële kolonies worden geïsoleerd).
    3. Bewaar deze werken plaat daarna bij 4 ° C gedurende een maximale tijd van 1 maand (het zal worden gebruikt om de vloeibare kweken zaad).
    4. In ons protocol, gebruiken we de L. monocytogenes serotype 1/2a EGDe.PrfA * stam, maar zoals weergegeven in figuur 1, de L. monocytogenes serotype 4b P14.PrfA * soort geeft vergelijkbare resultaten.
  2. HijLa ATCC CCL2 cellen worden gekweekt in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) in afwezigheid van antibiotica.
  3. Onafhankelijk pools scrambled (controle) en anti-Met siRNAs zijn zwart 384 putjes microscopie celkweek platen geladen.
    1. Verdun 160 pmol siRNA in 500 pi van RNase-vrij water en voeg 5 ul van deze oplossing per goed (uiteindelijke concentratie: 1,6 pmol).
    2. Bewaar deze plaat bij -20 ° C gedurende een periode van maximaal 1 jaar.
  4. Polyklonale konijnen antilichamen tegen het bacteriële eiwit InlC zijn verkregen door immunisatie met een InlC-GST recombinante proteïne zoals eerder 25 beschreven.

2. Reverse siRNA celtransfectie

  1. 72 uur vóór infectie brengen op kamertemperatuur een zwarte 384-wells microscopie celkweek plaat met 1,6 pmol siRNA in 5 pi van RNase-vrij water in elk putje.
  2. Centrifugeer de plaat gedurende 3 minuten bij 300RCF bij kamertemperatuur siRNA die kunnen worden afgezet op de wanden van de putjes neer te halen.
  3. Bereid kamertemperatuur DMEM aangevuld met 0,4% Lipofectamine RNAiMAX.
  4. Voeg 25 ul van de DMEM / RNAiMAX transfectiemedium aan elk putje (niet de transfectiemedium niet langer dan 20 min incuberen voordat u deze aan de siRNA).
  5. Zet de plaat heen en weer naar de siRNA transfectie mengen met de oplossing, dan houden de plaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om siRNA-Lipofectamine complexen te vormen.
  6. Wash HeLa cellen van een confluente-of sub-confluente kolf eenmaal met 10 ml 37 ° C voorverwarmde PBS.
  7. Trek HeLa-cellen door toevoeging van 1 ml 37 ° C voorverwarmde trypsine aan de celkweek kolf en incubeer gedurende 3 tot 5 minuten bij 37 ° C.
  8. Resuspendeer cellen in 10 ml 37 ° C voorverwarmde DMEM gesupplementeerd met 16% FBS.
  9. Tellen cellen en bereiden een celsuspensie van 12.000 cellen per ml in DMEM aangevuld met16% FBS.
  10. Voeg 50 ul van de celsuspensie aan elk putje in 384-wells plaat.
  11. Verplaats de plaat snel heen en weer om de cellen te verdelen en laat cellen settelen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  12. Dicht de plaat met Parafilm en bewaar deze voor 72 uur in een bevochtigde 5% CO 2-bevattende atmosfeer bij 37 ° C.

3. Cellulaire Infectie en kleuring

  1. De dag voor infectie, neem een enkele kolonie van L. monocytogenes uit de BHI agar plaat en resuspendeer in 5 ml vloeistof BHI medium in een 15 ml polystyreen buis.
  2. Incubeer overnacht bij 37 ° C in een shacking bediening om voor bacteriële groei.
  3. De dag van de infectie, was 1 ml van de overnacht L. monocytogenes cultuur door centrifugeren 2 min bij 10.600 RCF op een tafelblad centrifuge.
  4. Verwijder het supernatant (dat de uitgescheiden cytotoxine listeriolysine O bevat) en resuspendeer de pellet in 1 ml PBS (Repeat de wasstap 3 keer).
  5. Lees de bacteriële optische dichtheid bij 600 nm en schat het aantal bacteriën (OD = 1 komt overeen met 1E9 bacteriën / ml).
  6. Bereid de adequate L. monocytogenes verdunning in DMEM aangevuld met 1% FBS: met sterk invasieve stammen zoals EGDe.PrfA *, stellen we het gebruik van 5E4 bacteriën in 30 pl medium per putje (de multipliciteit van infectie wordt geschat 25 2.000 cellen).
  7. Verwijder het celkweekmedium in elk putje (80 pl) en vervangen door het toevoegen van 30 pi van de L. monocytogenes-bevattend medium.
  8. Centrifugeer de plaat bij 200 RCF gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om het infectieproces te synchroniseren.
  9. Incubeer de plaat gedurende 1 uur in een bevochtigde 5% CO2-atmosfeer bij 37 ° C op een voorverwarmd aluminium blok.
  10. Verwijder de L. monocytogenes-bevattend medium uit elk putje en voeg 30 ul van voorverwarmde DMEM gesupplementeerd met 10% FBS en40 ug / ml gentamicine extracellulaire L. doden monocytogenes.
  11. Incubeer gedurende 4 uur in een 5% CO2-atmosfeer bij 37 ° C op een voorverwarmde metalen blok.
  12. Bereid een oplossing van PBS aangevuld met 8% formaldehyde (de oplossing moet vers worden bereid zodat de monomeren formaldehyde, paraformaldehyde in plaats van de polymeren worden gebruikt).
  13. Zonder Werp het celkweekmedium, voeg 30 ul PBS aangevuld met 8% formaldehyde (eindconcentratie: 4%) en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  14. Verwijder het fixeermiddel en was de cellen driemaal met 80 pi PBS per putje (houd de cellen in een eindvolume van 80 pi PBS per well).
  15. Bereid een 1:250 verdunning van het konijn anti-InlC in PBS aangevuld met 0,2% saponine.
  16. Voeg 10 ul van het primaire antilichaam oplossing in elk putje na verwijdering van de PBS en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
  17. Gooi de primaireantilichaam-oplossing en was vier keer met 40 ul PBS per putje.
  18. Verdun de secundaire Alexa Fluor 546-gekoppelde anti-konijn-antilichaam (1:250), de DAPI oplossing (1:1,500) en phalloidin-Dy647 (1:150) in PBS aangevuld met 0,2% saponine.
  19. Voeg 10 ul van deze secundaire kleuring oplossing in elk putje en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
  20. Gooi de secundaire kleuring oplossing en was vier keer met 40 pi PBS per well (laat een eindvolume van 40 pi in elk putje en sluit de plaat).
  21. De plaat kan onmiddellijk worden afgebeeld of kan worden opgeslagen bij 4 ° C beschermd tegen licht (aluminiumfolie) voor verdere analyse.

4. Image Acquisition and Analysis

  1. Acquire beelden in drie verschillende kanalen (350 nm, 546 nm en 647 nm) met een 10X objectief gemonteerd op een geautomatiseerde microscoop (verwerven bij voorkeur 9 beelden per well).
  2. De InlC signaal kan worden gemeten met behulp van beeldanalyse software zoals CellProfiler dat automatische segmentering van kernen en cellichamen met de DAPI en de phalloidin vlekken, respectievelijk toelaat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fluorescentielabelling van cytoplasmatische InlC biedt een robuuste uitlezing voor cel infectie door L. monocytogenes, zoals in figuur 1: de centrale cel in de microfoto is sterk besmet door de stam P14.PrfA * 23 zoals kan worden waargenomen in fase contrast beeld (pijlpunten figuur 1A) en wordt bevestigd door de DAPI signaal waar individuele bacteriën duidelijk onderscheiden (Figuur 1B). De InlC kleuring (gesuperponeerd op de DAPI kleuring in figuur 1C) beschrijft hoe deze dicht afgescheiden eiwit accumuleert in het cytoplasma van geïnfecteerde cellen en maakt een ondubbelzinnige detectie van de geïnfecteerde gastheercel morfologie. Kleuring van het actine cytoskelet met fluorescerende phalloidin (figuur 1D) geeft informatie over de morfologie van de volledige geënte cellulaire monolaag en illustreert verder hoe aangrenzende niet-geïnfecteerde cellen (celkernen gemarkeerd met een asterisk) do geen InlC etikettering te geven. Het is de moeite waard te vermelden dat, omdat InlC cytosolische niveaus zijn afhankelijk van het aantal cytoplasmatische bacteriën, hebben we een correlatie tussen de InlC gedetecteerd door immunofluorescentie en het aantal L. gewezen monocytogenes per cel: zoals waargenomen in Figuur 1, naburige cellen geïnfecteerd met lage aantallen bacteriën vertonen een verminderde InlC vlekken die kunnen worden gekwantificeerd. Interessant is het ook mogelijk om, dat InlC gemakkelijk gedetecteerd in de uitsteeksels gevormd door bacteriën gevangen in het proces van cel-cel verspreiding (Figuur 1C) zoals ook waargenomen met de actine kleuring (figuur 1D). Opmerkelijk zijn bacteriën niet direct gekleurd met ons protocol maar omdat het 488 nm kanaal niet wordt gebruikt, L. monocytogenes kan worden gelabeld met behulp van een specifieke anti-bacterieel serum, anders kan GFP-expressie bacteriën als alternatief gebruikt worden.

Met behulp van imaging-analyse tools zoals thij openbare software CellProfiler (Broad Institute, www.cellprofiler.org ), is het mogelijk segment cellen en de InlC signaal in individuele geïnfecteerde cellen, die kunnen worden geraamd een infectie index voor een bepaalde experimentele conditie meten. Zoals getoond in figuur 2, de etikettering van de kernen met DAPI (figuur 2A) en het actine cytoskelet met phalloidin (figuur 2C) de vereiste voor cellulaire segmentatie-informatie: de kernen worden gebruikt als referentie-objecten voor de identificatie van afzonderlijke cellen (figuur 2B) en het cytoplasma wordt vervolgens geïdentificeerd met een spreiding functie van de kernen die rekening houdt met het cytoskelet signaal (figuur 2D). Tenslotte kan de intensiteit van de InlC signaal gekwantificeerd voor elk geïdentificeerd mobiele object (figuren 2E en 2F) het aantal te schattengeïnfecteerde cellen, door een drempel voor de InlC intensiteit die we beschouwen als negatief. De infectie index wordt berekend als het aantal geïnfecteerde cellen gedeeld door het totale aantal cellen in de populatie.

Het protocol kan worden gekoppeld met siRNA schermen om de functie van grote panelen doelmoleculen in de infectie van gastheercellen door L. onderzoeken monocytogenes. Controles zijn nodig om de efficiëntie van transfectie valideren: bijvoorbeeld siRNA gericht Kif11 is een veelgebruikte controle voor transfectie die leidt tot celdood en bijgevolg de afwezigheid van cellen aan het eind van de test is een indicatie dat transfectie efficiënt verlopen. Specifiek ingegaan op de L. monocytogenes invasieproces, siRNA inactivering van de cellulaire receptor Met in HeLa cellen leidt tot een belangrijke remming van bacteriële binnenkomst in gastheercellen en leidt tot zeer lage niveaus van InlC-positieve cellen in een geïnoculeerde cellulaire monolaag (figuur3A) in vergelijking met cellen behandeld met een scrambled siRNA (fig. 3B). De functie van kandidaat onbekende moleculen kunnen worden onderzocht met onze test met behulp van dit bekende cel molecuul als standaard.

Figuur 1
Figuur 1. Detectie van InlC etikettering in HeLa-cellen geïnfecteerd met L. monocytogenes stam P14.PrfA *. HeLa CCL2 cellen geïnfecteerd werden zoals beschreven in ons protocol verwerkt voor immunofluorescentie en afgebeeld met een 63x objectief. (A) image Fase contrast, worden meerdere P14.PrfA * bacteriën aangegeven met pijlpunten. (B) DAPI kleuring (blauw), hetzelfde individu bacteriën in (A) worden gelabeld door pijlpunten. (C) superpositie van de DAPI kleuring (blauw) en deInlC kleuring (rood), de kernen van geïnfecteerde cellen worden gemerkt met een asterisk. (D) superpositie van de InlC (rood) en actine (groen)-signalen. Bar:. 5 micrometer Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2
Figuur 2. Segmentatie analyse van HeLa-cellen geïnfecteerd met L. monocytogenes stam EGDe.PrfA *. CCL2 HeLa-cellen werden geïnfecteerd zoals beschreven in ons protocol verwerkt voor immunofluorescentie en afgebeeld met een 10X objectief. (A) DAPI signaal. (B) superpositie van de DAPI signaal (blauw) weergegeven in (A) en actine-signaal (rood) weergegeven in (C) met de segmentatie van de kernen (view vergrote inzet). (C) actine-signaal. (D) Zelfde afbeelding als (B) met de segmentatie van de cellen. (E) InlC signaal. (F) Zelfde afbeelding als (D) met superpositie van de InlC kleuring (geel). Bar:. 50 pm Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3
Figuur 3. . Variatie van de InlC labeling van cellen geïnactiveerd voor Met en controle cellen HeLa-cellen werden aanvankelijk CCL2 reverse-getransfecteerd met een pool van vier siRNAs gericht op de gastheercel receptor voldoet en 72 uur na transfectie werden cellen geïnfecteerd zoals is beschreven, verwerkt voor immunofluorescentie en beeld gebracht met behulp van een 10x-objective. (A) superpositie van de DAPI (blauw), actine (rood) en InlC (geel) in de cellen geïnactiveerd voor Met. (B) dezelfde kanalen als in (A) betreffende cellen behandeld met een scrambled siRNA controle. Bar:. 50 pm Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Verschillende parameters zijn cruciaal voor het succes van onze InlC detectie protocol, inclusief het gebruik van gezonde cellijnen weergeven van een voldoende groot cytoplasma een eenduidige detectie van de InlC signaal mogelijk. In de test geven we in dit artikel stellen we het gebruik van CCL2 HeLa-cellen, die bijzonder geschikt voor onze assay door de uitbreiding van de cytosolische ruimte zijn, andere HeLa klonen zoals HeLa-cellen Kyoto een kleiner cytoplasma maar kan worden gebruikt met onze infectieprotocol (HeLa Kyoto cellen zijn bijzonder geschikt voor segmentatie analyse, omdat de cellen niet overlappen met naburige cellen, wat vaak het geval is voor HeLa CCL2 cellen). Cellen die een zeer klein cytoplasma zoals polymorfonucleaire cellen of macrofagen worden niet aanbevolen voor gebruik in combinatie met ons protocol.

Een beperking van een beeldvormend protocol als die presenteren we hier is dat een minimale hoeveelheid cellen worden infeCTED in een bepaalde monolaag in controle omstandigheden, om het systeem te voorzien van voldoende ontbindende vermogen: anders, indien weinig cellen geïnfecteerd, wordt het moeilijk om veranderingen in infecties bepalen, vooral bij onderzoeken van de functie van potentiële moleculaire kandidaten die wordt naar infectie. Deze beperking vormt een reëel probleem bij het ​​gebruik van HeLa-cellen, die uitdrukkelijke Met als enige oppervlak receptor voor de L. monocytogenes eiwit InlB en zijn daarom slecht binnengevallen door de meeste L. monocytogenes stammen. Een alternatief is om een ​​zeer hoge multipliciteit van infectie (MOI> 100) gebruikt die het aantal invasieve bacteriën kunnen verhogen, maar ook het risico van celschade als gevolg van hogere niveaus in het celkweekmedium van de bacteriële poriënvormende toxine listeriolysine O ( LLO), die een zeer potente cytotoxische activiteit weergeeft. Alternatief is het gebruik van super-invasieve stammen zoals de EGDe.PrfA * stam die in ons protocol, Waardoor het gebruik van een lage MOI (<25) en vermindert de hoeveelheid LLO-afhankelijke cytotoxische effecten; resultaten verkregen met L. monocytogenes super-invasieve stam kan vervolgens worden gevalideerd met andere, minder virulente bacteriële stammen in andere assays (zie hieronder). Een derde alternatief is een andere cellijn die zowel E-cadherine en Met uitdrukking gebruikt: het is het geval voor cellijnen zoals de trofoblast-achtige Jeg3 of BeWo cellen of coloncarcinoom LoVo cellen, die kunnen worden aangevallen door zowel de ing-en de InlB-afhankelijke ingang paden; in deze cellijnen, hogere tarieven van cel infectie kan worden bereikt met behulp van L. monocytogenes stammen zoals EDGE, de ouderlijke stam van EGDe.PrfA *. Er moet rekening worden gehouden, kan echter redundantie functies in beide routes tot compensatie effecten in een traject bij een effector wordt geïnactiveerd in de andere weg, waardoor de analyse van de resultaten bemoeilijkt. Het is ook belangrijk om te vermelden that cellen mogen niet te-geïnfecteerde om het systeem te voorzien van een goed dynamisch bereik waardoor de detectie van gebeurtenissen die infectie verhogen: in ons bepaald protocol, onze MOI leidt tot een optimaal infectiepercentage van 30%.

Alternatieve methoden om de invasie van gastheercellen bestuderen door L. monocytogenes zijn de klassieke gentamicine invasieanalyse 26 die is gebaseerd op het doden van extracellulaire bacteriën door toevoeging van gentamicine aan het celkweekmedium na een aanloopperiode van bacteriële infectie (vergelijkbaar met die in het eerste deel van onze infectieprotocol procedure) en invasie wordt gescoord door het uitplaten de overlevende intracellulaire bacteriën op agarplaten en het tellen van het aantal kolonievormende eenheden (CFU's) die op deze platen groeien. Deze werkwijze biedt het voordeel dat de meest directe uitlezing voor infectie, het exacte aantal invasieve bacteriën die daadwerkelijk worden beschermd tegen de gentamicine treatment in de cytoplasmatische ruimte van gastheercellen, maar geeft deze werkwijze een uitlezing voor infectie en zodra de gastheercellen worden gelyseerd intracellulaire CFU vrij, er niet langer een register informatie te verkrijgen over de actuele status van cellen op het eindpunt van het experiment. Het protocol is gebaseerd op een indirecte methode, de detectie van het uitgescheiden eiwit InlC, maar zoals eerder vermeld, de niveaus van cytoplasmatische InlC correleren met het aantal cytosolische L. monocytogenes (figuur 1). Bovendien, de intrinsieke aard van onze microscopie analyse kan de precieze positie van de cellen duidelijk vast aan het einde van de infectie: we derhalve extraheren betreffende globale cellulaire morfologie, actine cytoskelet distributie fase van de celcyclus, enz. en hoge gehalte voeren analyse van de infectie. Een belangrijk kenmerk dat aan deze vorm van analyse kan worden gewonnen is de context bevolking en de invloed op infectie: Inderdaad recent werk van Pelkmans en medewerkers 27 aangetoond dat de bijzondere context populatie van een bepaalde cel (bijvoorbeeld de positie van de omtrek in een groep cellen per eilandje) op meerdere cellulaire functies, waaronder endocytose en gevoeligheid voor virusinfectie. De test dient derhalve het potentieel voor de extractie van deze gegevens.

Onze methode biedt een bijkomend voordeel: omdat InlC is een late uitlezing van infectie als gevolg van de afscheiding door cytoplasmatische bacteriën, kon gastheer signaalwegen die de niveaus van InlC accumulatie in gastheercellen mogelijk niet alleen bacteriële binnenkomst maar ook de vacuole te ontsnappen, cytosolische proliferatie en beïnvloeden uiteindelijk cel naar cel te verspreiden. Daarom kan onze methode worden gebruikt als een primaire uitlezing voor wereldwijde infectie en kan worden gekoppeld met secundaire assays voor de specifieke infectie stap die wordt verstoord door de eerste treffer die via siRNA schermen ontleden. Tenslotte is het belangrijk te vermelden dat onze methode kan worden opgeschaald en volledig geautomatiseerd met behulp plaatwasser apparaten, waardoor derhalve het aantal monsters in een enkel experiment geanalyseerd en een lager niveau van resultaten variatie vergeleken met experimenten handmatig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

We hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Onderzoek in P. Cossart laboratorium wordt ondersteund door het Instituut Pasteur, het Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, het Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233.348), de Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE- SignRupVac), de Louis-Jeantet Foundation en de Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK is een ontvanger van een beurs van het Pasteur-Paris University International Doctoral Program / Institut Carnot Maladies infectieuses. Wij danken Jason Mercer voor het optimaliseren van de cellulaire transfectieprotocol.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Brain Heart Infusion BD 237500 For liquid BHI preparation
Bacto Agar BD 214010 Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Biowest 51830-500
DMEM Invitrogen 61965-026
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-100
Gentamicin Sigma G1397-10ML
Formaldehyde (16%) EMS 15710 Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 Invitrogen A-11035
DAPI Invitrogen D-1306
Phalloidin Dy647 Dyomics 647-33
siRNA Scramble Dharmacon D-001810-10
siRNA Met Dharmacon L-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plate Corning 3985
AxioObserver Z1 microscope Zeiss 431007 9901
sCMOS camera Andor Neo
Metamorph analysis software Molecular Devices 4000
CellProfiler analysis software Broad Institute Public software available at http://www.cellprofiler.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).
  2. Mackaness, G. B. Cellular resistance to infection. Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).
  3. Tilney, L. G., Portnoy, D. A. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).
  4. Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin. Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).
  5. Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci. Cell. 65, 1127-1141 (1991).
  6. Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated. Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).
  7. Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein. Cell. 68, 521-52 (1992).
  8. Glaser, P., et al. Comparative genomics of Listeria species. Science. 294, 849-852 (2001).
  9. Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
  10. Cossart, P. Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).
  11. Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -M., Cossart, P. E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells. Cell. 84, 923-932 (1996).
  12. Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase. Cell. 103, 501-510 (2000).
  13. Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).
  14. Ireton, K., et al. A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion. Science. 274, 780-782 (1996).
  15. Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase. Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).
  16. Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes. Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).
  17. Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells. Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).
  18. Hamon, M. A., et al. Histone modifications induced by a family of bacterial toxins. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).
  19. Ribet, D., et al. Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection. Nature. 464, 1192-1195 (2010).
  20. Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416, 644-648 (2002).
  21. Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
  22. Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).
  23. Ripio, M. T., Domínguez-Bernal, G., Lara, M., Suárez, M., Vazquez-Boland, J. A. A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes. Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).
  24. Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).
  25. Gouin, E., et al. The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).
  26. Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system. Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).
  27. Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).

Tags

Immunologie HeLa-cellen Listeria monocytogenes Gram-positieve bacteriële infecties Fluorescentie high-throughput screening assays RNA interferentie Listeria monocytogenes Infectie microscopie kleine interfererende RNA

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 06/25/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020

to

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

The acknowledgments where update from:

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.

to

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

Beeldvorming InlC Afscheiding to Cellular Infectie Onderzoek door de bacteriële pathogenen<em&gt; Listeria monocytogenes</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kühbacher, A., Gouin, E.,… More

Kühbacher, A., Gouin, E., Mercer, J., Emmenlauer, M., Dehio, C., Cossart, P., Pizarro-Cerdá, J. Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (79), e51043, doi:10.3791/51043 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter